CC BY
174
УДК 615.322:582+633.88
ПРИМЕНЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДОВ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕСВЕРАТРОЛА В СУБСТАНЦИИ
Кисилёва А.Н., Стрелычева К.А., Коган Е.Г., Шаталова М.Э., Васильева О.В., Кордина О.В., Гершунина О.Ю.
Смоленский государственный медицинский университет, Россия, 214019, Смоленск, ул. Крупской, 28
[email protected] - Коган Евгений Геннадьевич
Резюме. В данной работе представлены результаты количественного определения ресвератрола в субстанции «Солгар Ресвератрол 100мг капсулы®» методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и ацетилированием с последующей алкалиметрией. Как показывают полученные результаты, содержание ресвератрола в субстанции составило 100,35±3,18%, ошибка единичного определения ВЭЖХ-методики определения субстанции ресвератрола с 95% вероятностью находилась в пределах 3,17%, что не превышает установленного в ГФ XIII издания критерия погрешности. Ключевые слова: ресвератрол, ВЭЖХ, «Солгар Ресвератрол 100мг капсулы®».
QUANTITATIVE DETERMINATION OF RESVERATROL IN SUBSTANCE BY HPLC ANALYSIS
Kisiliova A.N., Strelycheva K.A., Kogan E.G., Shatalova M.E., VasiVeva O. V., Kordina O. V., Gershynina O.Y.
Smolensk State Medical University, Russia, 214019, Smolensk, Krupskaya St., 28 Summary. This paper presents the results of quantitative determination of resveratrol in the substance "Solgar Resveratrol 100mg capsules®" with high-performance liquid chromatography and acetylation with subsequent alkalimetry. As shown by the results obtained, the content of resveratrol in the substance amounted to 100,35±3,18%, the error of a single determination of HPLC-methods for determination of the substance of resveratrol with 95% probability was at the range of 3.17%, which does not exceed GF XIII edition of the criterion error. Key words: resveratrol, HPLC, «Solgar Resveratrol 100mg capsules®».
Введение. Ресвератрол - природное биологически активное вещество из группы полифенолов, первоначально выделенное из винограда темных сортов и виноградных косточек, обладающее мощными антиканцерогенными,
гепатопротекторными,
противовоспалительными свойствами, препятствующее развитию сердечнососудистых заболеваний и их осложнений, предотвращающее преждевременное
старение организма. Было установлено, что помимо винограда, ресвератрол также получают из корней растения японский горец (Polygonum cuspidatum). Кроме того, он содержится в арахисе, какао бобах, в ягодах и некоторых других продуктах, а также в коре сосны. В природе существует две формы ресвератрола: цис- ресвератрол и транс-ресвератрол. По сравнению с цис-формой, транс-ресвератрол обладает
большей биологической активностью [2,
3].
Цель работы: сравнительный анализ алкалиметрического и
хроматографического определения
ресвератрола в субстанции «Солгар Ресвератрол 100мг капсулы®»
(производитель Solgar, США).
Методика. Хроматографические исследования проводили на приборе фирмы «Agilent Technologies 1200 Infinity» с автоматическим пробоотборником Agilent 1200, вакуумным
микродегазатором, градиентным насосом и термостатом той же серии.
Регистрацию полученных данных осуществляли с помощью двух систем детекторов: спектрофотометрического и масс-спектрометрического. Электронные спектры поглощения регистрировали с помощью спектрофотометрического
детектора с диоднои матрицей серии Agilent 1200 (диапазон длин волн от 190 до 950 нм, кювета с длиной оптического пути 10 мм; объемом 13 мкл), шаг сканирования - 2 нм [4].
Для регистрации и обработки спектральных данных и хроматограмм использовали программное обеспечение «Agilent ChemStation».
Испытания проводили с
применением стальных
хроматографических колонок, наиболее подходящей из которых оказалась: Reprosil-Pur C18-AQ 150 мм*2 мм, с размером частиц 3 дм.
Для приготовления подвижных фаз использовали растворители: воду
сверхчистую (HPLC), спирт этиловый (ч.д.а.), ацетонитрил (HPLC), уксусную кислоту (х.ч.), ортофосфорную кислоту (х.ч.).
Количественное определение
субстанции ресвератрола осуществляли в градиентном режиме элюирования. В качестве подвижной фазы (А) - 4% водный раствор кислоты фосфорной, (Б) -ацетонитрил. Элюирование проводили в следующих условиях: скорость потока: 0,25 мл/мин; температура колонки: 35°С; давление: 168 bar; детекция: 306 нм; объём вводимой пробы: 5 мл [2].
Состав подвижной фазы
программировали (таблица 1).
Таблица 1. Условия градиентного элюирования
Время, мин А, % В%
0 90 10
2 50 50
7 30 70
ресвератрола
Продолжительность анализа составила 15 минут.
Расчет количественного содержания ресвератрола проводили по площади полученного пика, которая должна соответствовать площади пика его стандарта по формуле:
где - площадь пика исследуемого вещества; Бст - площадь пика стандарта;
- разведения, мл; т - масса навески, г; Уа - объем аликвоты, мл.
Приготовление раствора
испытуемого и СО ресвератрола. Около 0,03 г (точная навеска) СО ресвератрола помещали в мерную колбу вместимостью 100,0 мл, прибавляли 80,0 мл спирта этилового 96%, перемешивали, доводили объём раствора этим же растворителем до метки и снова перемешивали. 5.0 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 50,0 мл, доводили объём раствора спиртом этиловым 96% до метки и перемешивали [1].
Приготовление раствора для проверки пригодности
хроматографической системы. 2,0 мл раствора СО ресвератрола выдерживали в течение 5,0 мин на расстоянии 10 см от УФ-ртутной лампы мощностью 250 Вт.
Проверка пригодности
хроматографической системы.
Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются следующие условия: 1) эффективность
хроматографической системы,
рассчитанная по пикам ресвератрола на хроматограммах раствора СО
ресвератрола, должна быть не менее 5000 теоретических тарелок; 2) относительное стандартное отклонение площадей пиков ресвератрола на хроматограммах испытуемого раствора и раствора СО ресвератрола должно быть: для двух параллельных хроматограмм - 0,51%; для трех - не более 1,34%; для четырех - не более 1,92%; для пяти - 2,37%; 3) коэффициент разделения пиков цис- и
транс-ресвератрола на хроматограммах раствора для проверки пригодности хроматографической системы должен быть не менее 1,8.
Определение ресвератрола методом ацетилирования. Для ацетилирования различных фенолов применяют ангидриды уксусной, пропионовой, стеариновой кислот, 3,5-динитробензольной и некоторые другие. Из этих ацетилирующих реагентов наибольшие распространение получил уксусный ангидрид. Химическая структура ресвератрола близка структуре диэтилстильбестрола, для которого в ГФ XIII издания предложена методика ацетилирования уксусным ангидридом.
Взяв ее за основу и модифицировав, мы разработали и апробировали методику для количественного анализа
ресвератрола.
Около 0,4 г препарата (точная навеска) помещали в колбу для
Количество 3,5,4'-тригидрокси-транс-стильбена рассчитывали согласно формуле:
ацетилирования емкостью 250 мл, прибавляли пипеткой 5 мл раствора уксусного ангидрида в пиридине (3 части безводного пиридина: 1 часть уксусного ангидрида), соединяли колбу с обратным холодильником и нагревали на водяной бане при температуре 70°С в течение 45 минут. Раствор охлаждали, прибавляли через холодильник 25 мл воды очищенной и через 15 минут титровали 0,5Н раствором NaOH, точку эквивалентности фиксировали по изменению окраски индикатора фенолфталеина. Параллельно проводили контрольный опыт. Разность между количеством миллилитров 0,5Н раствора натра едкого, израсходованного на титрование контрольного опыта, и исследуемого раствора пересчитывали на ресвератрол. 1 мл 0,5Н раствора NaOH соответствовал 0,038 г ресвератрола.
Титр 3,5,4'-тригидрокси-транс-стильбена в анализируемом растворе составил 0.038000г/мл.
в анализируемом
растворе
где VI - объем титранта, пошедшего на титрование контрольного опыта, мл; У2 - объем титранта, пошедшего на титрование анализируемого раствора, мл; Т - титр вещества в анализируемом растворе, г/мл; а - масса навески, взятой на титрование, г.
Результаты исследования и их обсуждение. Было проведено 7 параллельных измерений. Параллельно в аналогичных условиях измеряли 0,0004% раствор СО ресвератрола в спирте этиловом 96%. Полученные данные обрабатывали
статистически. Результаты исследования количественного определения ресвератрола в субстанции методом высокоэффективной жидкостной хроматографии представлены в таблице 2.
Таблица 2. Результаты количественного определения ресвератрола методом ВЭЖХ
№ п/п Масса навески, г Содержание ресвератрола (Х), % о AX е,%
1 0,030 101,0
2 0,033 98,6
3 0,036 103,3
4 0,038 106,4
5 0,034 97,3 1,34 3,18 3,17
6 0,036 98,7
7 0,035 97,2
Х=100,35%
Как видно из данных таблицы 2, составило 100,35±3,18%, ошибка
содержание ресвератрола в субстанции единичного определения ВЭЖХ-методики
определения субстанции ресвератрола с 95% вероятностью находилась в пределах 3,17%, что не превышает установленного в ГФ XIII издания критерия погрешности.
Как видно из данных таблицы 3, содержание ресвератрола в субстанции, с использованием метода ацетилирования с алкалиметрическим завершением,
составило 98,2±2%, ошибка единичного определения при вероятности 95% -2,05%, что не превышает предела погрешности, регламентируемого ГФ XIII издания.
Заключение. Таким образом, согласно рассмотренным методикам, для количественного определения
ресвератрола в субстанции возможно применение как метода ВЭЖХ-анализа так и метода ацетилирования с последующим алкалиметрическим титрованием.
Результаты количественного определения ресвератрола методом ацетилирования с последующим алкалиметрическим
титрованием представлены в таблице 3.
Таблица 3. Результаты количественного определения ресвератрола методом ацетилирования
№ п/п Масса навески, г Содержание ресвератрола (Х), % о АХ Е,%
1 0,4013 96,26
2 0,4057 98,84
3 0,3944 95,68
4 0,4025 99,11
5 0,4007 98,39 0,81 2,0 2,05
6 0,4017 97,04
7 0,4007 102,12
Хср=98,2%
Литература
1. Государственная фармакопея РФ, XIII издание, том. 3. - М.: Медицина, 2015. - 1292 с.
2. Моисеев Д.В. Разработка и валидация методики определения ресвератрола в Polygonum tataricum L. методом ВЭЖХ Вестник фармации №1 (55) 2012 Научные публикации // Современная медицина и фармацевтика: анализ и перспективы развития: материалы II международ. науч.-практич. конференции, Москва, 28 декабря 2011 г /М.: «Спутник+», 2012. -С.130-134.
3. Определение фитоалексина ресвератрола в местных растительных источниках / И.И. Генералов [и др.] // Достижения фундаментальной, клинической медицины и фармации: материалы 67-й науч. сессии сотрудников ун-та, Витебск, 2 - 3 февраля 2012 г / Витебск. гос. мед. ун-т; редколл.: В.П. Дейкало [и др.] - Витебск, 2012. - С.274-275.
4. Antioxidant effects of resveratrol and other stilbene derivatives on oxidative stress and NO bioavailability: Potential benefits to cardiovascular diseases / M. Frombaum [et all] // Biochimie. -2012. - V. 94. - N 2. - P. 269-276.
