CC BY
5
УДК 577.112:543.545:57.085:636.4 DOI: 10.21323/2071-2499-2019-1-54-57 Ил. 2. Библ. 14.
ПРИМЕНЕНИЕ
ПРОТЕОМНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ТИМУСА, СЕЛЕЗЕНКИ И МЕЗЕНТЕРАЛЬНЫХ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ СВИНЕЙ
Ахремко А.Г., Федулова Л.В., канд. техн. наук, Василевская Е.Р.
ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова
Ключевые слова: протеомика, тимус, селезенка, лимфатические узлы, иммунопротеом, двумерный электрофорез
Реферат
Данная работа посвящена изучению протеома иммунных органов свиньи - тимуса, селезенки, мезентеральных лимфатических узлов. Получены типичные двумерные электро-фореграммы данных органов, обнаружены 600 фракций в селезенке, 547 фракций в тимусе и 613 фракций в мезентеральных лимфатических узлах, в том числе органоспецифичные белки (362, 219 и 155 фракций соответственно). Анализ полученных электрофореграмм с помощью информационных ресурсов позволил выявить активные соединения, обладающие различными функциями, преимущественно иммунорегуляторными. Полученные результаты являются перспективой для создания иммунопротеомных карт с целью разработки иммуномодулирующих средств на их основе.
PROTEOMIC TECHNOLOGIES IN PIGS' THYMUS, SPLEEN AND MESENTERIC LYMPH NODES STUDY
Akhremko A.G., Fedulova L.V., Vasilevskaya E.R.
Gorbatov Research Center for Food Systems
Key words: proteomic, thymus, spleen, lymph nodes, immunoproteome, two-dimensional electrophoresis
Summary
This article is devoted to pig's immune organs pro-teome study — thymus, spleen, mesenteric lymph nodes. Typical two-dimensional electrophoregrams of these organs were obtained, 600 fractions were found in spleen, 547 fractions in thymus and 613 fractions in mesenteric lymph nodes, including organ-specific proteins (362, 219 and 155 fractions, respectively). Bioinformatics analysis revealed active compounds with various functions, mainly immunoregulatory. The results are a prospect for creating immunoproteome maps.
Введение
Органы и ткани сельскохозяйственных животных представляют собой неисчерпаемый ресурс соединений, участвующих в различных регулятор-ных и компенсаторных реакциях организма. Современные исследования направлены на идентификацию, изучение и выделение белков, потенциально способных проявлять биологическую активность.
На сегодняшний день одним из самых эффективных способов изучения активных соединений, полученных из животного сырья, является комплексный анализ белковых соединений в организме на молекулярном уровне, который обычно называют «про-теомным подходом». Наиболее популярным протеомным методом для изучения биохимических изменений белков и выявления функциональных видо- и тканеспецифичных соединений является двумерный электрофорез [1]. Использование технологии протеомного картирования позволяет разделить тысячи белков с высоким разрешением, а выделенные белковые фракции охарактеризовать масс-спектрометрическими методами. Очевидное преимущество этого протеомного подхода перед другими заключается в его способности обнаруживать альтернативные формы белков, которые являются результатом ко- и/или посттрансляционных
модификаций. Так, на сегодняшний день в России существует многомодульная база данных «Протеомика мышечных органов» [2], в которой представлены белки скелетных мышц свиньи, коров, лошади и верблюда, а также модули белков миокарда и средней оболочки аорты. На мировом уровне существуют базы данных белков и пептидов (например, Uni-Prot [3], Swiss-Prot [4], PepBank [5]), в которых предлагается перечень соединений с указанием их свойств, молекулярных масс и прочих характеристик в зависимости от таксоно-метрической группы организма.
На данный момент исследования животных тканей направлены на изучение биологических процессов с целью выявления маркеров качества и безопасности продукции (например, автолиза, пороков качества, видовой принадлежности). Однако большой потенциал имеют научные проекты, направленные на протеомный анализ отдельных органов продуктивных животных для выделения активных белковых компонентов и создания на их основе биопрепаратов.
Данная работа посвящена разделению белковых компонентов тимуса, селезенки и мезентеральных лимфатических узлов свиней и анализу полученных двумерных электрофореграмм с целью создания протеомных карт иммунных органов Sus Scrofa.
Материалы и методы
Объектами исследования являлись иммунокомпетентные органы свиней породы Дюрок, самок возрастом 145160 суток: тимусы, селезенки и лимфатические узлы. Образцы органов были отобраны последовательно у животных, при этом каждый вид ткани был индивидуально упакован, хранение органов производили при температуре минус 40 °С (Hayer, Китай).
Белковые компоненты изучали с помощью двумерного электрофореза по методу О*Фаррелла с изоэлектрофо-кусированием в амфолиновом градиенте, детекцию белков проводили окрашиванием Кумасси G-250 (Pan-reac, Испания) [6, 7]. Для получения достоверной информации о количественном составе белковых пятен каждый вид ткани анализировали в трех повторностях.
Компьютерную денситометрию двумерных электрофореграмм, находившихся во влажном состоянии, производили с использованием сканера Bio-5000 plus (Serva, Германия) и получали их полные цифровые изображения и изображения отдельных фрагментов. Изображения анализировали с помощью программного обеспечения ImageMaster ™ 2D Platinum, работающего на базе Melanie 8.0 (GE Healthcare и Genebio, Швейцария), позволяющего автоматически обнаружить и определить количественно белковые пятна.
ВСЕ О МЯСЕ № 1 I 2019
Оцифрованные изображения двумерных электрофореграмм (20Е) сравнивали методом сопоставления.
Интерпретацию белковых пятен на двумерных электрофореграммах исследуемых органов проводили в соответствии с базой данных Swiss-Prot [4].
Результаты исследований
В качестве первого шага к пониманию иммунопротеома были получены типичные 20Е электрофореграммы тимуса, селезенки и мезентеральных лимфатических узлов, представленные на рисунке 1.
Было обнаружено, что в среднем на каждом геле селезенки выявлено порядка 600 пятен, тимуса - 547 пятен и в мезентеральных лимфоузлах - 613 пятен, что согласуется с данными зарубежных коллег [8]. Сравнительный анализ двумерных электрофореграмм позволил выявить во всех образцах селезенки 362 мажорные (конститутивно присутствующих) белковые фракции, в тимусе аналогичных фракций оказалось 219, в лимфатических узлах - 155 соответственно.
Сопоставление полученных двумерных электрофореграмм тимуса, селезенки и мезентеральных лимфатических узлов позволило выявить 15 совпадающих белковых пятен, характерных для всех анализируемых тканей и, по-видимому, являющихся структурными белками (рисунок 2).
С помощью программного обеспечения были выявлены общие белковые фракции, характерные как для индивидуальных иммунных органов, так и для групп органов: для лимфатических
узлов и тимуса - 15 фракций с молекулярными массами в диапазоне от 40 кДа до 100 кДа; для селезенки и тимуса - 22 фракции с молекулярными массами от 40 кДа до 110 кДа, для селезенки и лимфатических узлов - 45 фракций, из которых 26 - в диапазоне молекулярных масс от 35 кДа до 110 кДа (р1 от 5,0 до 7,0), 8 фракций с молекулярными массами в диапазоне от 30 кДа до 45 кДа (р1 более 7,0) и 9 -в диапазоне от 20 кДа до 30 кДа. Такое количество совпадающих белковых фракций обусловлено общими функциями иммунных органов, направленных на иммуногенез.
Далее проводили интерпретацию белковых пятен электрофореграмм в соответствии с современными базами данных. Стоит отметить, что в информационном ресурсе Swiss-Prot [4] имеются данные о 69 белках селезенки свиньи, 22 белков тимуса и 7 белков мезентеральных лимфоузлов.
Установлено, что в лимфатических узлах присутствуют следующие физиологически активные белки. Обнаружена АТФ-зависимая РНК-хеликаза 00X58 (Мм 107,58 кДа), являющаяся врожденным иммунным рецептором, который действует как цитоплазмати-ческий датчик вирусных нуклеиновых кислот и играет важную роль в зондировании вирусной инфекции, а также в активации каскада реакций, включая противовирусную индукцию интерфе-ронов I типа [9]. Также выявлен многофункциональный белок ТСР-бета-1 (Мм 44,28 кДа), регулирующий рост и диф-ференцировку различных типов клеток и участвующий в различных процессах
жизнедеятельности, включая нормальное развитие организма, иммунных реакциях, в том числе функциональности микроглии, включая резидентные макрофаги центральной нервной системы, а также при ответе на нейроде-генерацию [10]. Обнаружены отвечающие за врожденный иммунный ответ белок миелоидной дифференцировки Му088 (Мм 33,25 кДа) и гуморальный иммунный ответ - альфа-лимфотоксин (Мм 21,96 кДа). Выявлен участвующий в липидном обмене аполипопротеин R (Мм 22,72 кДа), имеющийся, к слову, в небольших количествах в тканях селезенки.
В тканях тимуса детектированы белки с различной функциональностью, среди которых протокадгерин-11 (Мм 123,36 кДа), участвующий в клеточной адгезии; белок активирующий рекомбинации 1 (Мм 119,06 кДа), отвечающий за регуляцию хроматина, эндо-нуклеазную активность и связывание гистонов; компонент комплемента С7 (Мм 93,06 кДа), играющий ключевую роль во врожденном и адаптивном иммунном ответе путем формирования пор в плазматической мембране клеток-мишеней, и имеющийся также в селезенке [11]. Также в тимусе обнаружена слабовыраженная фракция глутатиона S-трансферазы омега-1 (Мм 27,41 кДа), участвующая в клеточном ответе на мышьяксодержащие вещества, и которая обычно аккумулируется в печени и скелетных мышцах. Помимо этого, отмечена интенсивно окрашенное пятно, присущее фракции ингибитора протеаз - цистатина Б (Мм 11,09 кДа).
2019 | № 1 ВСЕ О МЯСЕ
В образцах селезенки обнаружены следующие соединения: рецептор лептина (Мм 132,52 кДа), действующий как фактор регулирующий аппетит, вызывая снижение потребления пищи и увеличение потребления энергии, также регулирует костную массу и секрецию гипоталамо-гипо-физарно-надпочечниковых гормонов
[12]; в небольших количествах трансмембранный гликопротеин 3-гидрок-си-3-метилглутарил-коэнзим А-редук-тазы (Мм 97,15 кДа), ограничивающий скорость протекания биосинтеза холестерина и участвующий в биосинтезе изопреноидов, необходимых для нормального функционирования клеток
[13]. Выявлены фракции, отвечающие за врожденный иммунный ответ, такие как гликопротеин С059 (Мм 13,79 кДа) и АТФ-зависимая РНК-хеликаза (Мм 107,58 кДа); интенсивно выраженный ИМ-домен актин-связывающего белка (Мм 83,99 кДа), участвующий в регуляции цитоскелета актина, увеличивающий число и размер актиновых стрессовых волокон, а также тормозящий деполимеризацию актиновых филаментов [14].
Также на двумерных электрофоре-граммах идентифицирована группа белков, характерная для всех анали-
зируемых органов и играющая важную роль во врожденном иммунном ответе и регуляции воспалительных процессов: белок-стимулятор интерферона (Мм 41,8 кДа), хемокин-по-добный рецептор 1 (Мм 41,38 кДа), рецептор, активирующий тромбоциты (Мм 39,43 кДа); TYRO тирозинкиназа связывающий белок (Мм 11,61 кДа), активирующий макрофаги, напрямую вовлечение в иммунный ответ, и ней-трофилы, участвующие в иммунной реакции. Последний был выражен в тканях селезенки и тимуса, но слабо детектировался в лимфатических узлах. Стоит отметить наличие белка тирозинпротеинкиназы SYK (Мм 71,62 кДа), отвечающего за врожденный и адаптивный иммунитет, который был характерен для тканей селезенки и присутствовал в небольших количествах в образцах тимуса.
Заключение
Проведенные исследования двумерных карт иммунных органов свиньи позволили установить наличие широкого спектра белков: в селезенке - до 600 фракций, в тимусе - до 547 фракций и в мезентеральных лимфатических узлах - до 613 фракций. Дальнейший денситометрический
анализ позволил выявить 15 структурных белковых пятен, свойственных для всех анализируемых тканей. Также обнаружены характерные для каждого органа белковые фракции: для тимуса - 219, для лимфатических узлов - 155 и для селезенок - 362 фракции соответственно.
Детектированные фракции на полученных картах преимущественно являются физиологически активными, при этом их активность заключается в основном в участии в различных иммунорегуляторных реакциях. Так, в образцах селезенки зафиксированы как соединения с иммунорегулятор-ной функцией (гликопротеин С059, АТФ-зависимая РНК-хеликаза, ИМ-до-мен актин-связывающего белка), так и факторы, вовлеченные в регуляцию обмена веществ (рецептор лептина, трансмембранный гликопротеин 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А-редуктазы) [12, 13, 14]. Это обусловлено биологической ролью селезенки в организме и, вследствие, особым строением - разделением на красную и белую пульпу и маргинальную зону, которые продуцируют соединения различной специфики. В лимфатических узлах присутствует АТФ-зависимая РНК-хеликаза и белок миелоидной
ВСЕ О МЯСЕ № 1 | 2019
дифференцировки MyD88 - участники врожденного иммунного ответа; белок ТСР-бета-1 - регулятор роста и дифференцировки различных клеток, в том числе иммунных; альфа-лим-фотоксин - индуктор гуморальный иммунный ответ [8, 9]. В тканях тимуса также детектированы белки с иммунореактивной функциональностью (протокадгерин-11 - клеточная адгезия; V(D)J белок, активирующий рекомбинации 1 - дифференцировка Т-клеток; компонент комплемента С7 -врожденный и адаптивный иммунный ответ; глутатион S-трансфераза оме-га-1 - клеточный ответ на токсичные вещества; цистатин Б - дегрануляция нейтрофилов).
Данная работа является первой ступенью к созданию протеомных карт иммунных органов Sus scrofa, что необходимо для разработки иммуномо-дулирующих средств на основе сырья животного происхождения.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 15-16-0008).
© КОНТАКТЫ:
Ахремко Анастасия Геннадьевна а ahremko94@gmail.com Федулова Лилия Вячеславовна а l.fedulova@fncps.ru Василевская Екатерина Романовна а e.vasilevskaya@fncps.ru
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
REFERENCES:
1. Петренко, Е.С. В поиске специфических маркеров глиобластомы: анализ протеоформ глиобластомных клеток / Е.С. Петренко, А.Т. Копылов, О.А. Клейс, О.К. Легина, Н.В. Белякова, Р.А. Пантина, С.Н. На-рыжный // Цитология. - 2018. - Т. 60. - № 7. -С. 519-523.
Petrenko, E.S. V poiske spetsificheskikh markerov glioblas-tomy: analiz proteoform glioblastomnykh kleto [In search of specific markers of glioblastoma: analysis of proteoforms of glioblastoma cells] / E.S. Petrenko, A.T. Kopylov, O.A. Kleis, O.K. Legin, N.V. Belyakova, R.A. Pantina, S.N. Naryzhny // Cytology. — 2018. — T. 60. — № 7. — P. 519-523.
2. База данных «Протеомика мышечных органов». Baza dannykh «Proteomika myshechnykh organov» [Da-Электронный ресурс. — Режим доступа: [http:// tabase «Proteomics of the muscular organs»]. Elektronnyy mp.inbi.ras.ru] (дата обращения: 18.01.2019). resurs [Electronic resource]. URL: [http://mp.inbi.ras.ru]
(data obrashcheniya: 18.01.2019).
3. База данных «UniProt Protein Database». Электрон- Baza dannykh «UniProt Protein Database» Elektronnyy re-ный ресурс. — Режим доступа: [https://www.uniprot. surs [Electronic resource]. URL: [https://www.uniprot.org/] org/] (дата обращения: 18.01.2019). (data obrashcheniya: 18.01.2019).
4. База данных «Swiss-prot» Электронный ре- Baza dannykh «Swiss-prot» Elektronnyy resurs [Electronic
сурс. — Режим доступа: [https://www.uniprot.org/ resource]. URL: [https://www.uniprot.org/uniprot/7que-
uniprot/?query=reviewed:yes] (дата обращения: ry=reviewed:yes] (data obrashcheniya: 18.01.2019). 18.01.2019).
5. База данных «PepBank» Электронный ресурс. — Ре- Baza dannykh «PepBank» Elektronnyy resurs [Electronic жим доступа: [http://pepbank.mgh.harvard.edu/] (дата resource]. URL: [http://pepbank.mgh.harvard.edu/] (data обращения: 18.01.2019). obrashcheniya: 18.01.2019).
6. Чернуха, И.М. Сравнительное изучение автолитиче- Chernukha, I.M. Sravnitel'noye izucheniye avtoliticheskikh ских изменений протеома мышечной ткани свинины izmeneniy proteoma myshechnoy tkani svininy i govyadiny и говядины / И.М. Чернуха, А.Г. Ахремко // Теория [A comparative study of autolytic changes in the pro-и практика переработки мяса. — 2018. — Т. 3. — teome of pork and beef muscle tissue] / I.M. Chernukha, № 3. — С. 56-63. A.G. Akhremko // Theory and practice of meat process-
ing. — 2018. — T. 3. — № 3. — P. 56-63.
7. Василевская, Е.Р. Методология исследования белко-во-пептидных компонентов экстрактов тканей sus scrofa / Е.Р Василевская, Е.А. Котенкова, Е.А. Лукино-ва, Е.А Калинова // Теория и практика переработки мяса. - 2017. - Т. 2. - № 3. - С. 79-85.
Vasilevskaya, E.R. Metodologiya issledovaniya belkovo-pep-tidnykh komponentov ekstraktov tkaney sus scrofa [Methodology for the study of protein-peptide components of sus scrofa tissue extracts] / E.R. Vasilevskaya, E.A. Kotenkova, E.A. Lukinova, E.A Kalinova // Theory and practice of meat processing. — 2017. — T. 2. — № 3. — P. 79-85.
8. Kimura, Y. Construction of quantitative proteome reference maps of mouse spleen and lymph node based on two-dimensional gel electrophoresis / Y. Kimura, R. Yokoyama, Y. Ishizu, T. Nishigaki, Y. Murahashi, A. Hijikata, H. Kitamura, O. Ohara // Proteomics. — 2006. — T. 6. — № 13. — P. 3833-3844.
9. Zhang, X. An RNA helicase, RHIV-1, induced by porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is mapped on porcine chromosome 10q13 / X. Zhang, C. Wang, L.B. Schook, R.J. Hawken, M.S. Rutherford // Microbial pathogenesis. — 2000. — T. 28. — № 5. — P. 267-278.
10. Sriperumbudur, R. Transforming growth factor-p (TGFp) and its signaling components in peri-ovulatory pig follicles / R. Sriperumbudur, L. Zorrilla, J.E. Gadsby // Animal reproduction science. — 2010. — T. 120. — № 1-4. — P. 84-94.
11. Agah, A. Isolation, characterization, and cloning of porcine complement component C7 / A. Agah, M.C. Montalto, C.L. Kiesecker, M. Morrissey, M. Grover, K.L. Whoolery, R.P. Rother, G.L. Stahl // The Journal of Immunology. — 2000. — T. 165. — №. 2. — P. 1059-1065.
12. Ruiz-Cortés, Z.T. Porcine leptin receptor: molecular structure and expression in the ovary / Z.T. Ruiz-Cortés, T. Men, M.F. Palin, B.R. Downey, D.A. Lacroix, B.D. Murphy // Molecular Reproduction and Development: Incorporating Gamete Research. — 2000. — T. 56. — № 4. — P. 465-474.
13. Chen, X. Molecular cloning, tissue expression and protein structure prediction of the porcine 3-hydroxy-3-methylglu-taryl-coenzyme A reductase (HMGR) gene / X. Chen, X. Wang, Z. Li, L. Kong, G. Liu, J. Fu, A. Wang // Gene. — 2012. — T. 495. — № 2. — P. 170-177.
14. Wang, H. Characterization of porcine EPLIN gene revealed distinct expression patterns for the two isoforms / H. Wang, H. Wang, Z. Zhu, S. Yang, S. Feng, K. Li // Animal biotechnology. — 2007. — T. 18. — № 2. — P. 101-108.
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН
В 2018 году вышла в свет книга «ПРИЖИЗНЕННОЕ ФОРМИРОВАНИЕ СОСТАВА И СВОЙСТВ ЖИВОТНОГО СЫРЬЯ» (авторы: А.Б. Лисицын, И.М. Чернуха, О.И. Лунина, Л.В. Федулова), которую издал ФНИ пишевых систем им. В.М. Горбатова
В книге представлены фундаментальные основы и направления исследований по созданию продуктов здорового питания на базе мясного сырья. Приведены данные по влиянию потребления мяса и мясных изделий на здоровье человека. Содержатся сведения об основных нутриентах мяса (белки, липиды) и их влиянии на качество и свойства мяса, микро- и макроэлементах, витаминах, их совместимости и сохранности в процессе производства продуктов. Представлена информация по основным контаминантам мясной продукции, механизмам их образования, а также путям снижения их содержания в готовом продукте и методам контроля. Рассмотрены схемы формирования состава и свойств мясного сырья, включающие в себя различные приемы и способы выращивания: регулирование кормовых рационов и условий содержания животных, направленная модификация (селекция, гибридизация, оперативная манипуляция с животными).
Представлена классификация продуктов здорового питания. Показана инновационная роль функциональных пищевых продуктов в оздоровлении населения, история их создания и основные проблемы, связанные с их разработкой.
Книга предназначена для специалистов пищевой промышленности, научных работников мясной отрасли, преподавателей и учащихся высших учебных заведений.
По вопросам приобретения обращаться: отдел маркетинга, тел.: +7(495) 676-6521, заявки на приобретение направлять e-mail: zakaz@fncps.ru
