CC BY
21
УДК 57.042+57.084
Применение нового инструментального метода для оценки функционального состояния клеток Ргапс'&еПа №1агепз1з в стрессовых условиях
С. В. Борисова, Е. М. Кузнецова, П. С. Ерохин, О. А. Волох
Борисова Светлана Владимировна, магистр кафедры биохимии и биофизики, Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н. Г. Чернышевского, Svetlana. Boris0va@yandex.ru
Кузнецова Екатерина Михайловна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории холерных вакцин ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора, Саратов, microbe.ru
Ерохин Павел Сергеевич, научный сотрудник лаборатории диагностики инфекционных болезней ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора, Саратов, lhv@microbe.ru
Волох Оксана Александровна, кандидат биологических наук, заведующий лаборатории холерных вакцин ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора, Саратов, lhv@microbe.ru
Строение поверхности клетки отражает функциональное состояние бактерии в целом. Наличие специфических признаков клеток сказывается на биофизических характеристиках их поверхности - заряде, свободной энергии и гидрофобности. Взаимодействие бактерий с биомолекулами и частицами также связано с этими характеристиками поверхности. Целью нашей работы было изучение функционального состояния клеток Р. Шгвпв1в 15 НИИЭГ при культивировании в условиях стресса с помощью электрооптического (ЭО) мониторинга. Было показано, что при воздействии повышенной температуры в сочетании с перекисным стрессом изменяются показатели жизнеспособности клеток, а также поверхность клеточной стенки. Вместе с этим стресс стимулирует у бактерии экспрессию иммунореактивных стрессовых белков. Производилось изучение воздействия малых доз антибиотика на биофизические параметры клеток Р. Шгвпв1в в течение короткого времени -1 ч. В эксперименте были использованы антибиотики, применяемые при лечении туляремии, - стрептомицин, канамицин и ампициллин в концентрации 0,5 г/л. Было выявлено, что наибольшим повреждающим действием на клетку в данной концентрации обладает ампициллин. При воздействии канамицина и стрептомицина также наблюдаются изменения жизнеспособности клеток Р. Шгвпв1в, но в меньшей степени. Таким образом, условия культивирования Р. Шгвпв1в влияют на жизненные показатели клеток и уровень экспрессии антигенов. Электрооптический анализ успешно регистрирует различные типы воздействия на клетки микроорганизма и является перспективным методом контроля при разработке профилактических и диагностических препаратов.
Ключевые слова: РгапаэвИа Шгвпв1в, электрооптический анализ, стресс, атомно-силовая микроскопия.
DOI: https://doi.org/10.18500/1816-9775-2019-19-3-326-330
Введение
Туляремия - зоонозная природно-очаговая инфекция, возбудитель которой Francisella tularensis, грамотрицательная факультативно-анаэробная внутриклеточная бактерия, может вызывать вспышки заболевания среди широкого круга хозяев, включая человека, что представляет проблему для практического здравоохранения [1].
В процессе адаптации клетки к определенным условиям изменяется строение клеточной поверхности, что отражает также и ее функциональное состояние. Наличие специфических признаков клеток сказывается на биофизических характеристиках их поверхности - заряде, свободной энергии и гидрофобности. Взаимодействие бактерий с биомолекулами и частицами также связано с этими характеристиками поверхности [2].
Целью нашей работы было изучение функционального состояния клеток F tularensis 15 НИИЭГ при культивировании в условиях стресса с помощью электрооптического (ЭО) мониторинга.
Материалы и методы
Объектом изучения были бактерии F. tularensis subsp. holarctica штамм 15 НИИЭГ (получен из Государственной коллекции патогенных коллекции «Микроб»). Штамм выращивали на пластинках FT агара (пр-ва ГНЦ ПМБ, Обо-ленск) при 37° С в течение 48 ч. Затем бактерии инокулировали в бульоне Мюллера - Хинтона с Т-добавкой рН 7,4 и культивировали в колбах Эрленмейера на термостатируемой качалке (MULTITRON II, Infors) при 200 об/мин в течение 16 ч при (37 ± 2)° С до достижения экспоненциальной фазы роста. Полученную ночную культуру подвергали следующему воздействию: температурному стрессу - повышению температуры до 42° С; сочетанию температурного стресса с перекисным окислением; воздействию антибиотиков.
© Борисова С. В., Кузнецова Е. М., Ерохин П. С., Волох О. А., 2019
Результаты и их обсуждение
1. Воздействие перекисного и температурного стресса на клетки Е ШЫгеш'ш
Для изучения перекисного и температурного стресса добавляли Н2О2 до конечной концентрации 5 мМ, повышали температуру выращивания до 42о С и культивировали еще в течение 2 ч. Контрольные образцы выращивали без перекиси водорода при 37° С. В ходе эксперимента
было показано: выращивание Е tularensis в стрессовых условиях приводит к изменению электрооптического (ЭО) эффекта (рис. 1), что свидетельствует об изменении ориентационного спектра клеток. Нами установлено, что стресс-условия (42° С, Н2О2) незначительно снижали жизнеспособность Е tularensis, но приводили к значительному увеличению экспрессии белков теплового шока, и это согласуется с литературными данными [3].
Рис. 1. Изменение показателя электрооптического эффекта при частоте 900 кГц Fig. 1. The change of the electro-optical effect at a frequency of 900 kHz
Интерес представляет также изменение показателей поверхности клетки - ригидности и шероховатости клеточной стенки, которые оценивались с помощью метода атомно-силовой микроскопии.
Изменение условий сказывается на шероховатости клеточной поверхности (рис. 2). Таким образом, чем более жесткими становятся условия для бактерии, тем более отчетливо видны данные изменения.
! <
(
'tl V
1 , ,
1 (
■ V ' t f
* ■ • s ✓ * Щ
1
/ , 1
< Г
I ж:'
2
1 V
f аЯ т 1 t' x\
| 1, i ,; • > it 1 { i V , у ж } k Я л* * "
i t Л A t т *
f 41 > i , 1 )/ '
« 1 • 1 V1 ' >' ' t, S
3
Рис. 2. Атомно-силовая микроскопия клеток F. tularensis, выращенных в различных условиях: 1 - контроль; 2 - t = 42o C;
3 - 42o C + Н2О2
Fig. 2. Atomic force microscopy of F. tularensis cells grown under different conditions: 1 - control; 2 - t = 42o C; 3 - 42o C + H2O2
Методами электрофореза в полиакриламид- белков Е. tularensis 15НИИЭГ, секретируемых ном геле (БОБ-РАОЕ) [4] и иммуноблоттинга в культуральную жидкость при выращивании [5] был проведен анализ выделенных фракций без стрессового воздействия и под действием
стресса. Было показано увеличение экспрессии иммунореактивных стрессовых белков К. Ш-larensis, в частности одного из белков шаперо-
нов - ОгоБЬ (60 кДа), под действием перикисного и температурного стресса по сравнению с контрольным вариантом опыта (рис. 3).
2
а/а б/b в/с
Рис. 3. Результаты SDS-PAGE и иммуноблоттинга белков, секретируемых бактериями F. tularensis 15НИИЭГ при выращивании в течение 16 ч на жидких средах: 1 - белковый профиль, полиакриламидный гель окрашен кумасси синим R-250; 2 - иммуноблоттинг с сывороткой б/м, вакцинированной F. tularensis 15НИИЭГ; а - контроль, без стрессового воздействия, б - на 2 ч повышение температуры выращивания до 42° С; в - на 2 ч повышение температуры выращивания до 42о С и добавление 5 мМ H2O2 Fig. 3. The results of SDS-PAGE and immunoblotting of proteins secreted by bacteria F. tularensis 15NIIEG when grown for 16 hours in liquid media: 1 - protein profile, polyacrylamide gel, colored with Kumassi blue R-250; 2 - immunoblot with serum b/m vaccinated with F. tularensis 15NIIEG; a - control, without stress, b - for two hours raising the temperature of growing to 42° C; с - for two hours, raising the cultivation temperature to 42° C and adding 5 mM H2O2
1
2. Воздействие антибиотиков как стресс-фактора
Производилось изучение воздействия малых доз антибиотика на биофизические параметры клеток К. tularensis. В эксперименте были использованы антибиотики, применяемые при лечении туляремии, - стрептомицин, канамицин и ампициллин в концентрации 0,5 г/л.
Было выявлено, что наибольшим повреждающим действием на клетку в данной концентрации обладает ампициллин. Уже на начальном этапе взаимодействия антибиотика с клеткой сопротивляемость была снижена в два раза. Это говорит о сорбировании частиц антибиотика на мембране. Через 15 мин сопротивляемость
клетки резко возрастает. По-видимому, в данный момент происходит активная стабилизация мембраны клетки с целью защиты от повреждающего фактора. Спустя 45 мин снова наблюдается снижение сопротивляемости клетки, что связано с нарушением целостности мембран (рис. 4).
При воздействии канамицина и стрептомицина также наблюдаются похожие показатели, но в меньшей степени.
Заключение
Таким образом, условия культивирования К. tularensis влияют на жизненные показатели клеток и уровень экспрессии антигенов. Электрооптический анализ успешно регистрирует разные
200
180
160
140
w
'iE 120
3
(J 100
Ш О щ 80
60
40
20
0
10 minutes 115 minutes 30 minutes 145 minutes
Standard
Ampicillin, 0,5 g/l Kanamycin, 0,5 g/l Streptomycin, 0,5 g/l
Рис. 4. Изменение электрооптического эффекта клеток F. tularensis под действием антибиотиков при
частоте ориентирующего поля 900 кГц Fig. 4. Changes in the electro-optical effect ofF. tularensis cells at a frequency of the orienting field of 900 kHz
типы воздействия на клетки микроорганизма. ЭО мониторинг функционального состояния микробных клеток в режиме реального времени является перспективным методом контроля при разработке профилактических и диагностических препаратов.
Список литературы
1. Дунаева Т. Н., Емельянова О. С., Майский И. Н., Мясников Ю. А., Олсуфьев Н. Г., Руднев Г. П., Савельева Р. А., Сильченко В. С. Туляремия / под ред. Н. Г. Олсуфьева и Г. П. Руднева. М. : Медгиз, 1960. 460 с.
2. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K.,
Walter P. Molecular Biology of the Cell. 5th ed. N.Y. : Garland Science, 2007. 1392 p.
Erisson E., Ericsson M., Tärnvik A., Kuoppa K., Sandström G., SjöstedtA. Increased Synthesis of DnaK, GroEL, and GroES Homologs by Francisella tularensis LVS in Response to Heat and Hydrogen Peroxide // Infection and Immunity. 1994. Jan. P. 178-183. Laemmli U. K. Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 277. P. 680-685.
Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets : procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. Vol. 76, iss. 9. P. 4350-4354.
Образец для цитирования:
Борисова С. В., Кузнецова Е. М., Ерохин П. С., Волох О. А. Применение нового инструментального метода для оценки функционального состояния клеток Francisella tularensis в стрессовых условиях // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2019. Т. 19, вып. 3. С. 326-330. DOI: https://doi.org/10.18500/1816-9775-2019-19-3-326-330
Application of New Instrumental Methods for Evaluation of the Functional State of Cells of Francisella Tularensis in a Stressful Environment
S. V. Borisova, E. M. Kuznetsova, P. S. Erokhin, O. A. Volokh
Svetlana V. Borisova, https://orcid.org/0000-0003-3793-6526, Saratov State University, 83 Astrakhanskaya St., Saratov 410012, Russia, Svetlana.Boris0va@yandex.ru
Ekaterina M. Kuznetsova, https://orcid.org/0000-0002-2128-5426, Institute "Microbe" of Rospotrebnadzor, 46 Universitetskaya St., Saratov 410005, Russia, lhv@microbe.ru
Pavel S. Erokhin, https://orcid.org/0000-0003-2175-5333, Institute "Microbe" of Rospotrebnadzor, 46 Universitetskaya St., Saratov 410005, Russia, lhv@microbe.ru
Oksana A. Volokh, https://orcid.org/0000-0002-3044-971X, Institute "Microbe" of Rospotrebnadzor, 46 Universitetskaya St., Saratov 410005, Russia, lhv@microbe.ru
The structure of the cell surface reflects the functional state of the bacterium as a whole. The presence of specific features of cells affects the biophysical characteristics of their surface: charge, free energy and hydrophobicity. The interaction of bacteria with biomol-ecules and particles is also related to these surface characteristics. The aim of our work was to study the function of F. tularensis
15 NIIEG cells under cultivation under stress using electro-optical (EO) monitoring. It was shown that under the influence of elevated temperature in combination with peroxide stress, the cell viability indices, as well as the surface of the cell wall, change. At the same time, stress stimulates expression of immunoreactive stress proteins in bacteria. The effect of small doses of antibiotic on the biophysical parameters of F. tularensis cells was studied for a short time - 1 hour. In the experiment, antibiotics used in the treatment of tularemia - streptomycin, kanamycin and ampicillin at a concentration of 0.5 g/l were used. It was found that the greatest damaging effect on the cell in this concentration was by ampicillin. When exposed to kanamycin and streptomycin, changes in the viability of F. tularensis cells were also observed, but to a lesser extent. Thus, the conditions of cultivation F. tularensis affect the vital signs of cells and the level of antigen expression. Electro-optical analysis successfully registers various types of exposure to microbial cells and is a promising method of control in the development of preventive and diagnostic medicaments.
Keywords: Francisella tularensis, electro-optical analysis, stress, atomic force microscopy.
References
1. DunaevaT. N., Emelyanova O. S., May I. N., Myasni-kov Y. A., Olsufiev N. G. , Rudnev G. P., Saveliev R. A., Silchenko V. S. Tularemia. Eds. G. Olsufyev, G. P. Rudnev. Moscow, Medgiz Publ., 1960. 460 p.
2. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. Molecular Biology of the Cell. 5th ed. New York, Garland Science, 2007. 1392 p.
3. Erisson E., Ericsson M., Tarnvik A., Kuoppa K., Sandstrom G., Sjostedt A. Increased Synthesis of DnaK, GroEL, and GroES Homologs by Francisella tularensis LVS in Response to Heat and Hydrogen Peroxide. Infection and Immunity, 1994, Jan, pp. 178-183.
4. Laemmli U. K. Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature, 1970, vol. 277, pp. 680-685.
5. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, vol. 76, iss. 9, pp. 4350-4354.
Cite this article as:
Borisova S. V., Kuznetsova E. M., Erokhin P. S., Volokh O. A. Application of New Instrumental Methods for Evaluation of the Functional State of Cells of Francisella tularensis in a Stressful Environment. Izv. Saratov Univ. (N. S.), Ser. Chemistry. Biology. Ecology, 2019, vol. 19, iss. 3, pp. 326-330 (in Russian). DOI: https://doi.org/10.18500/1816-9775-2019-19-3-326-330
