CC BY
96
Природопользование
ческая академия», кандидат технических наук, г. Воронеж, Российская Федерация; e-mail: [email protected].
Малышев Владимир Викторович - доцент кафедры лесных культур, селекции и лесомелиорации ФГБОУ ВПО «Воронежская государственная лесотехническая академия», кандидат сельскохозяйственных наук, г. Воронеж, Российская Федерация; e-mail: [email protected].
Information about authors
Petrovsky Vladislav Sergeevich - Professor of Department Automation Production Processes of FSBEI HPO «Voronezh State Academy of Forestry and Technologies», DSc in Engineering, Professor, Voronezh, Russian Federation; e-mail: [email protected].
Murzinov Yury Valeryevich - FSBEI HPO «Voronezh State Academy of Forestry and Technologies», PhD in Engineering, Voronezh, Russian Federation; e-mail: [email protected].
Malyshev Vladimir Viktorovich - Associate Professor of Forest Crops, Selection and Afforestation Department of FSBEI HPO «Voronezh State Academy of Forestry and Technologies», PhD in Agriculture, Voronezh, Russian Federation; e-mail: [email protected].
DOI: 10.12737/8440 УДК 577.212: 632.4
ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ДЛЯ ФИТОСАНИТАРНОГО ОБСЛЕДОВАНИЯ ЛЕСНЫХ ПИТОМНИКОВ
кандидат сельскохозяйственных наук В. А. Сиволапов1 Н. А. Карпеченко1 В. Н. Вепринцев1
1 - Филиал ФБУ «Российский центр защиты леса» «Центр защиты леса Воронежской области», г. Воронеж, Российская Федерация
Рассматриваются проведенные исследования и практическое применение современных методов молекулярно-генетической диагностики для определения различных видов и степени заболеваний сеянцев, в том числе, трудно различаемым по внешним признакам. Фитосанитарные исследования были выполнены на одно-двухлетних сеянцах сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) и каштана конского (Aesculushippo castanum L.), полученных из шести лесных питомников Липецкой и Курской областей. Степень поражения различными видами патогенов полученных сеянцев составляла 30 и более процентов. Диагностика растительного материала на наличие фитопатогенов включала в себя ряд этапов: выделение генетического материала (ДНК) из сеянцев, амплификация маркерных участков фитопатогенов, секвенирование ампли-фицированных фрагментов, анализ и идентификация патогена по базе данных. Доказано, что практическая значимость методов молекулярно-генетического анализа для питомнического хозяйства заключается в диагностике трудно идентифицируемых видов заболеваний по мор-
Лесотехнический журнал 4/2014
53
Природопользование
фологическим признакам, а также на ранних стадиях патогенеза. В то время как традиционный фитопатологический анализ не позволяет этого сделать. Были выявлены следующие виды патогенов: Phoma pomorum, Alternaria alternate, Cladosporium sp., Rhizosphaera kalkhoffii, Cyclaneusma minus, Sydowia polyspora. Внешние симптомы вызываемых ими заболеваний схожи с обыкновенным шютте сосны и зачастую приводят к ошибочной постановке диагноза. Одним из действенных способов недопущения увеличения концентрации и численности вредных организмов, приносящих существенный ущерб от потери качества и количества как репродуктивного материала лесных питомников, так и лесных насаждений, является их ранняя диагностика и профилактика. Методы молекулярно-генетического анализа оправдываются экономической и экологической целесообразностью предупреждения увеличения площадей и степени пораженности вредными организмами, по сравнению с организацией и проведением как лесозащитных мероприятий, так и последующими лесовосстановительными работами.
Ключевые слова: лесные питомники, сеянцы, фитопатогены, ДНК-анализ, праймеры, ПЦР, локус, секвенирование.
THE USE OF MOLECULAR GENETICS DIAGNOSTICS FOR PHYTOSANITARY
INSPECTION OF FOREST NURSERIES PhD in Agriculture V. A. Sivolapov1
N. A. Karpechenko1 V. N. Veprintsev1
1 - Department of FBI «Russian Center for Forest Protection», «Forest protection center of Voronezh Region», Voronezh, Russian Federation
Abstract
Conducted research and practical application of modern methods of molecular genetics diagnostics to determine different types and degrees of diseases of seedlings, including difficult to differ in their appearance, are examined. Phytosanitary studies have been performed on one-two-year seedlings of Scots pine (Pinus sylvestris L.) and chestnut (Aesculushippo castanum L.), obtained from six forest nurseries both the Lipetsk and Kursk regions. The degree of different types of pathogens of received seedlings was 30 percent or more. Diagnosis of the presence of plant material for phytopathogens included a series of steps: isolation of genetic material (DNA) from seedlings, phytopathogens amplification of marker portions, sequencing of the amplified fragments, and analysis and pathogen identification in database. It is proved that the practical importance of the methods of molecular genetic analysis for the nursery economy is in diagnose of difficult identifiable diseases based on morphological features, as well as the early stages of pathogenesisа. While traditional Phytopathological analysis does not allow it. The following pathogens were identified: Pho-ma pomorum, Alternaria alternate, Cladosporium sp., Rhizosphaera kalkhoffii, Cyclaneusma minus, Sydowia polyspora. External symptoms of diseases caused by them are similar to ordinary Schutte pine and often lead to erroneous diagnosis. One of the most effective ways to prevent the increase
54
Лесотехнический журнал 4/2014
Природопользование
of concentration and pest prevalence, bringing substantial damage from the loss of quality and quantity both reproductive material of forest nurseries and forest plantations is their early diagnosis and prevention. Methods of molecular genetic analysis are justified by economic and environmental feasibility of increasing the warning area and the degree of infestation by pests, compared with the organization and carrying out forest protection measures as well as subsequent reforestation.
Keywords: forest nurseries, seedlings, phytopathogens, DNA analysis, primers, PCR, locus, sequencing.
На основании ст. 61 Лесного Кодекса Российской Федерации [1] «вырубленные, погибшие, поврежденные леса подлежат воспроизводству» и далее «воспроизводство лесов осуществляется путем лесовосстановления и ухода за лесами». Качество искусственного лесовосстановления во многом зависит от состояния посадочного материала и агротехники выращивания на лесных питомниках, а также от происхождения и свойств используемых лесных семян.
Начало XXI столетия ознаменовалось быстрым развитием и внедрением в лесохозяйственную деятельность России различных методов биотехнологий и генной инженерии.
Главной целью данной работы явились исследования и практическое применение современных методов молекулярногенетической диагностики по определению различных видов и степени заболеваний сеянцев, в том числе, трудно различаемым по внешним признакам.
Причиной повреждения и усыхания лесных растений является воздействие ряда факторов абиотической и биотической природы, а также и антропогенных факторов: (нарушение агротехники выращивания посадочного материала, несоблюдение условий хранения, технологии предпосевной обработки и посева семян, нередко,
неблагоприятные погодные условия, в т.ч. аномальные засухи, град и т. д.). Повреждения насекомыми приводят к ослаблению биологической устойчивости растения, и создают предпосылки для повреждения (поражения) различными болезнями.
Установлено, что наибольший ущерб в лесохозяйственной деятельности наносят инфекционные заболевания. При этом среди фитопатогенов около 97 % составляют грибные инфекции, 2 % - бактериальные и 1 % - вирусные [2].
Важной особенностью, для ведения хозяйства, является наличие инкубационного периода инфекционных заболеваний - времени от начала заражения до появления первых признаков. Длительность этого периода, как у лесных растений, так и в медицинской практике, зависит от способа заражения и вида возбудителя, и может продолжаться от нескольких часов до нескольких лет.
Для решения данных задач, по нашему запросу, лесничествами были предоставлены сеянцы с действующих лесных питомников для проведения ДНК-анализа. Фитосанитарные обследования были выполнены в пяти лесных питомниках Липецкой и Курской областей, однодвухлетних сеянцев сосны обыкновенной (Pirns sylvestris L.) и каштана конского
Лесотехнический журнал 4/2014
55
Природопользование
(Aesculushippo castanum L.) (табл.). Образцами послужили части ассимиляционного аппарата лесных растений. Всего было проанализировано 88 образцов.
Согласно Программе и Методике выполнения работ по п. 59 Плана мероприятий («дорожной карты») «Развитие биотехнологий и генной инженерии», утвержденного распоряжением Правительства Российской Федерации от 18 июля 2013 г. №1247-р [2], отбор образцов для генетического анализа осуществлялся в количестве 20-50 пораженных растений в каждой возрастной группе и отправлялся лесничествами в бумажных пакетах, в сухом виде.
Диагностика растительного материала на наличие фитопатогенов включает в себя ряд этапов: выделение генетического материала (ДНК) из лесных растений, ам-
плификация маркерных участков фитопатогенов, секвенирование амплифициро-ванных фрагментов, анализ и идентификация патогена в базе данных.
Выделение тотальной ДНК из растительного материала было выполнено ЦTAБ-методом [2, 3]. Для амплификации маркерного участка грибных фитопатогенов использовали ПЦР с праймерами ITS1 и ITS4, подобранными к региону рДНК [4]. Предварительный анализ продуктов амплификации был выполнен с помощью электрофоретического фракционирования в 2 % агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием [2, 3]. Определение нуклеотидной последовательности амплифицированных локусов выявленных патогенов проведено с помощью генетического анализатора ABI Prism
Таблица
Виды патогенов, обнаруженных на лесных питомниках Курской и Липецкой области
Субъект Российской Федерации Лесничество Участковое лесничество Порода Вид идентифицированного патогена Вид вызываемого заболевания
Курская область Льговское Льговское сосна каштан Alternaria alternate альтернариоз (сухая пятнистость хвои и листьев)
Курская область Рыльское Г лушковское сосна Cladosporium sp. кладоспориоз (темнооливковая плесень)
Rhizosphaera kalkhoffii вызывает побурение хвои
Липецкая область Г рязинское Яманское сосна Phoma pomorum фомоз (сухая гниль)
Липецкая область Тербунское Воловское сосна Cyclaneusma minus вызывает пожелтение хвои
Липецкая область Елецкое Становлянское сосна Rhizosphaera kalkhoffii вызывает побурение хвои
Sydowia polyspora склерофомоз (в питомниках - отмирание сеянцев, в культурах - отставание в росте и многовершин-ность)
56
Лесотехнический журнал 4/2014
Природопользование
310 (Applied Biosystems, США). Секвени-рующая реакция была выполнена с использованием набора Big Dye Terminator Sequence Kit v.3.1 (Applied Biosystems, США) и 50-ти см капилляра (310 Genetic Analyzer Capillary) согласно протоколу компании-изготовителя. Интерпретацию полученных сиквенсов проводили при помощи программного обеспечения Sequencing Analysis 6. Для установления видовой принадлежности выявленных патогенов их нуклеотидная структура была идентифицирована с помощью программы BLAST в Gen Bank NCBI [5].
В ходе проведенной молекулярногенетической диагностики сеянцев при предварительном электрофоретическом анализе наработанных ПЦР-продуктов ITS локусов, где в качестве матрицы использовали ДНК из хвои сосны пораженных растений, наличие генетического материала грибной природы в исследуемых образцах
судили по проявлению в геле светящихся в УФ окрашенных зон (рис. 1). Здоровые растения характеризовались отсутствием ДНК возбудителей заболеваний и соответственно отсутствием амплифицированного локуса рДНК патогена [6].
Степень поражения различными видами патогенов полученных сеянцев с лесных питомников составляла от 30 % и более. Точное определение видовой принадлежности фитопатогена осуществляли путем определения нуклеотидной структуры амплифицированных локусов, на основании метода ферментативного секвениро-вания по Сенджеру (рис. 2).
Таким образом, практическая значимость методов молекулярно-генетического анализа для питомнического хозяйства заключается в диагностике трудно идентифицируемых видов заболеваний по морфологическим признакам, в том числе на ранних стадиях патогенеза.
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 М
М - маркеры ДНК (80-10000 п.н.);
2-5, 7-9, 11, 14, 15 - амплифицированные локусы патогена;
1, 6, 10, 12, 13 - здоровые растения
Рис. 1. Электрофореграмма локусов рДНК проанализированных образцов сеянцев сосны обыкновенной на примере Яманского лесного питомника Липецкой области
Лесотехнический журнал 4/2014
57
Природопользование
CTACCTGATCCGAGGTCAGAGTGTAAAAAAGTACTTTTGGACGTCGTCGTTATGAGTGC
AAAGCGCGAGATGTACTGCGCTCCGAAATCAATACGCCGGCTGCCAATTGTTTTGAGG
CGAGTCTACGCGCAGAGGCGAGACAAACACCCAACACCAAGCAGAGCTTGAAGGTAC
AAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCCATGGAATACCAAGGGGCGCAATGTGCGTTCAA
AGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACACTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCT
TCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTGTAACTATTAAGTTTTTTCA
GACGCT GATT GCAACT GCAAAT
Рис. 2. Сиквенсовый профиль и нуклеотидная последовательность выявленного с помощью ДНК-анализа в образцах сеянцев сосны обыкновенной патогена Phoma pomorum на генетическом анализаторе ABI Prism 310
Классический фитопатологический анализ посадочного материала на лесных питомниках основан на обнаружении внешних признаков лесных болезней: изменении цвета ассимиляционного аппарата или других органов растения, наличию наружных спор грибов (канидиоспоры) и т.д. на поздних стадиях развития болезней и не позволяет проводить раннюю профилактику и лечение заболеваний, что может приводить к существенному экономическому и экологическому ущербу в лесном хозяйстве. Проведение ДНК-анализа экономически целесообразно,
т.к. может предупредить очаговое поражение в питомниках на ранних стадиях поражения.
Внешнее проявление выявленных болезней на лесных питомниках Phoma
pomorum, Alternaria alternate, Cladosporium sp., Rhizosphaera kalkhoffii, Cyclaneusma minus, Sydowia polyspora вызываемых данными грибами, сводится к пожелтению и усыханию хвои (шютте) (рис. 3), что зачастую приводит к ошибочной постановке диагноза, как обыкновенное шютте сосны (вызывается грибом Lophodermium pinastri) при непосредственной визуальной оценке [6]. Однако рекомендуемые препараты для защиты растений по локализации и ликвидации вышеуказанных патогенов -разные, если ошибочно поставить диагноз, то соответственно обработка не приведет к должному результату.
Одним из действенных способов недопущения увеличения концентрации и
58
Лесотехнический журнал 4/2014
Природопользование
Рис. 3. Внешний вид инфицированных сеянцев сосны обыкновенной, Яманский лесной
питомник Липецкой области
численности вредных организмов, приносящих существенный ущерб от потери качества и количества, как репродуктивного материала лесных питомников, так и лесных насаждений, является их ранняя диагностика и профилактика с применением современных способов защиты и воспроизводства лесов. В связи с чем возникает необходимость введения в практику современного лесного хозяйства Российской Федерации фитосанитарных обследований состояния лесных питомников на основе методов молекулярно-генетического анализа, позволяющего постановить точный диагноз и узнать их происхождение, при наличии региональной генной базы дан-
ных митотипов основных лесообразующих пород. Во многом состояние и продуктивность создаваемых лесных культур зависят не только от факторов внешней среды, но и от качества и происхождения посадочного материала. На сегодняшний день оборудование и реактивы для ДНК-анализа являются весьма дорогостоящими, но оправдываются экономической и экологической целесообразностью предупреждения увеличения площадей и степени пораженно-сти вредными организмами, по сравнению с организацией и проведением как лесозащитных мероприятий, так и последующими лесовосстановительными работами.
Библиографический список
1. Лесной кодекс Российской Федерации. Комментарии [Текст] : изд. 2-е, доп. / Под общ. Ред. Н.В. Комаровой, В.П. Рощупкина. - М.: ВНИИЛМ,2007. - 856 с.
2. Программа и Методика по пункту 59 План мероприятий («дорожной карты») «Развитие биотехнологий и генной инженерии», утвержденного распоряжением Правительства РФ
Лесотехнический журнал 4/2014
59
Природопользование
от 18 июля 2013 г. № 1247-р. Программа и Методика утверждена ФБУ «Рослесозащита» от 12.02.2014. [Текст]. - Пушкино, 205 с.
3. Падутов, В. Е. Методы молекулярно-генетического анализа [Текст] / В. Е. Падутов,
О. Ю. Баранов, Е. В. Воропаев. - М. : Юнипол, 2007. - 176 с.
4. White, T. J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics [Текст] / T. J. White [et al.] // in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, M. A., D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White eds.). - New York: Academic Press Inc. - 1990. - P. 315-322.
5. GenBank Overview [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/
6. Баранов, О. Ю. Молекулярно-генетическая диагностика грибных болезней в лесных питомниках [Текст] / О. Ю. Баранов, В. А. Ярмолович, С. В. Пантелеев, Д. Г. Купреенко // Лесное и охотничье хозяйство. - 2012. - № 6.
References
1. Lesnoj kodeks Rossijskoj Federacii. Kommentarii [Forest Code of the Russian Federation. Comments]. Ed. by Komarova N.V., Roshupkin V.P. Moscow, 2007, 856 p. (In Russian).
2. Programma i Metodika po punktu 59 Plan meroprijatij («dorozhnoj karty») «Razvitie bio-tehnologij i gennoj inzhenerii», utverzhdennogo rasporjazheniem Pravitel'stva RF ot 18 ijulja 2013 g. № 1247-r. Programma i Metodika utverzhdena FBU «Roslesozashhita» ot 12.02.2014. [Programs and techniques on paragraph 59 of the Action Plan ("roadmap") "The development of biotechnology and genetic engineering", approved by Decree of the Government of the Russian Federation on July 18, 2013 № 1247-p. Programs and methods approved by FBI "Roslesozashchita" of 12.02.2014]. Pushkino, 205 p. (In Russian).
3. Padutov V.E., Baranov O.Y., Voropaev E.V. Metody molekuljarno-geneticheskogo analiza [Methods of molecular genetic analysis]. Moscow, 2007, 176 p. (In Russian).
4. White T.J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics / T.J. White [et al.] // in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, M.A., D.H. Gelfand, J.J. Sninsky, and T.J. White eds.). New York: Academic Press Inc, 1990, pp. 315-322.
5. GenBank Overview Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/
6. Baranov O.Y., Yarmolovich V.A., Panteleev S.V., Kupreenko D.G. Molekuljarno-geneticheskaja diagnostika gribnyh boleznej v lesnyh pitomnikah [Molecular genetic diagnosis of fungal diseases in forest nurseries]. Lesnoe i ohotnich'e hozjajstvo - Forestry and hunting, 2012, no. 6. (In Russian).
Сведения об авторах
Сиволапов Владимир Алексеевич - начальник отдела лесной генетики филиал ФБУ «Российский центр защиты леса» «Центр защиты леса Воронежской области», кандидат сельскохозяйственных наук, г. Воронеж, Российская Федерация; e-mail: [email protected].
Карпеченко Никита Александрович - инженер I категории отдела лесной генетики фи-
60
Лесотехнический журнал 4/2014
Природопользование
лиал ФБУ «Российский центр защиты леса» «Центр защиты леса Воронежской области», г. Воронеж, Российская Федерация; e-mail: [email protected].
Вепринцев Владислав Николаевич - инженер I категории отдела лесной генетики филиал ФБУ «Российский центр защиты леса» «Центр защиты леса Воронежской области», г. Воронеж, Российская Федерация; e-mail: [email protected].
Information about authors
Sivolapov Vladimir Alekseevich - Head of the Department of Forest Genetics Branch Department of FBI «Russian Center for Forest Protection», «Forest protection center of Voronezh Region», PhD in Agriculture, Voronezh, Russian Federation; e-mail: [email protected].
Karpechenko Nikita Aleksandrovich - Engineer of I category of Forest Genetics Department of FBI «Russian Center for Forest Protection», «Forest protection center of Voronezh Region», Voronezh, Russian Federation; e-mail: [email protected].
Veprintsev Vladislav Nikolaevich - Engineer of I category of Forest Genetics Department of FBI «Russian Center for Forest Protection», «Forest protection center of Voronezh Region», Voronezh, Russian Federation; e-mail: [email protected].
DOI: 10.12737/8441 УДК 581.52
ПОТЕНЦИАЛ ПРИРОДНО-КЛИМАТИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ ИМЕРЕТИНСКОЙ НИЗМЕННОСТИ ДЛЯ ИНТРОДУКЦИИ ТРОПИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ
Д. В. Сухоруков1
кандидат сельскохозяйственных наук, доцент О. В. Трегубов1 1 - ФГБОУ ВПО «Воронежская государственная лесотехническая академия»,
Воронеж, Российская Федерация
При подготовке к Зимним Олимпийским играм 2014 было необходимо провести озеленение создаваемого Олимпийского парка в городе Сочи. Используемый посадочный материал для своего успешного развития должен был соответствовать природным условиям местности. Проводились ландшафтные и климатические исследования территории Имеретинской низменности, для этого использовались данные авторских наблюдений и метеорологической станции. Для равнинной территории низменности характерно наличие заросших растительностью колхидских болот и аккумулятивное происхождение. Теплому и влажному субтропическому климату низменности свойственны мягкая зима, жаркое лето, теплая осень и прохладная затяжная весна. Для детального анализа климатических условий рассматриваются особенности метеорологических показателей исследуемой местности (инсоляционный режим, влажность воздуха, температура воздуха и почвы на различной глубине, осадки). Хороший инсоляционный режим территории обеспечивает обильное количество солнечного
Лесотехнический журнал 4/2014
61
