CC BY
350
ИНФОРМАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В КРИМИНОЛОГИИ, КРИМИНАЛИСТИКЕ, ОПЕРАТИВНО-РАЗЫСКНОЙ И ЭКСПЕРТНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ
применение молекулярно-генетических методов в раскрытии преступлений
© БОРОДУЛИН Владимир Борисович
доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой биохимии ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского Росздрава».
@ (845-2) 234-836, Н borodulinvb@mail.ru
© РОДИОНОВА Маргарита Петровна
кандидат юридических наук, доцент кафедры трасологии ФГОУ ВПО «Саратовский юридический институт МВД России».
@ (845-2), ЕЗ йш^епоу^Ш.ги
Молекулярная генетика на службе судебно-медицинской экспертизы активно внедряется в практику правоохранительной деятельности, и это не дань моде, а следствие «революционных» возможностей. Благодаря молекулярной генетике не остаются безнаказанными многие опасные преступления против жизни человека, минимизируются случаи ложного обвинения лица в совершении преступления.
Ключевые слова: «геномная» дактилоскопия, анализ клеточной ДНК, генетическая инженерия, генетический паспорт преступника.
История судебных наук, в частности, криминалистики и тесно с нею связанной судебной медицины, насчитывает более века. В нашей стране исследования по геномной дактилоскопии были начаты в 1987 г. в Институте молекулярной биологии, в лаборатории академика Г. П. Георгиева.
Молекулярно-генетический идентификационный анализ, традиционно называемый «геномной дактилоскопией», направлен на выявление индивидуальных особенностей, «особых примет» генетической конструкции
конкретного человека. Этот подход не имеет аналогов среди использовавшихся ранее методов судебно-экспертной идентификации человека, хотя само его название заимствовано из классической судебной науки.
Дактилоскопия в настоящее время является самым используемым методом при идентификации человека, изучает приёмы и средства использования следов папиллярных узоров пальцев рук, в целях уголовной регистрации и идентификации по следам, обнаруживаемым на местах происшествий.
В геномной дактилоскопии применяется принципиально иная технология установления личности, основанная не на изучении следов пальцев рук, а на анализе клеточной ДНК -универсального носителя наследственной информации.
Целью использования новых методов в судебно-медицинской экспертизе вещественных доказательств является повышение идентификационных возможностей.
Молекулярно-генетическая экспертиза
- наиболее доказательственный метод анализа биологического материала при расследовании преступлений. Она обеспечивает высокий уровень доказательности благодаря тому, что позволяет экспертам делать выводы о конкретном человеке. Судебно-медицинская молекулярно-генетическая экспертиза назначается по уголовным и гражданским делам, когда возникает необходимость судебно-медицинского исследования вещественных доказательств для идентификации человека, - в ходе расследования убийств, причинения телесных повреждений, изнасилований, при идентификации неопознанных и расчленённых трупов, а также в случаях подмены, похищения детей, установления отцовства.
Стремительное развитие нано- и биотехнологий ставит вопрос о возможности применения методов молекулярной биологии в криминалистике и судебной медицине. Необходимо отметить, что, помимо процедур идентификации личности, методы генетической инженерии позволяют создавать биологическое оружие нового поколения, которое может оказаться в руках преступников и быть ими использовано в различных целях, и, следовательно, данная проблема может перерасти в вопрос национальной безопасности. Поэтому перед сотрудниками правоохранительных органов должны быть поставлены ясные задачи о понимании роли молекулярной биологии и генетической инженерии в современном мире, о путях создания в общем виде нового поколения биологического оружия и механизмах его использования в обычной жизни, о способах пресечения его распространения, об умении пользоваться базой данных и понимать терминологию молекулярной биологии, то есть, возможно, необходимо введение своеобразного «ликбеза» для сотрудников правоохранительных органов по вопросам молекулярной биологии и генетической инженерии. Кроме того, не за горами создание «генетического паспорта» преступника со всеми вытекающими отсюда правовыми нормами, разработка которых представляет собой отдельную задачу и требует не только знания юриспруденции, но и понимания основ специальных предметов.
Приведём два примера. Введение гена, то есть «куска» ДНК, аналогичного гену, который отвечает за синтез фосфолипазы яда кобры, в геном вируса «обычного» гриппа методами генетической инженерии приведёт к тотальному гемолизу эритроцитов в течение нескольких часов, поскольку фосфолипаза разрушает мембрану красных кровяных телец - эритроцитов, что, естественно, повлечёт за собой смертельный исход. Возникает вопрос о правовых последствиях этого смертельного исхода, так как ни врач, ни сотрудник правоохранительных органов даже не представляют себе, с чем им приходится сталкиваться. Следовательно, врач не может назначить правильное лечение, а юрист дать квалифицированное заключение в случае обращения граждан по факту смерти родственников.
Другой пример. Множественная анти-биотикорезистентность, то есть устойчивость бактерий к антибиотикам, приобретаемая возбудителями гнойно-септических инфекций в лечебных учреждениях, становится одной из причин распространения госпитальных инфекций в стационарах. С помощью методов генетической инженерии возможно создание бактериальной клетки (за счёт изменения структуры ДНК бактерии), которая будет идентифицироваться методами микробиологии как стандартный штамм, циркулирующий в данном стационаре, а по своим свойствам не будет чувствительным ни к одному из антибиотиков.
Возникает, естественно, вопрос о том, как определять подобные явления. Необходимы большие затраты по времени и по квалифицированному персоналу для решения подобных задач. В условиях дефицита и того и другого задача переходит в категорию неразрешимых, что повышает уязвимость как лечебного учреждения, так и популяции людей в целом. Кроме того, внедрение в практику больниц молекулярных маркеров встречает, как правило, определённое сопротивление со стороны администрации, поскольку может сказаться на показателях, характеризующих работу стационара или поликлиники.
В Институте молекулярной биологии РАН на протяжении нескольких лет разрабатывается технология идентификации человека по генам индивида. Эта технология основана на исследовании биологического материала с места преступления и сравнении его с материалом, полученным от подозреваемого или от родственников как подозреваемого, так и жертвы. Данная технология предполагает использование биологических микрочипов, или биочипов (рис. 1). На биочипах может быть информация как о ДНК, так и о белках (рис. 2). Разработка
белковых чипов проходит стадию клинических испытаний. Метод с использованием биочипов позволяет работать с плохо сохранившимися образцами крови, слюны, пота, волос и др., что невозможно для серологического подхода. Высокая чувствительность метода позволяет надеяться на перспективность развития этой технологии для идентификации личности по следовым количествам биоматериала. Развитием данного направления является включение других генетических маркеров, определяющих такие фенотипические характеристики, как, например, цвет глаз, волос, кожи и т. п. Тогда станет возможным решение задачи частичной реконструкции фенотипа индивида по результатам экспертизы, используя следовые количества его ДНК [1, с. 2072-2075].
Биочип - уникальная разработка отечественных учёных. Биологический микрочип представляет собой подложку (предметное стекло/полимерный материал) с иммобилизованными зондами, специфичными к определённым генетическим вариантам. Эта технология позволяет за короткий промежуток времени (несколько часов) проанализировать генетические мутации и тем самым определить предрасположенность к различным заболеваниям. В течение дня можно провести диагностику туберкулеза, тогда как другие методы требуют нескольких недель или даже месяцев. Так, например, при помощи одной пластинки размером с почтовую марку можно получить данные о нескольких тысячах генов или о группе свойств возбудителя. Существуют чипы, позволяющие определять возбудителей, чаще всего используемых в качестве биооружия: сибирской язвы, оспы, чумы и бруцеллеза.
Эффективность биочипов обусловлена возможностью параллельного проведения огромного количества специфических реакций и взаимодействий молекул биополимеров, таких как ДНК, белки, полисахариды, друг с другом и низкомолекулярными лигандами.
Своеобразием и отличием развиваемых биочипов является то, что они представляют собой полусферические капли гидрогеля, фиксированные химической связью на поверхности стекла, пластика или силикона. Различные биомолекулы равномерно распределяются и иммобилизуются химическими связями в объёме геля. Иммобилизация не на двумерной поверхности, а в трёхмерном объёме геля даёт ряд существенных преимуществ. В десятки и сотни раз увеличивается ёмкость биочипа на единицу поверхности, и соответственно возрастает чувствительность измерений. Иммобилизованные макромолекулы как бы фиксированы в гомогенной водной среде, составляющей около 95%
объёма геля. Это исключает их взаимодействие как друг с другом, так и с твёрдой поверхностью, где гетерофазные процессы с участием фиксированных на ней биомолекул протекают более сложным образом. Это особенно существенно для белковых чипов, поскольку молекулы белков имеют тенденцию денатурации в интерфазе, образованной между твёрдой поверхностью и водной средой. Наконец, гелевые элементы на воздухе или под маслом превращаются как бы в изолированные микро- и нанолитровые пробирки, в каждой из которых можно проводить индивидуально различные специфические взаимодействия, химические и ферментативные реакции. Благодаря этому гелевые биочипы объединяют в себе свойства и микроматриц и микролабораторий [4, с. 818-825; 9, с. 824-825].
Технологически биочип представляет собой матрицу, состоящую из сотен и тысяч ячеек. В каждой из ячеек закреплён олигонуклеотид - последовательность из нескольких нуклеиновых кислот. Длина олигонуклеотидов во всех ячейках одинаковая, отличаются они лишь последовательностью нуклеиновых кислот. Исследуемая ДНК режется на кусочки и проходит предварительную обработку, которая заключается в том, что к каждому из кусочков прикрепляется флуоресцентная метка. Таким образом, получается набор из огромного числа маркированных олигонуклеотидов, являющихся составными частями исходной ДНК. Далее образец наносится на все ячейки чипа, а затем, спустя некоторое время, смывается. Если в наборе имеется олигонуклеотид, комплементарный закрепленному в ячейке, то между ними, как мы сказали выше, образуется связь, и при промывании он не будет удалён, в отличие от олигонуклеотидов, которым не нашлось комплемента. После промывки чип помещается в специальный флуоресцентный микроскоп, где по световому сигналу, «метящему» ячейки с образовавшейся парой цепей, определяется состав проб: носителем этой информации оказываются интенсивность и цвет излучения. В самом деле, «светящиеся» ячейки однозначно кодируют олигонуклеотиды исходной пробы: зная олигонуклеотиды, которые были изначально помещены в данные ячейки, и, учитывая однозначность образования пар, можно сделать вывод о составе фрагмента исследуемой ДНК.
Набор реагентов основан на применении 2-раундовой полимеразной цепной реакции (ПЦР) [3, с. 1488-1491] и последующей гибридизации полученного ПЦР-продукта на биологическом микрочипе.
Первая стадия ПЦР с использованием высокоспецифичных праймеров применяется для повышения специфичности и количества
копий ДНК в образце (кровь, слюна и др.), представленном для анализа.
Вторая стадия ПЦР с использованием флуоресцентно-меченных праймеров применяется с целью дальнейшего увеличения копий ДНК и получения ПЦР-продукта, содержащего флуоресцентную метку, для последующей визуализации результатов гибридизации на биологическом микрочипе.
Гибридизация на биологическом микрочипе осуществляется для выявления и идентификации генетического полиморфизма, то есть различий в строении генов. Гибридизация проводится с продуктом второй стадии ПЦР. Визуализация результатов гибридизации проводится с помощью возбуждения флуоресценции меченного ПЦР-продукта второй стадии, связанного с зондами, иммобилизованными на биологическом микрочипе. Интерпретация результатов осуществляется программно (полуавтоматически) в зависимости от того, с какими из иммобилизованных зондов прошла реакция гибридизации [5, с. 94-96].
Существует множество вариантов применения биочипов, например, в проекте по расшифровке человеческого генома (рис. 1). Уже сейчас известны гены, мутации в которых являются причиной тяжелейших болезней. Например, наследуемые изменения в некоторых генах приводят к патологии клеток крови, обрекающей новорожденного на скорую смерть. В тех случаях, когда у родителей ребёнка имеется предрасположенность к подобного рода заболеваниями, можно взять пробу околоплодной жидкости и с помощью биочипа быстро выяснить, унаследовал ребёнок болезнь или нет. В зависимости от результатов теста принимается решение: сохранить плод или прервать беременность. Стандартные методы анализа генома слишком длительны, тогда как аборт можно делать лишь на ранних стадиях беременности.
Используя биочипы, можно диагностировать не только врождённые заболевания, но и болезни, являющиеся результатом прижизненных мутаций в генетическом коде. В геноме человека есть два гена, которые в норме расположены достаточно далеко друг от друга. В результате патологических перестроек в ДНК они могут оказаться рядом. Этот факт служит достоверным свидетельством начала лейкоза (рака крови) [6, с. 55-56].
Существенную помощь могут оказать биочипы и при пересадке органов. Основной проблемой, возникающей в ходе подобных операций, является отторжение имплантированных тканей иммунной системой человека. Маркером, находящимся на каждой человеческой клетке и служащим для отделения своих клеток от
чужих, являются белки главного комплекса гистосовместимости (рис. 2). Во избежание отторжения, необходимо, чтобы белки-маркеры на имплантированной ткани как можно меньше отличались от белков-маркеров пациента. Можно подбирать при помощи биочипов наиболее подходящего донора среди людей, родившихся естественным путём, то есть донора, пересадка органов от которого вызвала бы минимальный иммунный ответ.
Разрабатываются также биочипы, которые позволили бы диагностировать различные формы туберкулёза, что особенно важно в условиях пенитенциарных учреждений. В 4050 гг. XX в. благодаря появлению антибиотиков туберкулёз перестал считаться неизлечимой болезнью. Однако с тех пор появилось множество разновидностей туберкулёзной палочки, устойчивых к воздействию антибиотиков. В настоящее время, когда больной поступает к врачу, у него берут пробу слюны и в течение нескольких месяцев выясняют, являются ли его туберкулёзные палочки устойчивыми к воздействию наиболее распространенных антибиотиков (таких как, например, рифампицин). Все то время, что идет исследование, больной находится в одной палате с товарищами по несчастью, от которых может заразиться другими формами болезни. Использование же биочипов позволяет осуществлять подобную проверку не за несколько месяцев, а за несколько десятков минут.
Помимо медицины, биочипы можно использовать для контроля за некоторыми смертельно опасными бактериями. Например, споры сибирской язвы практически ничем не отличаются от своих безобидных «собратьев», и опознать их стандартными способами биологического и химического анализа практически невозможно. При помощи же биочипов идентификация может быть проведена за десять минут.
Применение метода биочипов молекулярной биологии в криминалистике и судебной медицине возможно в нескольких направлениях.
Во-первых, для идентификации личности на месте преступления по таким характеристикам, как группа крови, гены, определяющие пол и т. д. [8, с. 4]. Наряду с известными четырьмя группами крови системы АВО существуют до 15-ти подгрупп [2, с. 230-231; 7, с. 22; 8, с. 3], что позволяет с высокой степенью достоверности судить о личности преступника. Необходимо отметить, что в ряде случаев красители на одежде могут ингибировать полимеразную реакцию, необходимую для получения ДНК преступника из образца крови. Это представляет собой отдельную, но в большинстве случаев решаемую проблему. Не менее важной является иденти-
фикация личности преступника по образцам слюны, спермы или кожи с применением биочипов. Из подобных образцов методом полимеразной цепной реакции (метод ПЦР) можно получить ДНК преступника и сравнить данный образец с ДНК подозреваемого в совершении преступления или с ДНК его родственников, не прибегая к дорогостоящим методам экспертизы.
Если преступник страдает такими заболеваниями, как гепатит С, туберкулез или ВИЧ-инфекция, то у правоохранительных органов появляется дополнительная возможность оценки
присутствия данной личности на месте преступления, так как методами молекулярной биологии с применением биочипов можно установить до 40 разновидностей гепатита С по образцам крови, идентифицировать гены туберкулезной палочки в слюне на месте преступления и определить в образце крови присутствие вируса ВИЧ-инфекции, что позволит собрать объективную информацию и сформировать доказательную базу данных по присутствию данного лица на месте преступления. Время, которое будет затрачено на проведение подобных анализов,
Технология изготовления гелевых биочипов Метод полимеризационной иммобилизации
Робот переносит рЭСтвОрь » молекул зондов из
I поверхность подложки
Активированная подложка Микротитровальмый планшег
с растворами зондов
УФ излучение
■ Каждый гелевый элемент биочипа - индивидуальная пробирка для проведения реакции
■ Биочип позволяет проводить параллельно и одновременно
азличные типы реакций
Растворы
полимеризуются
Гмдрогелевые ячейки с иммобилизованными зонданг
Тлі
Рис. 1. Технология изготовления биочипов, которые можно использовать для определения ДНК, белков или биологически активных веществ в крови. (Рисунок любезно предоставлен руководителем лаборатории белковых биочипов Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН кандидатом химических наук А. Ю. Рубиной)
БЕЛКОВЫМ БИОЧИП
Биочип содержит внутреннюю калибровочную кривую, что позволяет проводить параллельный анализ двух форм антигена в исследуемом образце в формате один пациент - один биочип
Увеличенное фотоизображение биочипа
Флуоресцентное изображение биочипа после проведения анализа
- иммобилизованные антитела
иммобилизованные антитела
Результат компьютерной обработки данных: высота столбцов отражает интенсивность флуоресцентного сигнала
- проявляющие флуоресцентномеченые антитела к белку
Чувствительность -не менее 0,3 нг/мл Коэффициент вариации не превышает 15%.
Рис. 2. Биочип для идентификации белков в сыворотке крови. (Рисунок любезно предоставлен руководителем лаборатории белковых биочипов Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН кандидатом химических наук А. Ю. Рубиной)
ll9
при наличии квалифицированного персонала и необходимых реактивов, составит 2-3 суток от момента обнаружения образцов биологического материала на месте преступления.
В перспективе необходимо создание «генетического паспорта» преступника, своеобразной «генетической дактилоскопии», что может послужить ещё одним из факторов сдерживания преступности в её наиболее жестоких формах.
Библиографический список
1. Frudakis T., Thomas M., Gaskin Z., et
al. Sequences associated with human iris pigmentation.// Genetics. - 2003. - V. 165. - № 4.
- P. 2071-2083.
2. Yamamoto F., Clausen H., White T., et
al. Molecular genetic basis of the histo-blood group ABO system // Nature. - 1990. - V. 345. -P. 229-233. - ISSN 1813-4846.
3. Yip S.P. Single-tube multiplex PCR-SSCP analysis distinguishes 7 common ABO alleles and readily identifies new alleles / Blood. - 2000. -V.95. - P. 1487-1492. - ISSN 1813-5468.
4. Rubina A. Y., Kolchinski A. M., Makarov A. A., et al. Why 3-D? Gel-based microarrays in proteomics / / Proteomics. - 2008. V.8 - P. 817-831.
5. Rubina A. Y., Pankov S. V., Dementieva E. I., et al. Hydrogel drop microchips with immobilized DNA: properties and methods for large-scale production // Anal. Biochem. - 2004. V. 325. -P. 92-106.
КНИЖНАЯ ПОЛКА
6. Наседкина Т. В., Гусева Н. А., Митяева О. Н. и др. Микрочипы в диагностике лимфопролиферативных заболеваний // Молекулярная Медицина. - 2007. - № 3. - ISSN l8l3-33l2.
7. Митяева О. Н., Фесенко Д. О., Наседкина Т. В. и др. Разработка и применение гидрогелевых олигонуклеотидных микрочипов для судебно-медицинской идентификации личности на примере локуса АВО // Судебномедицинская экспертиза. - 2007. - Т. 50. - №2.
- ISSN l8l3-4327.
8. Наседкина Т. В., Фесенко Д. О., Митяева О. Н. и др. Определение фенотипических характеристик индивида по анализу генетических маркеров с помощью биологических микрочипов // Доклады Академии Наук. -2008.
- Т. 422. - № 5. - ISSN 08б9-5б52.
9. Фесенко Е. Е., Гребенникова Т. В., За-бережный Д. К. и др. Применение биологического микрочипа для молекулярного типирования вирусов гриппа А, включая вирусы «птичьего» гриппа Н5Ш и «свиного» гриппа HlNl (California 2009) // Нанобиотехнологии.
- 2009. - №2. - ISSN і8із-8586.
Файл Правка Вид Избранное Сервис Справка ^ Назад т Поиск Папки |7Щт
І.ФИМІ ПКО Ллгкгамдр КлснЫмы/ммшч
Ефименко А. В. Судебно-техническая экспертиза документов, изготовленных с использованием электрофотографических печатающих устройств: монография. - Саратов: Саратовский юридический институт МВД России, 2010. - 180 с. - ISBN 978-5-7485-0593-2.
В монографии исследуются проблемы судебно-технической экспертизы документов, изготовленных с помощью современных электрофотографических устройств.
Высокотехнологичный оптико-механический печатающий аппарат (современный лазерный или светодиодный принтер,
МФУ) рассматривается как единый аппаратно-программный комплекс, модули и узлы которого образуют составное целое.
В работе использованы научные положения в области исследования качества изображений, создаваемых системами визуализации, применён метод определения частотно-контрастной характеристики зоны нерезкости штрихов для оценки разрешения печати электрофотографических устройств. Предложены рекомендации по идентификации данных печатающих устройств и решению ряда диагностических задач.
Издание предназначено для научных работников, судебных экспертов, следователей, преподавателей и студентов юридических образовательных учреждений.
СУДЕБНО ТЕХНИЧЕСКАЯ ЭКСПЕРИЗА ДОКУМЕНТОВ, ИЗГОТОВЛЕННЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭЛЕКТРОФОТОГРАФИЧЕСКИХ ПЕЧАТАЮЩИХ УСТРОЙСТВ
l20
