CC BY
11
УДК 579.676
Моделирование безопасности продуктов на основе предиктивной микробиологии
для L. monocytogenes в замороженных смесях овощей
И. М. Почицкая, канд. с.-х. наук; И. Е. Лобазова, канд. хим. наук Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по продовольствию, г. Минск
Проблема безопасности продовольственного сырья и продуктов питания является одним из актуальных государственных вопросов, касающихся здоровья нации. Патогенные для человека микроорганизмы могут содержаться в пищевых продуктах изначально, а могут их контаминировать в последующем, при несоблюдении санитарно-гигиенических правил и технологии. Применение прогностических моделей позволяет определить степень безопасности пищевых продуктов в процессе их производства на всех этапах -от момента получения сырья до реализации и употребления готового продукта, а также получить наиболее полную информацию о росте и размножении микроорганизмов при заданных параметрах окружающей среды (рН, Aw, температура, содержание соли и консервантов, СО2).
Понятие безопасности пищевых продуктов непосредственно связано с деятельностью патогенных и токсигенных бактерий (микроорганизмы рода Salmonella, вида Listeria monocytogenes, некоторые колиформные бактерии, токсигенные стафилококки). Отсутствие нежелательных органолептических изменений не может служить показателем микробиологической безопасности продукта [1].
L. monocytogenes - грамположи-тельные, каталазоположительные неспорообразующие бактерии, дающие положительную реакцию Фо-геса - Проскауэра и отрицательную на индол и восстановление нитратов. Несмотря на то, что температурный оптимум роста бактерий +37 °С, дан-
ный микроорганизм хорошо растет и при температуре (4...15 °С), поэтому L. monocytogenes является наиболее опасным патогенным микроорганизмом, вызывающим пищевые отравления.
Способность продукта поддерживать рост L. monocytogenes в процессе хранения определяется как наиболее важный критерий возможности возникновения риска листериоза [2]. Листериоз не является широко распространенной инфекцией, так как по количеству выявленных случаев он значительно уступает саль-монеллезам и кампилобактериозам, однако превосходит их по летальности и тяжести клинического течения [3, 4].
Целью данной работы являлось прогнозирование порчи замороженной смеси овощей, инокули-рованных L. monocytogenes, путем сравнительного анализа первичных предиктивных моделей роста L. monocytogenes в бульоне Фрейзера и в замороженных смесях овощей «Лечо» и «Французская смесь» производства Agrosprint KFT, Karcag, Hyngary, Венгрия, при температуре 20 °С, а также выбор оптимальной модели на основании полученных результатов.
Два образца замороженных смесей были инокулирова-ны L. monocytogenes, штамм АТСС 19111, и хранились при температуре 20 °С. Полученные кривые роста были оценены с помощью таких первичных моделей, как логистическая (с лаг-фазой и без нее), модифицированная модель Гомперца и модель Барани. В ходе матема-
тических расчетов было отмечено, что наилучшие результаты получены с помощью логистической модели с лаг-фазой.
В замороженной смеси овощей, обладающей большим значением активности воды и значением рН, близким к нейтральному, скорость роста бактерий была выше, следовательно при одинаковой температуре порча продукта происходит быстрее.
Для прогнозирования реакции микроорганизмов на условия внешней среды в последнее время все шире применяются математические модели. Целью прогнозирования влияния физико-химических, технологических параметров производства и условий хранения пищевых продуктов на микробиологические процессы является разработка предупредительных мер, направленных на подавление развития микробных контаминантов и обеспечение безопасности пищевых продуктов.
Основными факторами, определяющими развитие микроорганизмов, являются температура, рН, активность воды, концентрация соли, наличие органических кислот и других консервирующих соединений. Математическая модель, количественно описывающая комбинированный эффект этих параметров, может использоваться для прогнозирования роста, способности выживать или инактивации микроорганизмов и дает важную информацию о безопасности продукта и его сроке годности.
Whiting, Buchanan и Damert (1997) предложили трехуровневую систему описания стадий процесса математического моделирования, которая включает следующие стадии: получение и анализ данных; первичное моделирование; вторичное моделирование; валидация модели; третичное моделирование и может быть описана следующими уравнениями:
y=y0, если t< lag,
y=y0 +k (t-lag), если lag< t < t
y=y
, t> t ,
mar — max
где t
m
y=y .
max
время, при котором
Научное обоснование математических моделей базируется на предположении о том, что закономерности роста, выживания и инактивации микроорганизмов могут быть рассчитаны и выражены с помощью уравнений и формул, учитывающих определенный набор производствен-
ных параметров и условии внешней среды.
Модели первого порядка описывают изменения в популяции микроорганизмов со временем с помощью расчетов таких кинетических параметров, как время задержки роста, специфическая скорость роста, максимальное количество клеток в популяции. Модели второго порядка описывают зависимость параметров модели первого порядка от условий окружающей среды, а модели третьего порядка представляют собой средства компьютерной обработки данных, преобразующие данные моделей первого и второго порядков в удобный для пользователя вид.
Рост бактерий характеризуется четырьмя стадиями роста: лаг-фазой, экспоненциальной фазой роста, стационарной фазой (максимальная плотность популяций) и гибелью клеток.
Исследовали образцы замороженных смесей овощей «Лечо» и «Французская смесь», приобретенных в торговой сети г. Минска, производства Agrosprint KFT, Karcag, Hyngary, Венгрия.
1.1. Определение общей обсеме-ненности, рН и активности воды в образцах. Образцы замороженных смесей гомогенизированы в блен-дере. Показатель микробиологической обсемененности - КМАФАнМ по ГОСТ 10444.15.
Для определения КМАФАнМ стерильно отобрали по 10 г каждого образца, добавили по 90 мл 0,1%-ной пептонной воды и гомогенизировали на перильтатическом гомогенизаторе (IUL Instruments, Masticator, Франция); полученную суспензию высевали на питательный агар с учетом разведений (ПА, г. Оболенск, РФ). Величину рН измеряли, смешивая 10 г образца с 90 мл дистиллированной воды. Затем измеряли активность воды (Aw). Каждое из измерений проводили трижды.
1.2. Бактериальная культура. В работе был использован штамм L. monocytogenes АТСС 19111, полученный из коллекции MicroBioLogics, Inc (США) в виде LYFO DISK. Для получения чистой культуры вскрыли флакон с лиофилизированными дисками и один стерильно перенесли в пробирку, в которую внесли 0,5 мл стерильного физиологического раствора. Затем раздавили диск тампоном и смочили полученной суспензией. Перенесли суспензию на чашку и рассеяли до получения изолированных колоний. Для получения ночной культуры изолированную колонию перенесли в 5 мл бульона Фрейзера
и инкубировали при температуре 37 °С в течение 18 ч.
1.3. Инокулирование и подсчет выросших колоний. Гомогенизированные образцы замороженных смесей были асептично расфасованы в стерильные пакеты по 10 г и инокули-рованы штаммом ночной культуры L. monocytogenes АТСС 19111 (100 мкл). Первоначальный уровень контаминации достиг значений (2,6-3,6) log КОЕ / г. Инокулированные образцы хранили в термостате при температуре 20 °С. Во время хранения в образец добавляли 90 мл физиологического раствора и гомогенизировали (IUL Instruments, Masticator, Франция). При необходимости готовили разведения суспензии с шагом 1:10 и высевали на чашки с PALCAM-agar (HiMedia, Индия), после чего инкубировали в течение 48 ч при температуре 37 °С.
1.4. Первичное моделирование. Для полученных кривых роста L. monocytogenes в бульоне Фрейзера и замороженных смесях овощей применяли первичные предиктивные модели Барани (Baranyi &Roberts, 1994), модифицированную модель Гомпертца (Zwietering, Jongenburger, Rombouts & Van / treit, 1990), логистическую модель (Zwietering et al., 1990) и экспоненциальную модель роста. Вычисления проводили в программах Excel-2010 с помощью надстройки Solver add-in, а также программы IPMP 2013 (USA) -http://www.ars.usda.gov / Services / Docs. htm? docid=23355.
Параметры роста включают лаг-фазу (LT), максимум специфической скорости роста (^max) и максимум бактериальной популяции клеток
(ymax) Í6-8).
Экспоненциальная модель роста описывается уравнением
'i
где N - концентрация клеток в определенный момент времени; t - время.
Логистическая модель роста описывается уравнением (2):
■ , (2)
если t < t , Nt = N0.
lag t 0
N
.
"a
Модель Барани, описанная в 1РМР, выражается уравнением
^ . . . (4)
I е*Р<у™-у») \
■■■ I ,Х-и :: ,■ ...: | , (5)
Ymax, Y0, Y (() - бактериальная популяция, количество клеток, выраженные через натуральный логарифм; И0 - физиологическое состояние микроорганизма в рассматриваемых условиях.
Модифицированная модель Гом-перца в программе 1РМР выражается уравнением
YW^Yo+O^-U-
-a-/>+i
СХр
-схр
И. - Г.
(5)
где X - продолжительность лаг-фазы.
1.5. Оценка предиктивных моделей. Для оценки первичных предиктивных моделей было использовано значение наименьшей ошибки, полученной с помощью квадратного корня (RMSE)
RMSE
i. змч. i -реальное, шч. i)'
. (6)
| двшше(и) - предлагаемое, жач (р)
Значение RMSE должно стремиться к нулю.
Из полученных данных видно, что все три кривые роста наиболее точно описываются моделями, имеющими лаг-фазу (рис. 1, 2).
На рис. 1 представлены кривые роста L. monocytogenes в бульоне Фрейзера и замороженных смесях овощей при 20 °С.
Из рис. 1 видно, что лаг-фаза данных кривых выражена нечетко, а к моменту времени в 100 ч все три кривые выходят в стационарную фазу роста.
На рис. 2 представлены кривые роста, полученные при помощи модели Барани с использованием уравнений (4) и (5) в IPMP-программе.
Логистическая модель без лаг-фазы описывается уравнением N
К1 __тая
\ . (3)
ЛГ„
8.4 i -♦ 2
_— -а
7.1
M ß / i L. monocytogenes - 20 "С
> Т / L. m. + «Лечо» - 20 "С
- 5.1 \// ¿ L. m. + «Франц. Смесь» -
4.4 ft 20 "С
3,4* **
2,4 ^
0 го 40 60 10 100
Время, ч
Рис. Кривые роста L. monocytogenes в бульоне
Фрейзера (1), в замороженной смеси овощей «Лечо» (2)
и в замороженной смеси «Французская смесь» (3)
Результаты применения первичных предиктивных моделей роста L. monocytogenes при 20 °С
Система Модель рН КМАФАнМ Aw Log (N0W Log (N ) Y * 4 max' max max LT, ч RMSE
Логистическая без лаг-фазы 0,8933 8,5026 0,5350 0 0,22415
L. monocytogenes в бульоне Фрейзера Логистическая с лаг-фазой Барани 7,2 - - 3,69 8.354* 8,35 19.579* 0,54 0.571 ±0.051 12,03 Не вычисляет 0,2164 0.457
Гомперца 8.315* 19.703* 0.579 ± 0.045 12.332 0.375
Логистическая без лаг-фазы 2,5644 7,8374 0,2031 0 0,20768
L. monocytogenes в замороженной смеси овощей «Лечо» Логистическая с лаг-фазой Барани 5,16 3х103 0,685 2,97 6.816* 7,80 17.955* 0,26 0.261 ± 0.001 11,80 Не вычисляет 0,00888 0.016
Гомперца 6.829* 18.420* 0.295 ± 0.017 13.599 0.237
L. monocytogenes в замороженной смеси овощей «Французская смесь» Логистическая без лаг-фазы Логистическая с лаг-фазой Барани 6,90 2,5х103 0,863 2,1444 2,63 6.009* 7,9440 7,91 18.264* 0,2628 0,316 0.316 ± 0.024 0 8,30 Не вычисляет 0,25163 0,16456 0.388
Гомперца 6.014* 18.360* 0.419 ±0.030 11.283 0.238
* In в моделях Барани и Гомперца
0 20 40 60 80 100
Время, ч
в
Рис. 2. Кривые роста L. monocytogenes при 20 °С: а - в бульоне Фрейзера; б - в замороженной смеси овощей «Лечо»; в - в замороженной смеси овощей «Французская смесь»
Наилучшим образом рост L. monocytogenes в бульоне Фрейзера и в замороженных смесях овощей описывается логистической моделью с лаг-фазой (RMSE имеет значения 0,2164, 0,0089 и 0,16456).
Полученные расчетные данные сведены в таблицу.
Таким образом, в результате анализа предиктивных моделей, описывающих рост L. monocytogenes в замороженных овощных смесях, можно сделать заключение о том, что в смеси, обладающей большей активностью воды и значением рН, близким к нейтральному по сравнению с подкисленной средой (Aw = 0,863 и рН= 6,90 и по сравнению с Aw = 0,685 и рН = 5,16), скорость роста выше, следовательно, при одинаковой температуре порча продукта происходит быстрее.
ЛИТЕРАТУРА
1. Стрингер, М. Охлажденные и замороженные продукты/ М. Стрингер, К. Денис. - СПб.: Профессия, 2004. -496с.
2. Ефимочкина, Н. Р. Эмерджентные бактериальные патогенны в пищевой микробиологии/Н. Р. Ефимочкина. - М.: изд-во РАМН, 2008. - 256с.
3. Тартаковский, И. С. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика/И. С. Тар-
таковский // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2000. - № 2. - С. 20-30.
4. Тартаковский, И. С. Листерии в инфекционной патологии человека - современная концепция / И. С. Тартаков-ский [и др.]. - ЗНиСО, 1994. - № 3. -С. 1-4.
5. Краснова, М. А. Исследование динамики развития микроорганизмов при различных температурах для создания модели прогнозирования сроков годности охлажденного мяса/М. А. Краснова // Всероссийская молодежная науч. конф. с международным участием «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук». - Кемерово, 2011. - С. 30-36.
6. Perez-Rodriguez, F. Predictive Microbiology in Foods./F. Perez-Rodriguez, A Valero // Springer Briefs in Food, Health, and Nutrition. - New York, USA, 2013. - P. 128. Chapter 3.2: Primary models. Pp. 26-35.
7. Baranyi, J. A dynamic approach to predicting bacterial growth in food/ J. Baranyi, T. A. Roberts. -International Journal of Food Microbiology, 1994. - 23. - P. 277294.
8. Daigaard, P. Comparison of maximum specific growth rates and lag times estimated from absorbance and viable count data by different mathematical models/Dalgaard, P., Koutsoumanis, K. -Journal of Microbiological Methods (2001). 43, 183-196.
Применение моделей предиктивной микробиологии для L. monocytogenes в замороженных смесях овощей
Ключевые слова
активность воды; безопасность; замороженные овощи; кривая роста; лаг-фаза; L. monocytogenes; микробиологические показатели; модели предиктивной микробиологии; рН
Реферат
Проблема безопасности продовольственного сырья и продуктов питания является одним из актуальных государственных вопросов, касаающихся здоровья нации. Патогенные для человека микроорганизмы могут содержаться в пищевых продуктах изначально, а могут их контаминировать в последующем при несоблюдении санитарно-гигиенических правил и технологии. Применение прогностических моделей позволяет определить степень безопасности пищевых продуктов в процессе их производства на всех этапах - от момента получения сырья до реализации и употребления готового продукта, а также получить наиболее полную информацию о росте и размножении микроорганизмов при заданных параметрах окружающей среды (рН, Aw, температура, содержание соли и консервантов, СО2). В данной работе проведены исследования по применению предиктивных моделей роста чистой культуры L. monocytogenes в бульоне Фрейзера и в замороженных смесях овощей «Лечо» и «Французская смесь», производства Agrosprint KFT, Karcag, Hyngary, Венгрия. Два образца замороженных смесей были инокулированы L. monocytogenes штамм АТСС 19111 и хранились при температуре 20 °С. Полученные кривые роста были оценены с помощью таких первичных моделей как логистическая (с лаг-фазой и без нее), модифицированная модель Гомперца и модель Барани. В ходе математических расчетов было отмечено, что наилучшие результаты были получены с помощью логистической модели с лаг-фазой. В замороженной смеси овощей, обладающей большим значением активности воды и рН, близким к нейтральному, скорость роста выше, следовательно, при одинаковой температуре порча продукта происходит быстрее.
Авторы
Почицкая Ирина Михайловна, канд. с.-х. наук, Лобазова Ирина Евгеньевна, канд. хим. наук,
Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по продовольствию, 220600, г. Минск, ул. Козлова, д. 29, pochitskaja@yandex.ru
Modeling of Products Security Based for Microbiology Predictive L. Monocytogenes in Frozen Mixtures of Vegetables
Key words
microorganism, L. monocytogenes, frozen mixes, safety, a growth curve, water activity, pH, log-phase, microbiological predictive models, Modified Gompertz Growth Model and Baranyi Growth Model
Abstracts
The problem of safety of food raw materials and foodstuff is one of the actual state questions providing health of the nation. The problem of safety of food raw materials and foodstuff is one of the actual state questions providing health of the nation. Pathogenic microorganisms can contain in foodstuff initially, and can contaminated them in the subsequent, at non-observance of sanitary-and-hygienic rules and technology. Application of predictive models allows to defi ne degree of safety of foodstuff in the course of their manufacture at all stages from the moment of reception of raw materials before realisation and the use of a ready product. Predictive models can receive the fullest information on growth and reproduction of microorganisms at the set parametres of environment (pH, Aw, temperature, the maintenance of salt and preservatives, C02). The present work researched of application predictive models for growth of pure culture L. monocytogenes in Fraser's broth and in the frozen mixes of vegetables «Lecho» and «The French mix», manufactures Agrosprint KFT, Karcag, Hyngary. Two samples of the frozen mixes were inoculated of L. monocytogenes strain ATCC 19111 and were stored at temperature 20 °C. The received curves of growth have been estimated by means of such primary models as logistical (with a lag-phase and without it), Modified Gompertz Growth Model and Baranyi Growth Model. During mathematical calculations it has been noticed, that the best results have been received by means of logistical model with a log-phase. In the frozen mix of vegetables possessing bigger value of water activity and value pH, close to neutral, growth rate above, hence at identical temperature product damage occurs faster.
Authors
Pachytskaya Irina Mikhaylovna, Candidate of Agricultural Science, Lobazova Irina Evgenyevna, Candidate of Chemical Science, Scientific and Practical Center of the National Academy of Food Science, 29, Kozlova St., Minsk, 220600, pochitskaja@yandex.ru
