CC BY
36
I I I I I I
■ I I I
Новости клеточных технологий
2950 генов имели иную экспрессию, из кроличьих — 2379. Таким образом, несмотря на то, что факторы, содержащиеся в цитоплазме яйцеклеток животных, были способны поддерживать жизнеспособность эмбриона в течение ограниченного времени, частично перепрог-раммируя ядро соматической клетки человека, специфического перепрограммирования и получения нормальных ЭСК не наблюдалось ни в одном случае. Только «ЗСК», полученные на основе яйцеклеток человека, имели паттерн экспрессии генов, практически не отличимый от паттерна экспрессии генома нормальных человеческих эмбриональных стволовых клеток. Анализ митохондриальной ДНК клеток клонированных эмбрионов также показал, что при межвидовом переносе ядра в образующихся бластомерах присутствуют митохондрии как с ДНК человека, так и с ДНК вида-донора овоцита.
Результат этой работы нельзя называть оптимистичным, поскольку в связи с дефицитом овоцитов человека овоциты животных являлись весьма привлекательным источником специфических для пациента стволовых клеток [12]. В то же время, этот результат, на наш взгляд, был достаточно предсказуем: в цитоплазме яйцеклетки данного вида присутствуют факторы, обеспечивающие видоспецифические эпигенетические модификации геномной ДНК. Авторы работы делают вывод, что для получения человеческих ЗСК не подходят яйцеклетки коровы, кролика и мыши. Однако из результата работы можно сделать и более общее предположение — по-видимому, межвидовой перенос ядер в принципе не может обеспечить получения нормальных, аутогенных для данного человека эмбриональных стволовых клеток.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Cibelli J., Lanza R.P., Campbell K.H.S. et al. Principles of Cloning. Academic Press, San Diego 2002.
2. Beyhan Z., Lager A.E., Cibelli J.B. Interspecies nuclear transfer: implications for embryonic stem cell biology. Cell Stem Cell 2DD7; 1: 502.
3. Tecirlioglu R.T., Jitong G., Trounson A.O. Interspecies somatic cell nuclear transfer and preliminary data for horse-cow/mouse iSCNT. Stem Cell Reviews 2DD6; 2: 277-88.
4. Lanza R.P., Cibelli J.B., Diaz F. et al. Cloning of an endangered species [Bos gaurus] using interspecies nuclear transfer. Cloning 2DDD; 2: 79-90.
5. Li Y., Dai Y., Dol W. et al. Cloned endangered species takin (Budorcas taxicolor] by inter-species ncuelar transfer and comparison of the blastocyst development with yak [Bos grunniens] and bovine. Mol. Reprod. Dev. 2DD6; 73: 189-95.
6. Meirelles F.V., Bordignon V., Watanabe Y. et al. Complete replacement of the mitochondrial genotype in a Bos indicus calf reconstructed by nuclear transfer to a Bos taurus oocyte. Genetics 2DD1; 158: 351.
7. Chen Y., He Z.X., Liu A. et al. Embryonic stem cells generated by nuclear transfer of human somatic nuclei into rabbit oocytes. Cell Res. 2003; 13: 251-63.
8. Jingjuan J., Tonghang G., Xianhong T. et al. Experimental cloning of embryos through human—rabbit interspecies nuclear transfer. Zool. Res. 2005; 26: 416-21.
9. Vogel G. Stem cells: ethical oocytes, available for a price. Science 2006; 313: 155.
10. Chen T., Zhang Y.-L., Jiang X. et al. Interspecies nuclear transfer reveals that demethylation of specific repetitive sequences is determined by recipient ooplasm but not by donor intrinsic property in cloned embryos. Mol. Reprod. Dev. 2006; 73: 313—7.
11. Yu J., Vodyanik M.A., Smago-Otto K. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells Science 2007; 318: 1917-20.
12. Lanza R.P., Cibelli J.B., West M.D. Prospects for the use of nuclear transfer in human transplantation. Nat. Biotechnol. 1999; 17: 1171—4.
Подготовила А,С, Гоигорян
По материалам: Chung Y„ Bishop C.E., Treff N.R, et al. Reprogramming of human somatic cells using human
and animal oocytes. Cloning and Stem Cells 2009; 11(2)
Применение MMCK при распространенных гнойных инфекциях
Наряду с экспериментальными исследованиями, направленными на использование дифференцировочных потенций мезенхимальных мультипотентных стромаль-ных клеток (ММСК), активно разрабатывается направление, занимающееся вопросом возможности применения принципиально иного свойства ММСК — воздействия на иммунную систему [1, 2]. В целом, результаты различных исследований свидетельствуют, что для ММСК характерны иммунорегуляторные потенции, реализующиеся через супрессию образования и активации ТЫ -хел-перов [3], натуральных киллеров [4] и В-лимфоцитов в ответ на антигенную стимуляцию [5], ингибирование дифференцировки и функции дендритных клеток [6], увеличение пула регуляторных Т-клеток [7]. В этой связи ММСК применяются для ослабления реакции «трансплантат против хозяина» [8], а также исследуется возможность их применения при аутоиммунных заболеваниях [9, 10].
Несмотря на установленное влияние ММСК на иммунный ответ, остаются не ясными в полной мере ме-
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 2, 2009
ханизмы этого эффекта. Полагают, что воздействие ММСК на иммунокомпетентные клетки реализуется как посредством клеточно-клеточных, так и гуморальных влияний, опосредованных, в частности, трансформирующим фактором роста-р1, фактором роста гепатоцитов [11], простагландинами Е2 (ПГ-Е2) [12].
Особый интерес представляет исследование К. Nemeth с соавт. (2009), направленное не только на идентификацию механизмов иммуномодулирующего действия ММСК, но и на поиск возможности его использования в лечении пациентов при перитоните с септическим состоянием.
В качестве экспериментальной модели авторами был применен широко распространенный метод — перевязка слепой кишки в сочетании с её перфорацией [13, 14]. Следует отметить, что эта операция, прежде всего, моделирует перитонит, приобретающий разлитой характер и при отсутствии адекватного лечения часто осложняющийся сепсисом из-за высокой сорбционной способности брюшины. Перитонит представляет собой очаг инфекции, а выход бактерий и их токсинов в кровь
А
■ И I II II
■тп
Новости клеточных технологий
с развитием синдрома системной воспалительной реакции приводит к появлению вторичных очагов в тканях организма, что является признаком сепсиса. Смерть животных наблюдается в течение первых-вторых суток. Однако в своей работе авторы не обосновывали развитие сепсиса установлением вторичных очагов инфекции или бактериемии, опираясь лишь на общепринятое мнение, что перевязка слепой кишки в сочетании с её перфорацией является моделью сепсиса. В этой связи представляется более корректным в качестве причины смерти называть разлитой перитонит.
Один миллион ММСК (ауто- и аллогенных), меченных CFDA-SE (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester), внутривенно вводили или непосредственно во время операции, или за сутки до нее, или через час после оперативного вмешательства. Наилучшие результаты — снижение летальности на 50% (половина животных выжили до конца эксперимента, длившегося четверо суток) — были достигнуты при инъекции ММСК непосредственно во время «моделирования» перитонита
с сепсисом. В контроле (группа без трансплантации клеток; животные, которым было выполнено введение или костного мозга, или фибробластов, или термолизата ММСК) наблюдалась практически абсолютная летальность в первые двое суток.
Так как при разлитом перитоните непосредственной причиной смерти является системная органная недостаточность — как следствие синдрома инфекционного эндотоксикоза, авторы определяли влияние трансплантированных клеток на ряд биохимических показателей, отражающих функционирование жизненно важных паренхиматозных органов. Оказалось, что введение ММСК приводит к снижению концентрации сывороточного кре-атинина (функция почек) приблизительно на 50%, АСТ на 35% и АЛТ на 25% (функция печени), сывороточной амилазы на 40% (функция поджелудочной железы) по отношению к контролю. Кроме того, существенно снизилась патологически повышенная проницаемость сосудов легких, печени и почек, что было продемонстрировано с применением красителя Эванса.
Механизмы взаимодействия ММСК м макрофагов в модели перитонита с септическим состоянием.
Циркулирующие в плазме крови бактериальные токсины [например, липополисахарид, ЛПС) и медиатор воспаления фактор некроза опухолей альфа [ТЫР-а] взаимодействуют со своими рецепторами на мембране ММСК, что приводит к транслокации фактора транскрипции ЫР-кВ внутрь ядра. Этот процесс также зависит от оксида азота [N0].
ЫР-кВ индуцирует продукцию циклоокситеназы 2 [С0Х2], что. в свою очередь, приводит к возрастанию концентрации и высвобождению простатландина Р2 [ПГР2}. ПГР2 взаимодействует с рецепторами РР2 и РР4 на поверхности макрофагов, в результате чего последние синтезируют большие количества И-10
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 2, 2009
I I I I I I
■ I I I
Новости клеточных технологий
Исследователи установили, что спустя 24 часа после трансплантации ММСК концентрация провоспалительных цитокинов (фактор некроза опухолей-— (TNF-—) и интерлейкин-6 (IL-6DD снизилась в 2^2,5 раза по сравнению с контролем, а уровень IL-10, обладающего антивоспали-тельным действием (ингибирует роллинг, адгезию и трансэндотелиальную миграцию нейтрофилов [15]), уже к шести часам после введения клеток увеличивался в два раза и продолжал расти еще в течение 12 час.
Чтобы определить, через какую субпопуляцию им-мунокомпетентных клеток реализуется положительное действие ММСК при сепсисе, авторы предприняли аналогичные эксперименты с трансплантацией клеток, но животным с генетически отсутствующими или искусственно блокированными различными популяциями лимфоцитов и моноцитов. В результате продемонстрированное ранее снижение летальности при введении ММСК не наблюдалось в группе животных, лишенных функционирующих моноцитов/макрофагов введением липосом с клодронатом (clodronate filled liposomes). Связав воедино данные о существенном повышении уровня IL-10 в крови и реализации положительного эффекта введенных ММСК при сепсисе, исследователи предположили, что трансплантированные клетки реализуют иммуно-супрессирующее действие через стимуляцию продукции IL-10 макрофагами. Это положение было подтверждено тем, что введение антител против IL-10 и его рецептора нивелирует положительный эффект ММСК при сепсисе. При этом сами ММСК не продуцируют IL-10, так как при введении клеток, полученных от дефицитных по гену IL-10 животных, все равно наблюдалось 50% снижение летальности.
Для детализации механизмов взаимодействия ММСК и макрофагов, приводящего к повышению продукции IL-10, авторы культивировали эти клетки как вместе, так и отдельно в камерах трансвелл-системы,
разделенных мембраной, а также инкубировали моноциты/макрофаги в кондиционированной ММСК среде. Для индукции иммунной активности клеток в среду добавляли липополисахариды (ЛПС) кишечной палочки. В результате, существенное повышение экспрессии IL-10 иммунокомпетентными клетками наблюдалось лишь в группе, в которой моноциты/макрофаги находились в непосредственном контакте с ММСК. В то же время исследователи в серии экспериментов in vitro показали, что в ответ на введение TNF-—, оксидом азота, ЛПС кишечной палочки, взаимодействующих со специфическими мембранными рецепторами ММСК, в клетках повышается уровень циклооксигеназы-2, играющей ключевую роль в синтезе ПГ, в частности, ПГЕ2. При этом увеличение продукции IL-10 макрофагов определяется только при активации рецепторов ПГЕ2 и ПГЕ4.
Таким образом, ММСК стимулируют повышение продукции IL-10 макрофагами опосредовано — через продукцию ПГЕ2, устраняя патологическую избыточность иммунной реакции, увеличивая пул нейтрофилов в крови и снижая «нейтрофилез тканей», что приводит к уменьшению их повреждающего действия и, возможно, переключению на нейтрализацию бактерий, циркулирующих в крови при сепсисе. Однако возникает вопрос относительно некоторого противоречия представленных исследователями данных: сначала они отмечают необходимость непосредственного контакта ММСК и макрофагов для повышения продукции IL-10, а затем описывают типично опосредованное стимулирующее влияние, реализующееся через ПГ-Е2. Кроме того, так как авторы сводят механизм положительного эффекта трансплантации ММСК при сепсисе, главным образом, к индукции экспрессии макрофагального IL-10, возникает вопрос относительно целесообразности трансплантационных мероприятий и возможности их замены введением «чистого» IL-10.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Le Blanc К., Ringden О. Immunomodulation by mesenchymal stem cells and clinical experience. J. Intern. Med. 2007; 262: 509-25.
2. Uccelli A., Pistoia V., Moretta L. Mesenchymal stem cells: A new strategy for immunosuppression? Trends Immunol. 2DD7; 28: 219-26.
3. Potian J.A., Aviv H., Ponzio N.M. et al. Veto-like activity of mesenchymal stem cells: Functional discrimination between cellular responses to alloantigens and recall antigens. J. Immunol. 2DD3; 171: 3426-34.
4. Rasmusson I., Ringden 0., Sundberg B. et al. Mesenchymal stem cells inhibit the formation of cytotoxic T lymphocytes, but not activated cytotoxic T lymphocytes or natural killer cells. Transplantation 2DD3; 76: 1208-13.
5. Corcione A., Benvenuto F., Ferretti E. et al. Human mesenchymal stem cells modulate В-cell functions. Blood 2DD6; 107: 367-372.
6. Jiang X.X., Zhang Y., Liu B. et al. Human mesenchymal stem cells inhibit differentiation and function of monocyte-derived dendritic cells. Blood 2005; 105: 4120-6.
7. Maccario R., Podesta М., Moretta A. et al. Interaction of human mesenchymal stem cells with cells involved in alloantigen-specific immune response favors the differentiation of CD4+ T-cell subsets expressing a regulatory/suppressive phenotype. Haematologica 2005; 90: 516-25.
8. Le Blanc K., Rasmusson I., Sundberg B. et al. Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells. Lancet 2004; 363: 1439-41.
9. Kastrinaki M.C., Papadaki H.A. Mesenchymal stromal cells in rheumatoid arthritis: biological properties and clinical applications. Curr. Stem Cell Res. Ther. 2009; 4(11: 61-9.
10. Larghero J., Vija L., Lecourt S. et al. Mesenchymal stem cells and immunomodulation: Toward new immunosuppressive strategies for the treatment of autoimmune diseases? Rev. Med. Intern. 2009; 30C3): 287-99.
11. Di Nicola M., Carlo-Stella C., Magni M. et al. Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli. Blood 2002; 99: 3838-43.
12. Aggarwal S., Pittenger M.F. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses. Blood 2005; 105: 1815-22.
13. Hubbard W.J., Choudhry M., Schwacha M.G. et al. Cecal ligation and puncture. Shock 2005; 1: 52-7.
14. Rittirsch D., Huber-Lang M.S., Flier M.A. et al. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nat. Protoc. 2009; 4(11: 31-6.
15. Cassatella M.A. The neutrophil: one of the cellular targets of interleukin-10. Int. J. Clin. Lab. Res. 1998; 28: 148-61.
Подготовил ИЯ. Бозо
По материалам: Nemeth КLeelahavanichkul А„ Yuen P.S. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E2-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10
production. Nat. Med. 2009:15(1): 42-9
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 2, 2009
