CC BY
80
Паразиты растений
УДК
ПРИМЕНЕНИЕ МИКОГЕЛЬМИНТА Aphelenchoides saprophillus ДЛЯ УМЕНЬШЕНИЯ СТЕПЕНИ ПОРАЖЕНИЯ РОЗОВОЙ СНЕЖНОЙ ПЛЕСЕНЬЮ (Microdochium (Fusarium) nivale (Fr.) Samuels & I.C. Hallet) ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ
А.Г. ЩУКОВСКАЯ1 младший научный сотрудник
О.Б. ТКАЧЕНКО1 доктор биологических наук А.А. ШЕСТЕПЁРОВ2 доктор биологических наук, профессор 1 Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН, Москва, 127276, Ботаническая ул., 4, e-mail: otkach@postman. ru;
2Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина, Москва, 117218, ул. Б. Черёмушкинская, 28, e-mail: vigis@ncport. ru
Разработан метод выделения, культивирования и применения культуры нематод Aphelenchoides saprophillus для биологической борьбы с возбудителем розовой снежной плесени озимой пшеницы. Выделение нематод A. saprophillus из растений и почвы проводили методом Бермана. A. saprophillus лучше размножаются на мицелии гриба Alternaria tenius. A. tenius культивировали на картофельно-глюкозном агаре в термостате при t 26-27 оС в течение 5-10 сут. Нематод вносили по 100 особей в пробирку с культурой грибов, где в течение 30-40 сут их число увеличивалось в 100 раз. Нематод от культуральной среды очищали методами смыва и Бермана. Суспензию нематод разводили водой и применяли из расчета 1 л на 1 м2 обрабатываемой площади с помощью садового опрыскивателя в первой декаде октября. Аналогично культивировали нематод A. saprophillus на культуре гриба Microdochium nivale. Внесение нематод A. saprophillus в дозе 160000 тыс. экз./м2 посевов озимой пшеницы позволяет снизить степень болезни весной в 3 раза, что способствует повышению урожайности на 14,4 %.
Ключевые слова: озимая пшеница, мицелий, грибы, Al-ternaria tenuis, Microdochium nivale, нематода, Aphelenchoides saprophillus, розовая снежная плесень.
Розовую снежную плесень (РСП) озимой пшеницы вызывает гриб Microdochium (Fusarium) nivale. Это заболевание широко распространено на посевах злаковых на территории РФ. Развитие мицелия гриба начинается в осенне-зимний период под снеговым покровом при температуре от 0 до 2 оС [2]. Развиваясь на листьях растений пшеницы, под снегом, гриб нарушает ход физиологических процессов, вызывает ослабление иммунитета. В период весенней вегетации ослабленные и поражённые РСП растения озимой пшеницы сильно отстают в росте, не имеют боковых побегов, не кустятся, вследствие чего происходит нарушение формирования полноценного урожая.
114
Вредоносность РСП проявляется в изреживании посевов, а нередко полной их гибели (рис.1).
Рис. 1. Внешне здоровые растения озимой пшеницы (А) и растения, поражённые розовой снежной плесенью (Б)
Потери урожая при этом могут достигать 20-50 %. Сложность проведения защитных мероприятий связана с тем, что активность патогена происходит в период, когда непосредственная обработка растений затруднена или невозможна. Летом обработки фунгицидами и проведение агротехнических мероприятий против гриба M. nivale, находящегося в стадии покоя, не эффективны. Для подавления РСП химические фунгициды применяют с середины сентября до начала октября, когда температура воздуха в дневные часы составляет не менее 10 оС, а после обработки в течение суток не должно быть осадков. Использование фунгицидов при температуре ниже 10 оС не эффективно, т. к. они теряют свои защитные свойства [1]. К тому же применение фунгицидов имеет много отрицательных сторон.
Из растений озимой пшеницы, поражённой РСП, выделили микогельминт A. saprophillus, который при низких температурах не теряет своей активности. Этот вид прокалывает стилетом стенки гиф мицелия и всасывает его содержимое в пищевод. Повреждённый мицелий истекает соком, т. е. теряет жидкость, в результате чего погибает.
Целью нашей работы была разработка метода выделения, культивирования и применения микогельминта A. saprophillus для биологической борьбы с возбудителем розовой снежной плесени озимой пшеницы.
Биология и экология исследуемых объектов
Microdochium (Fusarium) nivale
Анаморфа - Microdochium (Fusarium) nivale
Телеоморфа - Calonectria graminicola (Berk et Br.) Wollenenw.
Поражение озимых происходит с осени. На нижних листьях появляются расплывчатые водянистые пятна, от небольших (0,3-0,7 см в диаметре) до сплошных. Затем на них образуется мицелий, на котором развивается кони-диальное спороношение гриба. Поражённые листья и целые растения склеены между собой бело-розовым мицелием в виде сплошной паутинистой плёнки (рис.1). В период весенней вегетации при холодной погоде в загущенных посевах M. nivale вызывает загнивание основания стеблей, что ведёт к «подсушке» растений. Такие растения не выколашиваются или дают полупустой колос, в котором формируется неполноценное зерно. В период цвете-
115
ния - восковой спелости на стеблях, во влагалищах листьев формируются перитеции C. graminicola. Вначале они светло-коричневые или красноватые, но по мере созревания темнеют и становятся бурыми. Стебель в местах образования перитециев обесцвечивается и приобретает розоватую окраску. Мицелий распространяется по листьям, склеивая их. Гриб, переходя с одного растения на другое, захватывает большие участки поля.
Заражение происходит от инфекции, находящейся в почве, на остатках растений (мицелий, конидии, аскоспоры в перитециях) и в семенах (мицелий в оболочках семени, реже споры). Конидии гриба веретёновидные, изогнутые, бесцветные (в массе розовые), размером 14-25 х 3-4 мкм. Кроме кони-диального спороношения, гриб образует сумчатую стадию (стадия покоя) в виде поверхностных перитециев располагающихся в нижней части стебля. Аскоспоры заражают верхние листья последующих верхних ярусов весной и летом во влажный и прохладный период. Перитеции шаровидно конические кирпично-красные. Аски булавовидные, с тонкой оболочкой, размерами 5070 х 8-10 мкм, 6-8 споровые. Зрелые аскоспоры эллипсоидальные, прямые или согнутые, гладкие с 1-3 перегородками.
Aphelenchoides saprophillus Franklin, 1957. (Барановская, 1981; Шесте-пёров, 1980) (рис. 2).
Класс - Nematoda Подкласс - Secementea Отряд - Tylenchida Подотряд - Aphelenchina Подсемейство - Aphelenchoidea Надсемейство - Aphelenchoidinea Род - Aphelenchoides
Жизненный цикл микогельминта - 8-15 сут.
Самки. L = 0,43-0,53 мм; а = 26-33 (28); b = 8-12 (9,5); c = 12-18 (16); V = 66-70 %; копьё - 11-13 мкм. Число яиц, откладываемых одной самкой, -60. Эмбриональное развитие - 2-3 сут. Яйца - 46 х 18 мкм.
Рис. 2. Микогельминт Aphelenchoides saprophillus (А - общий вид нематоды, Б - головной отдел нематоды, в которой расположен стилет)
(сканирующий электронный микроскоп c замораживающей приставкой криоскан)
Тело стройное, суживается к обоим концам. Головная капсула обособленная, лабиотуберкулы шире основания головной капсулы. Кутикула тонкокольчатая, ширина колец 0,7-0,9 мкм. Боковое поле 1/5 диаметра тела с 4 линиями. Прокорпус цилиндрический, метакорпальный бульбус округлой формы. Нервное кольцо расположено сразу же за метакорпальным бульбусом. Экскреторная пора на уровне нервного кольца. Длина пищеводных желез со-
116
ставляет 3,5 диаметра на уровне заднего края метакорпального бульбуса. Яичник продельфный. Ооциты расположены в один ряд, в зоне созревания в два ряда. Задняя матка 2-2,5 диаметра в области вульвы. Хвост слегка загнут на брюшную сторону, конический, оканчивается туповатым мукро.
Самцы. L = 0,48-0,63 (0,55) мм; a = 27-34 (30); b = 8-11 (9); c = 13-18 (15); спикулы (с дорсальной стороны) - 23 мкм; копьё - 12 мкм.
Самцы с типичными афеленхоидными спикулами. Рулёк отсутствует. В боковом поле 4 линии. Хвост слегка загнут. Мукро простое.
Материалы и методы
Методика выделения микогельминтов из растений и почвы Для извлечения нематод из разных частей растений и почвы применяли модифицированный метод Бермана. Навески, очищенные от лишних примесей, раскладывали слоем 3-5 мм на ватном фильтре в сите. Сито вставляли в воронку диаметром 12-15 см, на раструб которой надевали кусок резинового шланга длиной 10-15 см. В нижний конец трубки помещали энтомологическую пробирку для сбора выделенных нематод. Затем в воронки заливали водопроводную воду так, чтобы жидкость покрыла насыпанную на сито массу. Продолжительность экспозиции для растений составляет 24, почвы 48 ч. При определении нематод учитывали число самок, самцов и личинок. При изучении материала под микроскопом суспензию нематод из энтомологической пробирки наносили на предметное стекло, просматривали и определяли виды.
Микотрофные нематоды лучше всего размножаются на мицелии гриба Alternaria tenuis Nees (Шестепёров, 1995).
Методика культивирования Aphelenchoides saprophillus на грибе Alternaria tenuis
В качестве питательного субстрата для культивирования гриба использовали картофельно-глюкозный агар (картофель очищенный - 200 г, агар - 20 г. глюкоза - 20 г на 1 л воды). Для выращивания культуры гриба применяли биологические пробирки на 20 мл и биологические матрасы на 2 л с ватномарлевыми пробками. В пробирки наливали по 10 мл среды, в матрасы - по 200 мл. Пробирки и матрасы с горячей средой после автоклавирования при 1 атм. в течение 45 мин наклоняли таким образом, чтобы субстрат полностью покрывал поверхность ёмкостей. Гриб, посеянный на питательный субстрат уколом, выращивали 5-10 сут в термостате при температуре 26-27 оС. Нематод в грибные культуры вносили после того, как разросшийся грибной мицелий покрыл всю поверхность питательного субстрата. В одну пробирку вносили 100 особей. Пробирки хранили в термостате при температуре 27 оС. Через 30-40 сут получали по 3000-5000 нематод. В биологические матрасы помещали по 300-500 нематод. Через 30-40 сут число их возрастало в 80-100 раз.
Методика очистки нематод от культуральной среды Для очистки нематод от частиц мицелия гриба сначала смывали их несколько раз со стенок пробирок и биологических матрасов. Затем полученную суспензию нематод пропускали через вороночный анализ Бермана с использованием гигроскопической ваты и подсчитывали их число.
Методика культивирования Aphelenchoides saprophillus на мицелии гриба Microdochium nivale в условиях in vivo Из суспензии нематод отбирали по 100 экз. и пересаживали их в пробирки с мицелием гриба M. nivale, после чего их оставляли при температуре 1218 оС. Когда мицелий гриба был съеден весь, нематод выделяли вороночным методом и переносили по 100 экз. на пробирку с мицелием гриба M. nivale. Пробирки с нематодами хранили при трех разных температурах: 5 оС - кли-мокамера; 15 оС - климокамера; 27 оС - термостат. Каждые 2 недели визуально отслеживали состояние мицелия, а после того как мицелий полностью исчезал с поверхности питательной среды, нематод выделяли и подсчитывали.
117
Методика подготовки водной суспензии микогельминта Aphelenchoides saprophillus
По мере съедания мицелия гриба нематоды смывали со стенок пробирок биологических матрасов в одну ёмкость и доводили до объёма 1 л (для удобства подсчёта). Полученный раствор тщательно перемешивали на магнитной мешалке и подсчитывали число нематод в 1 мл (1 мл ~ ±100 экз. нематод).
Готовую суспензию переливали в пластиковые бутылки (вместимостью 5 л) и транспортировали к месту назначения.
Методика применения водной суспензии микогельминта Aphelenchoides saprophillus
Ёмкости с водной суспензией выдерживали 2-4 ч для выведения нематод из обездвиженного состояния, в которое нематоды часто впадают при неблагоприятных условиях. После выдержки водную суспензию разводили водой до необходимого объёма, который определяется площадью полива. Рекомендуемая норма расхода суспензии на 1 м2 обрабатываемой площади - 1 л раствора.
Полученный раствор взбалтывали и заливали в ручной садовый опрыскиватель с давлением не больше трех атмосфер, с которого предварительно удалили вращающиеся сетки форсунок, т. к. на них могли остаться нематоды при внесении. Обрабатываемую площадь до и после внесения раствора проливали обычной водой, облегчая тем самым проникновение нематод. При распылении раствора поливочное отверстие шланга помещали у поверхности почвы, исключая попадание раствора на листья растений, т. к. на листьях нематоды погибают.
Обработку посевов озимой пшеницы проводили в первой декаде октября (не раньше), когда дневная температура воздуха в течение 3 сут составляла 8-10оС.
Представленные результаты исследований обработаны статистически в программе Microsoft Excel (Statistica).
Результаты и обсуждение
В проведённых нами лабораторных опытах микогельминт A. saprophillus был внесен в количестве 100-200 экз. на пробирку на мицелий гриба M. ni-vale при температурах 5 оС, 15 оС и 27 оС. Температура 5 оС оказалась наиболее благоприятной для культивирования A. saprophillus. Коэффициент размножения при этой температуре у A. saprophillus был 6,5, при этом микогельминты использовали все представленные пищевые ресурсы в течение 5075 сут. При температуре 15 оС скорость размножения A. saprophillus уменьшилась и коэффициент размножения составил 5,7, что естественным образом сказалось на численности популяции (табл. 1). В конце эксперимента в пробирках, хранившихся при температуре 15 оС, были отмечены единичные погибшие особи, что не наблюдали в пробирках при температуре 5 оС. При температуре 27 оС у A. saprophillus не зарегистрировано размножения.
1. Влияние температуры на размножение A. saprophillus при культивировании на мицелии гриба Microdochium nivale
Вид микогельминтов Температура, оС
5 15 27
Aphelenchoides saprophillus 661 570 146*
Примечание. * - Р < 0,05.
Анализ полученных данных по культивированию A. saprophillus на мицелии гриба M. nivale показал, что температура влияла на размножение микогельминта и на сроки использования представленных пищевых ресурсов. Установлено, что температура 5 оС (близкая к температуре под снеговым покровом) является благоприятной для размножения A. saprophillus, а его общая численность при данной температуре была достаточно высокая.
118
Проведённые нами мелкоделяночные полевые опыты показали, что внесение осенью A. saprophillus на посевы озимой пшеницы, поражённой РСП, уменьшило степень поражения болезнью весной следующего года.
2. Влияние численности микогельминтов на развитие РСП озимой пшеницы
Число растений, шт./м2 Число продук. стеблей, шт./м2 Высота растений, см Длина колоса, см Число зерен в колосе, шт. Масса зерна в колосе, г Масса 1000 зерен, г Урожай- ность, ц/га
Контроль (гриб M. nivale без внесения нематод)
73,5±13,4 270,2±15,2 74,5±6,3 7,95±0,8 23,7±1,9 2,7±1,8 47,4±4,6 68±6,3
Гриб M. nivale + A. saprophillus (38000 тыс. экз.)
321±15,6 326±14,0 100,7±7,0 7,87±0,9 23,75±2,0 2,2±1,9 47,7±4,5 71,1±7,0
Гриб M. nivale + A. saprophillus (80000 тыс. экз.)
38,7±14,3 333,7±15,5 101,7±5,7 8,5±0,8 25,5±2,1 2,2±1,9 44,7±4,4 78,2±7,1
Гриб M. nivale + A. saprophillus (160000 тыс. экз.)
45,2±16,2 344,5±16,4 104±5,2 8,37±0,8 23,7±2,0 2,3±2,0 48,8±4,5 79,4±7,2
Примечание. * - Р < 0,05.
В наших экспериментах внесенные нематоды существенно снижали степень развития заболевания и улучшали показатели продуктивных качеств растений озимой пшеницы, что в свою очередь влияло на повышение урожая.
В варианте, где было внесено 160000 тыс. экз. нематод, процент развития РСП составил всего 20,5 %, тогда как в контроле развитие болезни было в 2,5 раза больше (табл. 3). В вариантах с численностью внесения 80000 тыс. экз. и 38000 тыс. экз. нематод развитие болезни составило 26 и 31,25 % соответственно. В контроле поражённые растения имели меньшее число продуктивных стеблей по сравнению с вариантом M. nivale + A. saprophillus (160000 тыс. экз.) - 344,5 экз.. Отмечено снижение массы зерна в колосе, массы 1000 зёрен (47,45 г - контроль и 48,8 г в варианте M. nivale + A. saprophillus (160000 тыс. экз.).
Расчет биологической эффективности показал (табл. 3), что в варианте где была внесена максимальная концентрация микогельминтов 160000 шт./м2 биологическая эффективность - 62,7 %, в варианте с концентрацией 80000 шт./м2 - 52,7 %, а с концентрацией 38000 шт./м2 - 43,1 %. В варианте, где вносили нематод в максимальной концентрации, хозяйственная эффективность выше на 6,7 %, в сравнении с вариантом, где вносили среднюю концентрацию и 45,3 %, где вносили минимальную концентрацию микогельминтов.
3. Биологическая и хозяйственная эффективность применения суспензии микогельминта A. saprophillus на растениях озимой пшеницы, пораженной РСП
Вариант Биологическая эффективность, % Поражение РСП, % Хозяйственная эффективность, % Урожайность, ц/га
M. nivale (контроль) 0 55 0 68
M. nivale + (38000 экз./делянка) 43,1 31,25 4,3 71,1
M. nivale + (60000 экз./делянка) 52,7 26 13,04 78,2
M. nivale + (160000 экз./делянка) 62,7 20,5 14,45 79,4
НСР05 - - - 10
Таким образом, методика культивирования микогельминта A. saprophil-lus позволяет наработать суспензию нематод, содержащую большое число особей. Применение методики внесения водной суспензии на основе A.
119
saprophillus в осенний период на посевах озимой пшеницы позволяет снизить степень развития болезни весной с 65 до 20,4 %, что, в свою очередь, способствует повышению урожая и продуктивных качеств пшеницы.
Литература
1. Andreeva E.I., Molchanov O.Ju. Snezhnaja plesen' ozimyh zemovyh (metody izuchenija i mery bor'by). Obzom. inf. Ser. «Himicheskie sredstva zash-hity rastenij». - M.: NIITJeHIM, 1987. - 45 s.
2. Bilaj V.I. Fuzarii. - Kiev: Naukova dumka, 1977. - 412 s.
3. Shestepjorov A.A., Savotikov Ju.F. Karantinnye fitogel'mintozy. Kn. 1. -M.: Kolos, 1995. - 463 s.
Methods of use of mycohelminth Aphelenchoides saprophillus for decrease of degree of damage on winter wheat infected with pink snow mold (Fungus mi-crodochium (Fusarium) Nivale (Fr.) Samuels & I.C. Hallet)
A.G. Shchukovskaya junior research associate
O.B. Tkatchenko doctor of biological sciences
Federal State Budget Institution of Science N. V. Zizin Main Botanic Garden RAS Moscow, 127276, Botanicheskaya ul., 4. E-mail: otkach@postman.ru
A.A. Shesteperov
doctor of biological sciences, professor
State Scientific Institution All -Russian Scientific Research Institute of Helminthology named after K.I. Skryabin, 117218, Moscow, B. Cheremushkinskaya, 28, tel./fax 8-499-124-56-55, e-mail:visis@,ncport.ru
Pink snow mold of winter wheat is caused by the fungus Microdochium (Fusarium) nivale. This disease is widely spread within Russian Federation on grain varieties; its injuriousness is expressed in planting destruction and rather often in total crop failure. In our laboratory experiments the mycohelminth Aphelenchoides saprophillus Franklin was put in number of ±100-200 examples per test tube (20 x 200 mm) on mycelium of fungus M. nivale at temperature 5, 15 and 27 °C. The temperature 5 °C was more favorable for cultivation of mycohelminth A. saprophillus on mycelium of fungus M. nivale. At this temperature the reproduction ratio of A. saprophillus was 6,5, while mycohelminth was used by whole foods available (mycelia of fungus гриба M. nivale) within 50-75 days. However at temperature 15 °C the speed of reproduction of A. saprophillus slowed down (reproduction ratio 5,7) that naturally affected the population size. At the end of experiment single dead species were found in test tubes stored at temperature 15 °C, that cannot be observed in test tubes stored at temperature 5 °C. At the same time reproduction of A. saprophillus was not registered at temperature 27 °C. Methods of cultivation of A. saprophillus allows to create suspension of nematodes containing a large number of species. Applying in autumn water suspension made on the base of A. saprophillus on winter wheat allows to decrease the degree of spread of disease in spring from 65 up to 20,4 % which improves the productivity index of wheat and affect crop improvement.
Keywords: mycohelminths, pink snow mold, winter wheat, mycelium, Alter-naria tenius, Microdochium nivale, Aphelenchoides saprophillus.
120
