CC BY
29УДК 547.541.2.
Афаг Ярдым гызы Меликова
Азербайджанский государственный университет нефти и промышленности, Баку,
Азербайджан, a_melikova@mail. ru
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ ТУРБИДИМЕТРИИ И НЕФЕЛОМЕТРИИ В
БИОМЕДИЦИНЕ
Аннотация. Представлены результаты исследований в области применения методов турбидиметрии и нефелометрии в биомедицине. Показано, что эти методы могут использоваться для определения белков, иммуноглобулинов, фибриногенов и других медицинских препаратов.
Ключевые слова: турбидиметрия, нефелометрия, биомедицинские исследования, белки, иммуноглобулины, нефелометр
Afaq Yardym Malikova
Azerbaijan State University of Oil and Construction, Baku, Azerbaijan,
a_melikova@mail.ru
APPLICATION OF TURBIDIMETRY AND NEPHELOMETRY IN BIOMEDICINE
Abstract. The results of research in the field of application of turbidimetry and nephelometry methods in biomedicine are presented. It has been shown that these methods can be used to determine proteins, immunoglobulins, fibrinogens, and other medical preparations.
Key words: turbidimetry, nephelometry, biomedical research, proteins, immunoglobulins, nephelometer
Турбидиметрия представляет собой метод количественного анализа состава и свойств веществ, основанный на измерении количества света, поглощаемого подкрашенной суспензией. Принцип этого метода основан на измерении интенсивности света определённой длины волны, прошедшего через кювету содержащую коллоидный раствор, чаще всего через суспензию, образованную частицами определяемого вещества.
Нефелометрия (от др.-греч. Убфв^п — «облако» и цетрею — «измеряю») представляет собой метод исследования и анализа вещества по интенсивности светового потока, рассеиваемого взвешенными частицами данного вещества. Интенсивность рассеянного светового потока зависит от множества факторов, в частности от концентрации частиц в анализируемой пробе. Большое значение при нефелометрии имеет объём частиц, рассеивающих свет. Важное требование к реакциям, применяемым при нефелометрии, заключается в том, что продукт реакции должен быть практически нерастворим и представлять собой суспензию (взвесь). Для удержания твёрдых частиц во взвешенном состоянии применяются различные стабилизаторы (например, желатин),
предотвращающие коагуляцию частиц. Оба этих методов находят широкое применение в биомедицине. Так, в работе [1] сообщается, что нефелометрия и турбидиметрия — это аналитические методы, в которых используются приборы, определяющие количество взвешенных частиц в жидкости или газе путем измерения величины рассеяния светового луча под разными углами. Количественное определение концентрации аналитов, таких как иммуноглобулины (IgG, IgA и IgM) и другие белки (амилоиды) в сыворотке крови человека, обычно выполняется в лаборатории клинической иммунологии с помощью нефелометрии или турбидиметрии
Предлагается последовательный турбидиметрический и нефелометрический анализ (БТЫ) для двух различных аналитических приложений с использованием портативного микроуправляемого турбидиметра и нефелометра, основанного на светоизлучающих диодах, фотодиодах и микроконтроллере в качестве центрального процессора с ЖК-дисплеем (жидкокристаллическим дисплеем) в качестве устройства отображения. Для определения N ацетилцистеина применяли методы БТ^ и две аналитические кривые в диапазонах
»-»5 3 5 3
концентраций от 8,0х10- до 5,0х10- моль/л и от 5,0х10- до 1,2х10- моль/л были получены на нефелометрию и турбидиметрию соответственно. Для этих процедур были получены пределы обнаружения (ЬОБ) 2,6 х 10-6 и 7,5 х 10-6 моль/л. Также были выполнены БТК-анализы для определения тиамина и две аналитические кривые в диапазонах концентраций от 5,0х10-6 до 2,5х10-4 моль/л и от 5,0х10-6 до 1,0х10-4 моль/л. с ЬОБ 5,91 х 10-8 и 3,11 х 10-8 моль/л были получены для нефелометрии и турбидиметрии соответственно.
цистеин тиамин
В работе [3] рассмотрена модель оптического прибора для измерения концентрации угольной пыли в шахтах на основе турбидиметрического и нефелометрического методов. Приведены расчетные данные интенсивности прошедших и рассеянных волн в зависимости от концентрации угольной пыли и размера частиц угольной пыли.
Показано [4], что микроальбуминурия является индикатором поражения почек и фактором риска прогрессирования заболевания почек, сердечно-сосудистых заболеваний и т.д. Таким образом, точное измерение альбумина в моче имеет решающее значение. Однако не существует эталонных процедур измерения и эталонных материалов для определения альбумина в моче. Нефелометрия, турбидиметрия, метод коллоидного золота, радиоиммуноанализ и иммунохемилюминесцентный анализ были выполнены для методологической оценки, основанной на тесте на неточность, скорости извлечения, линейности, частоте интерференции гемоглобина и подтвержденном референтном интервале. Затем авторы проверили 40 образцов мочи больных диабетом каждым методом и сравнили результаты между анализами. Результаты показывают, что нефелометрия является методом с лучшими аналитическими характеристиками среди пяти методов, со средним внутрианалитическим коэффициентом вариации (СУ) 2,6 %, средним межаналитическим CV 1,7 %, средним извлечением 99,6 %, линейностью Я = 1,00 от 2 до 250 мг/л и уровень интерференции <10% при концентрации гемоглобина <1,82 г/л. Корреляция ( г ) между анализами составляла от 0,701 до 0,982, а графики Бланда-Альтмана указывали, что каждый анализ дает значительно отличающиеся друг от друга результаты. Таким образом, нефелометрия является клиническим методом определения альбумина в моче с лучшими аналитическими характеристиками в этом исследовании.
В работе [5] продемонстрирован недорогой многоцелевой прибор для измерения мутности, колориметра и нефелометра (ТСЫ), применимый для студентов, аспирантов и исследовательских лабораторий. В инструменте используется простая и надежная электроника, а звуковая карта ПК используется в качестве аналого-цифрового преобразователя. Работоспособность прибора оценивали путем измерения содержания сульфатов в воде. Анализы сравнивали с УФ/видимым спектрофотометром исследовательского класса. Несмотря на свою простоту, прибор оказался интересным и жизнеспособным средством для практического обучения в студенческих лабораториях.
Сообщается [6], что определение мутности очень распространено при контроле питьевой воды. Кроме того, измерения мутности применяются в химической (например, при мониторинге процессов), фармацевтической (например, при разработке лекарств) и пищевой промышленности (например, при фильтрации вина и пива). Наиболее распространенным методом измерения является нефелометрическая турбидиметрия. Нефелометр — это прибор для измерения количества света, рассеянного взвешенными частицами в жидкости, с помощью источника света и светоприемника, ориентированных под углом 90° друг к другу. Имеющиеся в продаже нефелометры обычно стоят — в зависимости от измеряемого диапазона, надежности и точности — тысячи евро. Напротив, новый разработанный авторами работы нефелометр на основе линз GRIN, названный GRINephy, сочетает в себе низкую стоимость с превосходной воспроизводимостью и точностью даже при очень низких уровнях мутности, что достигается за счет его способности вращать образец. Таким образом, можно измерить множество положений кюветы, что приводит к более точному среднему значению мутности, рассчитанному с помощью алгоритма, который также устраняет ошибки, вызванные царапинами и загрязнениями на кюветах. С новым компактным и дешевым датчиком на базе Arduino можно измерять в диапазоне 0,1-1000 NTU и подтверждать соответствие ISO 7027-1:2016 низким значениям мутности.
Авторы работы [7] демонстрируют разработку и применение недорогой системы мутномера для смартфонов, которая будет использоваться для проб воды, взятых из природных ресурсов. Предлагаемая система зависит от спектроскопических измерений как прямого, так и бокового рассеяния света. С помощью 3D-печати была изготовлена специально разработанная подставка, а пластиковые оптические волокна использовались для передачи света от встроенной вспышки смартфона и передачи собранного рассеянного света на датчик камеры. Параметры производительности мутномера для смартфона были исследованы и сравнены с коммерческими системами, и было обнаружено, что самый низкий предел обнаружения составляет 5,58 NTU для обнаружения прямого рассеяния. Результаты, полученные в предлагаемом спектроскопическом мутномере на основе рассеянного света, и практичность этого чрезвычайно недорогого устройства окажут большое влияние на науку и технику о воде.
В работе [8] авторы сообщают о кинетическом исследовании реакции иммунопреципитации с участием иммуноглобулинов G, A и M. Они использовали перемешивание с остановленным потоком, адаптированное для одновременного мониторинга нефелометрических и турбидиметрических сигналов для некоторых исследований, и центробежное перемешивание для других. Переменными, оказывающими наиболее значительное влияние на кинетические ответы в областях избытка антител и избытка антигена, являются концентрация полиэтиленгликоля, ионная сила и отношение антигена к антителу. Авторы документируют влияние этих переменных на максимальные скорости и изменения сигнала за фиксированный интервал времени для обоих режимов мониторинга и на максимальное изменение сигнала для нефелометрии. Мы используем методологию поверхности отклика, чтобы помочь определить интерактивные эффекты между этими переменными (полиэтиленгликоль, NaCl, концентрации антител) и выбрать наилучшую комбинацию для количественного определения антигена во всех областях кривой иммунопреципитации. Авторы также наблюдали, что турбидиметрические отклики более воспроизводимы и намного проще, чем нефелометрические отклики. Обсуждается значение этих результатов для количественного определения иммуноглобулинов.
Сообщается [9], что турбидиметрия — это лабораторный метод, который применяется для измерения агрегации тромбоцитов, взвешенных либо в плазме (обогащенная тромбоцитами плазма, PRP), либо в буфере (промытые тромбоциты) с использованием одного или комбинации агонистов. Использование отмытых тромбоцитов, отделенных от окружающей их плазмы, и в отсутствие антикоагулянтов позволяет изучить внутренние свойства тромбоцитов. Среди большого набора агонистов наиболее часто используются
арахидоновая кислота (АК), аденозиндифосфат (АДФ), тромбин и коллаген. Реакция агрегации количественно оценивается путем измерения относительной оптической плотности (OD) суспензии тромбоцитов во времени при постоянном перемешивании. Тромбоциты в гомогенной суспензии ограничивают прохождение света после добавления агониста, происходит изменение формы тромбоцитов, что приводит к небольшому временному увеличению OD. После этого начального этапа активации постепенно образуются сгустки тромбоцитов, что позволяет свету проходить через суспензию в результате снижения ОП. Процесс агрегации в конечном итоге выражается в процентах по сравнению с ОП бедной тромбоцитами плазмы или буфера. Таким образом, в начале каждого эксперимента необходима строгая калибровка. Как правило, калибровка на 0% устанавливается путем измерения ОП нестимулированной суспензии тромбоцитов, в то время как измерение ОП суспензионной среды, не содержащей тромбоцитов, соответствует значению 100%. Агрегацию тромбоцитов обычно визуализируют в виде кривой агрегации в реальном времени. Турбидиметрия является одним из наиболее часто используемых лабораторных методов исследования функции тромбоцитов и считается историческим золотым стандартом и используется для разработки новых фармацевтических средств, направленных на ингибирование агрегации тромбоцитов. В этой работе авторы описывают подробные протоколы для подготовки промытых тромбоцитов человека и турбидиметрического анализа индуцированной коллагеном агрегации промытых тромбоцитов человека, предварительно обработанных пищевым красителем Brilliant Blue FCF, который был недавно идентифицирован как ингибитор каналов Pannexinl (Panxl).
Целью исследования [10] было оценить взаимозаменяемость нефелометрического (иммуноанализ), фона Клаусса и оптического анализов на фибриноген. Когда был проведен нефелометрический анализ по сравнению с любым из двух функциональных анализов (199 образцов) и когда сравнили фон Клаусс и оптический методы (879 образцов), корреляция Пирсона и внутриклассовая корреляция были от 0,96 до 0,97. Однако были статистически значимые отклонения (P < 0,001); в среднее отношение нефелометрических значений к функциональным значениям составило 1,05 до 1,07, а среднее оптическое отношение к анализу фон Клауса составляло 1,05 (данные проанализированы как журналы и выражены как антилогарифмы). 95-процентные пределы согласия показали, что 5 % соотношений фон Клауса и оптические методы находились за пределами диапазона от 0,83 до 1,32. Анализы ограничены случаями со значением фибриногена менее 2,0 г/л приводило к несколько большей систематической ошибке и более высоким верхним пределам согласия. Таким образом, нефелометрический метод может успешно быть применен для анализа фибриногена.
Для турбидиметрических и нефелометрических измерений разработаны два миниатюрных и компактных оптоэлектронных прибора, изготовленных путем интеграции светодиодов [11]. Эти устройства работают по принципу пары эмиттер-детектор-диод (PEDD). Детекторы были охарактеризованы с использованием анализа бычьего сывороточного альбумина и белка Exton в качестве модельного аналита и модельного аналитического метода соответственно. Разработанные детекторы адаптированы для проведения измерений в условиях проточно-инжекционного анализа (ППИ). В оптимизированных условиях турбидиметрическая проточная система предлагает диапазон линейного отклика до 400 мг/л с пределом обнаружения 20 мг/л. Линейный диапазон и предел обнаружения, найденные для оптимизированной нефелометрической системы FIA, составляют 15-500 мг/л и 8 мг/л соответственно. Системы ФИА на основе PEDD с детектором, работающим по обоим режимам измерения, успешно применяются для анализа мочи, обеспечивая определение общего белка на физиологическом и патологическом уровнях с высокой производительностью (более 60 инъекций в час).
В работе [12] описывается разработка и испытания недорогого нефелометра на основе светодиодов (LED) для анализа мутности. В нем также описывается использование этого
нефелометра для экспериментов по контекстному обучению (CBL), предназначенных для учебных лабораторий. Светодиодный нефелометр прост, недорог и надежен и дает такие же результаты, как и коммерческое устройство. Сбор и анализ данных выполняются быстро и интуитивно, что дает время и возможность для обсуждения аналитического процесса и задействованных химических процессов. Описанные здесь эксперименты основаны на реальных приложениях, чтобы подчеркнуть полезность химического анализа и количественного определения мутности в повседневной жизни.
Опалесценция биофармацевтических растворов может указывать на субоптимальную коллоидную стабильность и, следовательно, обычно является нежелательным признаком, который требует изучения и, возможно, исправления [13]. Несмотря на то, что для измерения опалесценции доступно множество вариантов приборов, возможности сравнения разных приборов и подробные сведения об аналитических погрешностях ограничены. В этой работе авторы выделяют основные результаты исследования с использованием нескольких приборов, в котором объясняются различия в сообщаемых значениях опалесценции с особым акцентом на то, как оптическая конфигурация и свойства детектора каждого прибора влияют на отклик образца и первичные стандарты формазина, необходимые для калибровки прибора. При этом охарактеризовано и представлено распределение частиц по размерам, зависящие от угла свойства светорассеяния и показатель преломления первичного эталонного материала формазина. Наконец, расширенное применение прибора для рассеяния света под углом 90 ° представлено как подходящий подход для проведения нефелометрических измерений опалесценции в малом объеме с контролируемой температурой. Кроме того, мы демонстрируем, как этот подход позволяет одновременно оценивать ключевые физические свойства, такие как гидродинамический размер, которые имеют отношение к исследованиям опалесцирующих биофармацевтических препаратов, но исторически требовали использования отдельных инструментов. Представленные здесь результаты устраняют основные пробелы в знаниях и открывают возможности для повышения эффективности и межлабораторной сопоставимости измерений опалесценции биофармацевтических препаратов.
Отмечается [14], что большое количество антибиотиков, а именно: хлортетрациклин, доксицилин, гентамицин, неомицин, стрептомицин, тобрамицин и т.п., можно определить тубидиметрически с довольно хорошей точностью.
хлортетрациклин доксициллин
ОН
тобрамицин
стрептомицин
Таким образом, представленный литературный обзор показывает, что турбидиметрический и нефелометрический анализы являются важными для биомедицинских и фармакологических исследований.
СПИСОК ИСТОЧНИКОВ
1. Hamilton R.G. Methods (In Vitro and In Vivo): Nephelometry and Turbidimetry // Encyclopedia of Medical Immunology. 2014. N 1. Pp. 484-486
2. Santos V., Guerreiro T., Suarez W., Orlando R. Evaluation of turbidimetric and nephelometric techniques for analytical determination of n-acetylcysteine and thiamine in pharmaceutical formulations employing a lab-made portable microcontrolled turbidimeter and nephelometer // J. Braz. Chem. Soc. 2011. Vol. 22. N 10. Pp. 119-126
3.Yushchenko V.P., Legky V.N., Demidov D.E. Nephelometry and turbidimetry to assess concentration and dispersion of coal dust in mines // IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. 2018. Volume 134. Pp. 12070-120702
4. Liu R., Gang L., Cui X-F., Dong L. Methodological evaluation and comparison of five urinary albumin measurements // J. Clin. Lab. Anal. 2011. Vol. 25. N 5. Pp. 324-329
5. Kovacic M., Asperger D. Low-Cost Turbidimeter, Colorimeter, and Nephelometer for the Student Laboratory // J. Chem. Educ. 2019. Vol. 96. N 11. Pp. 2649-2654
6. Metzger M., Konrad A., Blendinger F., Modler A. Low-Cost GRIN-Lens-Based Nephelometric Turbidity Sensing in the Range of 0.1-1000 NTU // Sensors. 2018. Vol. 18. N 4. Pp. 1115-1119
7. Bayram A., Yalcin E., Demic S., Gunduz S. Development and application of a low-cost smartphone-based turbidimeter using scattered light // Applied Optics. 2018. Vol. 57. N 21. Pp. 5935-5940
8. Skoug J.W., Pardue H.L. Effects of reaction variables on nephelometric and turbidimetric responses for the immunochemical reaction of immunoglobulin G // Clin. Chem. 1988. Vol. 34. N 2. Pp. 300-308
9. Molica F., Nolli S., Fontana P., Kwak B.R. Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation // J. Vis. Exp. 2017. Vol. 122. N 6. Pp. 55525-55529
10. Magnani B., Fenton T., Gathylapp M.T., Brugnara C. Degree of Agreement in Plasma Fibrinogen Among Two Functional and One Immunonephelometric Assays // Coagulation and Transfusion Medicine. 1997. N 5. Pp. 527-533
11. Strzelak K., Koncki R. Nephelometry and turbidimetry with paired emitter detector diodes and their application for determination of total urinary protein // Analytica Chimica Acta. 2013. Vol. 788. N 7. Pp. 68-73
12. O-Donoghue J., Fitzsimmons L. Simplified Low-Cost LED Nephelometer and Turbidity Experiments for Practical Teaching // J. Chem. Educ. 2022. Vol. 99. N 3. Pp. 1304-1312
13. Barros M., Zhang X., Kenrick S., Valente J. Opalescence Measurements -Improvements in Fundamental Knowledge, Identifying Sources of Analytical Biases and Advanced Applications for the development of therapeutic proteins // Journal of Pharmaceutical Sciences. 2021. N 7. Pp. 13-20
14. Assay of Antibiotics by Turbidimetric (or Nephelometric) Methods // Chapter Pharmaceutical Microbiology. 2016. 357 p.
Информация об авторах А.Я. Меликова — кандидат химических наук, доцент кафедры «Технология неорганических веществ».
Information about the authors A.Y. Malikova - Ph.D., Associate Professor of the Department "Technology of inorganic substances".
