CC BY-ND
38
40
ЗНиСО
УДК 616.932:579.61
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ СПЕКТРОСКОПИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА
В.Г. Германчук, Д.В. Уткин, А.Н. Спицын, Е.А. Михеева, Н.А. Осина
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»,
г. Саратов, Россия
Определен оптический спектр холерного токсина с помощью спектроскопического анализа, изучена возможность использования метода для специфического выявления биологических токсинов (холерного токсина) в объектах окружающей среды при наличии в арсенале исследователя препаратов специфических антител.
Ключевые слова: токсины, холерный токсин, спектроскопия.
V.G. Germanchuk, D.V. Utkin, A.N. Spitsyn, E.A. Mikheeva, N.A. Osina □ APPLICATION OF SPECTROSCOPIC ANALYSIS METHODS FOR DETECTION OF CHOLERA TOXIN □ Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe», Saratov, Russia.
Defined is the optical spectrum of cholera toxin using spectroscopic analysis. Studied is the possibility of deploying the method for specific detection of biological toxins (cholera toxin) in the environment if there are preparations of specific antibodies in the arsenal of a researcher. Key words: toxins, cholera toxin, spectroscopy.
Обеспечение биологической безопасности Российской Федерации и санитарно-эпидемиологического благополучия населения страны предусматривает защиту населения от угроз распространения патогенных биологических агентов (ПБА). Угроза возникновения чрезвычайных ситуаций различного характера является актуальной проблемой для всех государств мирового сообщества, не исключая и Российскую Федерацию. Сохраняется потенциальная опасность применения ПБА в качестве агентов биотерроризма [5, 7, 8]. Перечень ПБА, включаемых специалистами в группу возможных биологических средств, которые с большой степенью вероятности могут быть использованы с террористической целью, в настоящее время несколько расширен за счет возбудителей вирусного происхождения и биологических токсинов. К их числу относят биологические токсины растительного и животного происхождения: бо-тулинические, столбнячный, сибиреязвенный, шигеллезный токсины, стафилококковые энте-ротоксины, рицин, нейротоксины и др.
Холероген входит в список токсинов, подлежащих экспортному контролю, и в перечень агентов, выявляемых в лабораториях специализированных противоэпидемических бригад. Для выявления штаммов холерного вибриона, продуцирующих холерный токсин, используют по-лимеразную цепную реакцию (ПЦР) [1, 2]. Тем не менее молекулярно-генетические методы не позволяют провести индикацию холерного токсина в нативном материале. В настоящее время для выявления холерного токсина в объектах окружающей среды рядом зарубежных и отечественных производителей выпускаются наборы для иммунохроматографического анализа [3]. Существуют подходы косвенного выявления холерного токсина по наличию образуемых специфических антител к нему с использованием иммуноферментного анализа (ИФА) и иммуно-чипов [10, 11]. Метод времяпролетной MALDI масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS) позволил определить наличие холерного токсина в водо-
проводной воде в концентрации 0,01 мкг/мл по специфическим пикам масс-спектров [4].
Определяющим фактором своевременного проведения противоэпидемических мероприятий является выявление ПБА в короткие сроки. В связи с этим очевидна необходимость оснащения служб санитарно-эпидемиологического надзора средствами мониторинга и сигнальной индикации патогенных биологических агентов в объектах окружающей среды.
Как известно, холерный экзотоксин, продуцируемый Vibrio choleraе, относится к группе токсинов, генерирующих образование вторичных мессенджеров, способных в значительной степени усиливать и искажать клеточную реакцию на различные сигналы. Холерный токсин обладает АДФ-рибозилтрансферазной активностью по отношению к ГТФ-азе клеток млекопитающих. После АДФ-рибозилирования ГТФ-аза вызывает пролонгированную активацию аденилат-циклазы и резкое увеличение цАМФ в энтеро-цитах. Увеличение концентрации цАМФ приводит к выведению ионов хлора, бикарбоната и воды из клеток, обусловливая тем самым потерю электролитов и обезвоживание. Холерный токсин представляет собою олигомерный белок, состоящий из шести субъединиц. Одна из этих субъединиц, обладающая каталитической активностью, относится к типу A. Остальные пять субъединиц относятся к типу B, которые осуществляют связывание холерного токсина с белком-рецептором на поверхности энтероци-тов тонкого кишечника [13].
Методы спектроскопического анализа широко используются для исследования физических и физико-химических свойств биологических объектов [12]. Регистрируемые спектральные характеристики дают информацию о качественном и количественном составе биологической системы. Применение методов спектроскопического анализа давно практикуется в медицинских и биологических лабораториях для определения концентрации про- и эукарио-тических клеток в среде, белков, нуклеиновых
12763065
ЗНиСО
41
кислот, определения степени их чистоты. Спектроскопический анализ микробиологиче-= ских объектов имеет свои особенности. Опти-еэ ческая плотность взвеси микроорганизмов обусловлена поглощением света биологическими молекулами (белками, нуклеиновыми кислотами, липополисахаридами), входящими в состав ^ клеток в ближней ультрафиолетовой (УФ) области спектрального диапазона, и светорассеянием клеток в видимом диапазоне. Определение пиков поглощения в ультрафиолетовом (УФ) диапазоне при длинах волн 280 и 260 нм свидетельствует о наличии в исследуемом материале белковых молекул, содержащих ароматические аминокислоты (триптофан, тирозин, фенилаланин), нуклеиновых кислот. Поглощение света компонентами клеток при длине волны 500-650 нм практически отсутствует, и оптическая плотность суспензии клеток обусловлена только светорассеянием. Оптическая плотность, измеренная в данном диапазоне, отражает концентрацию клеток микроорганизмов в суспензии. Выявление клеток микроорганизмов и определение их количества в исследуемом материале широко применяется в санитарно-гигиенических лабораториях при определении обсе-мененности объектов окружающей среды, пищевых продуктов. Обнаружение микроорганизмов традиционными методами занимает от 3-4 до 18-24 ч [9]. Методы спектроскопического анализа позволяют без учета этапа пробоподготов-ки выявлять клетки микроорганизмов в течение нескольких минут. В литературных данных сведения об определении холерного токсина, как потенциального агента биотерроризма, методом спектроскопического анализа в объектах окружающей среды нам не встречались.
Цель работы - определение холерного токсина с применением методов спектроскопического анализа в объектах окружающей среды.
Материалы и методы. В работе использовали коммерческий препарат холерного токсина (ХТ) - «Cholera toxin from Vibrio choleras» (Sigma, USA). В качестве специфических им-мунореагентов применяли моноклональные иммуноглобулины (JgG) к энтеротоксину Vibrio choleraa (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб») [6]. В качестве образцов сравнения использовали стандартные белки: бычий сывороточный альбумин (БСА) (ДиаМ, Россия), стафилококковый энте-ротоксин В (Sigma, США), препарат антигена F1 Yersinia pestis (экспериментальная серия, ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб»).
В работе использовали спектрометр высокого разрешения HR-4000 (Ocean Optics, США), который позволяет проводить измерения спектральных характеристик излучения в диапазоне длин волн от 200 до 1 100 нм. Фактический диапазон и разрешение спектрометра зависят от выбора дифракционной решетки и входной щели. В качестве детектора используется ПЗС-линейка с 3 648 элементами, которая позволяет получить оптическое разрешение до 0,02 нм (FWHM). Используя линейку ПЗС-эле-ментов, каждый из которых настроен на определенную длину волны, можно сразу зарегист-
рировать весь спектр и обойтись без дорогостоящей механики, управляющей движением щели, выделяющей монохроматический свет.
При расположении на пути следования излучения исследуемого материала, содержащего биологические вещества (антитела, антигены и их комплексы), происходит изменение спектральных характеристик света. Спектрометр измеряет количество света и преобразует полученный электрический сигнал в цифровую форму, после чего передает цифровые данные программному обеспечению, которое и отображает спектр.
Перед началом измерений в программе управления спектрометром сохраняли опорный и темновой спектры. Для этого в чистую кювету наливали 100 мкл растворителя сыворотки, в данном случае физиологический раствор. Кювету помещали в держатель кювет и регистрировали опорный спектр растворителя. Относительно опорного спектра вычитается собственное поглощение физиологического раствора и стенок кюветы. Темновой спектр (фоновый шум) определяли при выключенном источнике излучения в соответствии с руководством пользователя к прибору.
Спектры каждой пробы экспортировали в виде табличных данных в приложение Origin™ (OriginLab Corporation, США) и сохраняли в отдельном файле. В дальнейшем с помощью данного программного пакета осуществляли математическую обработку полученных результатов.
Результаты и обсуждение. На первом этапе исследования после снятия опорного спектра к 500 мкл физиологического раствора добавляли 20 мкл моноклональных иммуноглобулинов к энтеротоксину Vibrio сЬо1егае (разведение составляло 1 : 25). Исходная концентрация антител составляла 24 мг/мл, рабочая концентрация - 0,96 мг/мл. Активность моноклональных антител к холерному токсину определяли в непрямом варианте ИФА с использованием антимышиных антител, меченных пероксидазой хрена.
Раствор иммуноглобулинов переносили по 100 мкл в 5 кювет UVette (Eppendorf, Германия) для спектрофотометрического анализа, предназначенных для выполнения исследований в УФ, видимом и ИК-диапазоне (220-1 600 нм). В первую кювету вносили 5 мкл дистиллированной воды, во вторую - 5 мкл раствора холерного токсина в исходной концентрации 1,28 мг/мл (конечная концентрация 64 мкг/мл), в третью - 5 мкл раствора стафилококкового энтеротоксина В в исходной концентрации 1,2 мг/мл (конечная концентрация 60 мкг/мл), в четвертую - 5 мкл раствора препарата антигена фракции 1 (F1) чумного микроба в исходной концентрации 1 мг/мл (конечная концентрация 50 мкг/мл), в пятую - 0,5 мкл раствора БСА в исходной концентрации 10 мг/мл (конечная концентрация 50 мкг/мл). Таким образом, все антигены были взяты примерно в одной концентрации (50-64 мкг/мл). Концентрация антител также во всех кюветах была одинаковая. Провели измерения спектров поглощения во всех исследуемых растворах в начальный момент времени (в момент внесения образцов) (рис. 1).
12763065
42
ЗНиСО
Затем кюветы с растворами инкубировали 15 мин в термостате при температуре 37 °С, закрыв герметизирующем пленкой РЛЯЛР1ЬМ®М (Беш18 КЛ, США). После этого регистрировали спектр поглощения исследуемых растворов. В результате отмечали изменение спектра поглощения в кювете, содержащей холерный токсин и моноклональные иммуноглобулины к нему (изменение спектра поглощения произошло в результате специфического взаимодействия в
реакции «антиген-антитело») и практически отсутствие изменения спектров поглощения растворов в других кюветах (рис. 2).
На рис. 3 объединены спектры поглощения до и после инкубации с антигенами. В результате проведенных исследований установлено, что при специфическом взаимодействии происходит изменение интенсивности спектра поглощения, связанное с образованием специфических комплексов «антиген-антитело».
н
о с
аз -
с S
с «
73
к
CJ
ij —
С
650 700 750 800 850 900 950 1000 Длина волны, нм
1 - иммуноглобулины + дистиллированная вода, 2 - иммуноглобулины + холерный токсин, 3 - иммуноглобулины + стафилококковый энтеротоксин В, 4 - иммуноглобулины + фракция 1 чумного
микроба, 5 - иммуноглобулины + БСА
Рис. 1. Спектры поглощения исследуемых растворов в момент внесения образцов
W О
é .j
о -
—
Ь и с
з; са
и j
Я
—
С
О
1000
Длина волны, нм
1 - иммуноглобулины + дистиллированная вода, 2 - иммуноглобулины + холерный токсин, 3 - иммуноглобулины + стафилококковый энтеротоксин В, 4 - иммуноглобулины + фракция 1 чумного
микроба, 5 - иммуноглобулины + БСА
Рис. 2. Спектры поглощения исследуемых растворов после инкубации при температуре 37 °С в течение 15 мин
12763065
ЗНиСО
43
(-U
С
0,30 -
0.25
0.20
Ig+-XT 15 мин при 37 °С
а 0.15
и
!J й jS
б
0,10
0.05
0.00
400
юоо
Длина волны, нм
Рис. 3. Спектры поглощения исследуемых растворов до инкубации моноклональных антител к холерному токсину с белковыми препаратами и после инкубации
Известно, что рассеяние света в диапазоне длин волн 500-650 нм описывается уравнением (1):
Бср = ß/Xn, где (1)
Dq, - оптическая плотность, обусловленная светорассеянием, ОЕ
ß, n - константы, зависящие от размера частиц и их концентрации соответственно;
X - длина волны, нм.
C увеличением размера агрегированных поглощающих частиц (комплексов биологических макромолекул) после инкубации происходит уменьшение коэффициента n, что, в свою очередь, приводит к увеличению оптической плотности раствора.
Выводы. Таким образом, метод спектроскопического анализа может быть использован для специфического выявления биологических токсинов, например, холерного токсина в объектах окружающей среды (воде), как потенциальных агентов биотерроризма при наличии в арсенале исследователя препаратов специфических антител.
ЛИТЕРАТУРА
1. Абдрашитова А.С. и др. Оценка диагностической эффективности наборов реагентов для выявления ДНК возбудителей сибирской язвы, бруцеллеза и холеры методом ПЦР с учетом результатов в режиме «реального времени» // Здоровье населения и среда обитания. 2013. № 1 (238). С. 32-34.
2. Водопьянов С. О. и др. Испытание метода ПЦР в работе индикационной лаборатории мобильного комплекса СПЭБ при исследовании экспериментальных проб на холеру // Здоровье населения и среда обитания. 2011. № 8. С. 43-45.
3. Германчук В.Г. и др. Анализ современных методов и средств экспрессной индикации токсинов // Проблемы особо опасных инфекций. 2012. № 2 (112). С. 51-54.
4. Германчук В.Г. и др. Индикация холерного токсина с помощью MALDI-TOF МАСС-спектрометрии // Здо-
ровье населения и среда обитания. 2015. № 3 (264). С. 27-31.
5. Ефременко Д.В. и др. Пост контроля атмосферного воздуха на наличие патогенных биологических агентов и его значение в системе противодействия биологической угрозе // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунологии. 2014. № 1. С. 80-85.
6. Михеева Е.А. и др. Получение и характеристика анти-телопродуцирующих гибридом и моноклональных иммуноглобулинов к энтеротоксину Vibrio choleraе // Биотехнология. 2014. № 3. С. 49-54.
7. Онищенко Г.Г. и др. Биологическая безопасность. М.: Медицина, 2006. 304 с.
8. Онищенко Г.Г. и др. Биотерроризм: национальная и глобальная угроза // Вестник Рос. Акад. наук. 2003; № 73(3). С. 195-204.
9. Специфическая индикация патогенных биологических агентов: Практическое руководство / Под ред. академика РАН, профессора Г.Г. Онищенко и академика РАН, профессора В.В. Кутырева. Изд. 2-е, переработанное и дополненное. Саратов: Буква, 2014. 284 с.
10. Уткин Д.В. и др. Разработка биочипа для выявления противохолерных антител в сыворотке крови человека // Клиническая лабораторная диагностика. Т. 60, № 2. 2015. С. 50-53.
11. Уткин Д.В. и др. Патент РФ № 2528099 «Биологический микрочип для выявления и многопараметрического анализа противохолерных антител» // Изобретения. Полезные модели. 2014. № 25.
12. Шмидт В. Оптическая спектроскопия для химиков и биологов. М.: Техносфера, 2007. 368 с.
13. De Haan L, Hirst TR. Cholera toxin: a paradigm for multifunctional engagement of cellular mechanisms (Review). //Mol. Membr. Biol. 2004. V. 21 (2). P. 77-92.
Контактная информация:
Германчук Валерий Геннадьевич, тел.: (8452) 51-52-11, е-mail: [email protected]
Contact information:
Germanchuk Valery, рЫ^^: (8452) 51-52-11, е-mail: [email protected]
12763065
