CC BY
53
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ
УДК 631.422 DOI: 10.24411/0235-2516-2020-10006
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА РН-ДИФФЕРЕНЦИРОВАННОЙ УФ-ВИДИМОЙ СПЕКТРОСКОПИИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ОРГАНИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА ЧЕРНОЗЕМА ПРИ РАЗНЫХ УСЛОВИЯХ ЗЕМЛЕПОЛЬЗОВАНИЯ
М.А. Яшин, к.с.-х.н., Н.А. Сафронова, В.А. Холодов, к.б.н., Н.В. Ярославцева, к.б.н.
Почвенный институт им. В.В. Докучаева, e-mail: mixalih86@mail.ru
Представлена методика pH-дифференцированной УФ-видимой спектрометрии для изучения органического вещества почв. В которой предложено решение для достижения агрегативной устойчивости гуминовых веществ в кислой и нейтральной средах. В ходе аналитической работы предложенным методом охарактеризовано строение фракций растворимого органического вещества, лабильного органического вещества и гуминового вещества чернозема типичного разного вида использования. Установлены показатели E4/E6 и E2/E3 для всех фракций органического вещества почвы разных вариантов землепользования и проведен кластерный анализ. Было показано, что по химическому строению органические вещества наиболее сходны во фракциях органических веществ чернозема, выделенных из вариантов полевого опыта, находящихся в севообороте и под монокультурой кукурузы.
Ключевые слова: органическое вещество почв, лабильные гуминовые вещества, растворенное органическое вещество, многолетние полевые опыты, рН-дифференцированная УФ-видимая спектрометрия, показатели цветности, хромофоры, ауксохромы, типичные черноземы.
THE USE OF PH-DIFFERENTIAL UV-VISIBLE SPECTROSCOPY METHOD TO EXAMINE SOIL ORGANIC MATTER IN CHERNOZEM UNDER DIFFERENT LANDUSE
Ph.D. M.A. Yashin, N.A. Safronova, Ph.D. V.A. Kholodov, Ph.D. N.V. Yaroslavtseva
Dokuchaev Soil Science Institute, e-mail: mixalih86@mail.ru
The pH-differential ultraviolet-visible spectroscopy method was preformed to study soil organic matter. A method approach that allows to stabilize humic substances in acidic and neutral solutions is proposed. Analytical analysis of UV-visible spectrums were preformed to characterize the structure of the organic compounds in different soil organic matter fraction (dissolved organic matter, labile organic matter and humic substance) in hap-lic chernozem under different land-use. Descriptors E4/E6 и E2/E3 were calculated and cluster analysis was preformed for all studied fraction of soil organic matter under different land-use. Our results show that chemical structure of organic matter has the closed similarity in the organic substance fractions of chernozem under a crop rotation and a cornfield.
Keywords: soil organic matter, labile organic matter, dissolved organic matter, long-term field experiments, pH-differential UV-visible spectroscopy, colour index, chromophore, auxochrome, Haplic Chernozem.
Органическое вещество (ОВ) является важнейшим компонентом почвы, выполняющим разнообразные функции в формировании почв и регулировании уровня их плодородия, оно определяет особенности целого ряда почвенных свойств и режимов [1, 2]. Важно отметить, что ОВ почв - это сложная динамическая система, состоящая из совокупности разнообразных органических соединений, которые могут быть выделены во фракции в зависимости от природы, состава и свойств или подразделены на пулы ОВ, исходя из устойчивости компонентов к трансформации и разложению [3]. Признавая важность всех компонентов ОВ, исследова-
тели отмечают, что для плодородия почв наиболее значимую роль играет активная, быстроразлагаю-щаяся часть ОВ [3, 4], которая служит источником питательных элементов для культурных растений и активно участвует в формировании водоустойчивой структуры почв. Более того, есть предположения [3, 5], что агротехнические приемы оказывают воздействие преимущественно на активный пул ОВ, что, в свою очередь, дает возможность целенаправленно регулировать эффективное плодородие пахотной почвы. Однако для установления особенностей агротехнической трансформации ОВ почв
необходимо иметь данные о составе и строении ОВ почв при разных типах землепользования.
Для выявления этих взаимосвязей перспективными подходами являются: применение различных экстрагентов, способных извлекать различные формы ОВ; выявление и изучение качественных и количественных характеристик выделяемого ОВ [1, 6-10].
В почвоведении метод УФ-видимой спектрометрии традиционно применяют при исследовании ОВ почв [11]. В основном его используют для характеристики легкорастворимых органических соединений [12, 13] и гуминовых веществ [14, 15]. Метод позволяет быстро оценить содержание и соотношение гуминовых и фульвокислот, а также с помощью различных соотношений оптических плотностей (индексов цветности) определить степень ароматизации гумусовых кислот (Е4/Е6) и степень окисленности ароматических структур гуминовых кислот (Е2/Е3).
Несмотря на описанные применения, УФ-видимая спектрометрия имеет существенные ограничения в приложении к почвенным объектам. Связано это с тем, что ОВ почв представляет собой смесь полидисперсных и гетерогенных органических соединений [2], включающую ГВ - специфические высокомолекулярные органические молекулы, в состав которых входит неизвестное и высокое число, как хромофоров, так и аускохромов. В результате это сильно осложняет идентификацию хромофоров в смеси почвенных макромолекул, и, как следствие, анализ строения ОВ почв по УФ-видимым спектрам затруднен [16].
Применение метода дифференциальной спектроскопии позволяет частично решить описанную выше методическую проблему [17]. Так, Г.В. Кор-шин с соавторами [17-19] продемонстрировал, что метод рН дифференциальной УФ-видимой спектрометрии позволяет вычленить на спектрах ОВ природных вод пики полос поглощения (и соответствующие им длины волн) хромофоров, сочлененных с кислыми ауксохромными группами (карбоксильными, фенольными группы, аминогруппы и другими). Важно отметить, что метод рН дифференциальной спектроскопии основан на измерение спектров при различных значениях кислотности среды. В результате чего, данный метод накладывает требование на исследуемое вещество: соединение должно растворяться в широком диапазоне рН, но гуминовые кислоты почв в кислой среде осаждаются [16], в результате чего данный метод фактически не нашел применения в почвоведении.
Цель работы - адаптация методики рН дифференциальной УФ-видимой спектрометрии для почвенных объектов.
Объекты и методы. В данной работе стояла задача исследовать фракции ОВ пахотного горизонта
типичного чернозема в условиях разной агротехнической обработки. При этом изучали фракцию растворимого органического вещества (РОВ), лабильного гуминового вещества (ЛГВ), а также фракцию устойчивых гуминовых веществ, предположительно связанных с кальцием (ГВ).
Фракция РОВ включает в себя органические соединения (преимущественно неспецифические соединения и фульвокислоты), находящиеся в растворенном состоянии и в адсорбированном положении, которые десорбируются при экстракции водой или солевой вытяжкой [3]. Важно отметить, что фракция РОВ представляет собой наиболее активную часть ОВ почвы.
Лабильные компоненты ОВ также относят к биологически активному пулу ОВ. Фракция ЛГВ в основном состоит из свежеобразованных, легко-трансформированных гумусовых веществ, не проч-носвязанных с минеральной частью почвы и экстрагируемых из почвы щелочной вытяжкой.
Фракцию ГВ, связанного с кальцием (II фракция по Тюрину), принято относить к устойчивому и транзитному пулам ОВ почв [3, 20], что позволяет использовать данную фракцию в качестве контрастного варианта при исследовании.
В качестве метода исследования использован метод рН дифференцированной спектроскопии в диапазоне видимой ультрафиолетовой (УФ) части спектра. Химическая активность и устойчивость к биологическому разложению фракций ОВ почв во многом определяется строением составляющих ее органических молекул. Для характеристики строения молекул в смеси органических соединений применимы различные аналитические методы. Достаточно распространенным среди них является метод УФ-видимой спектрометрии [21]. Данный метод позволяет по молекулярным полосам поглощения, зарегистрированным при различных длинах волн в УФ-видимом диапазоне, судить о наличии определенных структурных фрагментов, содержащих возбуждаемые о-, п- и п-электроны. Такие группы атомов с характерными электронными спектрами поглощения называют хромофорами [21]. Вне зависимости от простоты или сложности строения молекулы, один и тот же хромофор проявляется на спектре практически одинаково, что позволяет использовать метод УФ-видимой спектрометрии для идентификации простых молекул и для анализа строения сложных органических соединений. Следует отметить, что в молекулах ОВ присутствуют атомы или группы атомов, которые способны влиять на поглощение хромофоров, их называют ауксохромами. Они способны сдвигать характерные полосы поглощения хромофоров и/или изменять интенсивность поглощения в спектре. Присутствие большого числа ауксохромов и цепей сопряжения в органической молекуле существенно
затрудняет идентификацию отдельных хромофоров, что, в свою очередь, сильно осложняет спектральный анализ органических соединений [21].
Работу проводили на почвенных образцах гумусовых горизонтов типичных черноземов, отобранных с участков краткосрочных и длительных полевых опытов, которые заложены на территории Курского НИИ агропромышленного производства. Почвенные образцы были отобраны на вариантах стационарного долгосрочного полевого опыта, заложенного в 1964 г.: 1) Бессменный чистый пар; 2) Севооборот (гречиха - озимая пшеница - ячмень -пар), с внесения минеральных удобрений; 3) Зерновая монокультура (кукуруза); с внесения минеральных удобрений; 4) Залежь (с 1998 г., после бессменного черного пара, заложенного в 1964 г.). Помимо этого, для работы был отобран образец на полевом опыте по применению почвосберегающей технологии, заложенном в 2013 г. Образец был отобран в с делянки опытного поля, на котором завершилась полная ротация культур севооборота (кукуруза на зерно - озимая пшеница - травосмесь (смесь горох и овес) - ячмень).
Образцы отбирали с глубины 0-15 см. Для отбора закладывали площадку опробования, радиусом 5 м. Образцы отбирали в пяти точках методом конверта: в центре и четырех точках в радиусе 5 м от центра со сдвигом на 90° для каждой точки относительно предыдущей. Масса образца из каждой точки была около 5 кг, а объем, занимаемый почвой, был 15 x 15 x 25 см. Таким образом, были отобраны почвенные образцы, позволяющие провести сравнение влияния традиционной и сберегающей систем обработки почв на качество почвенного ОВ. Почвенные образцы высушивали до воздушно-сухого состояния.
Во всех образцах измеряли актуальную кислотность согласно методике определения pHH2O [22], и определяли содержание органического углерода и азота, методом сухого сжигания на автоматическом анализаторе Vario Macro cube Elementar Analysen systeme.
Из почвенных образцов были выделены три фракции ОВ:
- фракцию РОВ извлекали водной вытяжкой;
- фракцию ЛГВ экстрагировали 0,1M NaOH вытяжкой;
- фракцию ГВ извлекали 0,1M NaOH вытяжкой, после предварительного декальцирования 0,1М HCI.
Для экстракции РОВ к навеске почв, пропущенной через сито с отверстиями диаметром 1 -2 мм, приливали дистиллированную воду, не содержащую CO2, в соотношении почва : раствор, равном 1:5. Закрытую суспензию перемешивали в течение 8 ч., после чего почвенное РОВ отделяли от осадка центрифугированием при 3500 rpm в течение 5 мин. на центрифуге Eppendorf 5810.
Лабильные ГВ выделяли по методу Тюрина в модификации Когута-Булкиной [23, 24]. По сути, это ГВ, извлекаемые в ходе препаративного выделения без отделения фульвокислот от гуминовых [25]. Все манипуляции были аналогичные выделению РОВ, единственное отличие: в качестве экстрагента использовали 0,^ NaOH, приготовленный на основе дистиллированной воды, не содержащей СО2.
Фракция ГВ представляет собой фракции I и II по Тюрину. Для извлечения ГВ к пропущенной через сито 1-2 мм навеске почв добавляли небольшое количество ^ HQ до достижения суспензии рН равного 1, затем приливали 0,^ HQ до достижения отношения почва : раствор, равного 1:5. Суспензию встряхивали 4 ч., после чего отделяли супернатант центрифугированием. Осадок нейтрализовывали ^ NaOH до достижения рН 7, и приливали 0,^ NaOH до отношения почва : раствор равного 1:5. Затем закрытую суспензию перемешивали в течение 8 часов и отделяли ГВ от осадка центрифугированием. Все растворы щелочей и кислот готовили на основе дегазированной дистиллированной воды. Полученные вытяжки фракций ОВ очищали от тонких почвенных коллоидов центрифугированием [26] при 10000 об/мин в течение 15 мин. После чего готовили разбавленные растворы фракций ОВ с различной кислотностью.
Так как ГВ - это высокомолекулярные органические молекулы, обладающие размерами коллоидных частиц (размер гуминовых кислот от 7-10 нм [27], размер фульвокислот от 2-3 нм [28]), то истинные растворы гуминовых веществ обладают некоторыми свойствами коллоидных систем, то есть относятся к растворам молекулярных коллоидов. Благодаря этому для стабилизации дисперсионной устойчивости растворов ГВ применимы подходы коллоидной химии. Известно, что гуминовые кислоты в кислой среде коагулируют и осаждаются. Для предотвращения выпадения гуминовых кислот необходимо принять во внимание факторы, влияющие на коагуляцию макромолекул. Слипание наноразмерных молекул зависит от концентрации макромолекул в растворе, их размера и поверхностного заряда. Электрическая и гидратная оболочки высокомолекулярных соединений обеспечивают им в растворах дисперсионной устойчивость. Присутствие электролитов в высокой концентрации в растворе (выше порога коагуляции), напротив, снижает степень дисперсности системы. Таким образом, коагуляция гуминовых кислот в кислой среде зависит от концентрации макромолекул, ионной силы и температуры раствора (броуновского движения). Исходя из этого, было принято решение работать с разбавленными растворами с постоянной ионной силой и при комнатной температуре.
Вытяжки фракций ОВ разводили раствором 0,1 M ШО: РОВ - в 5 раз, ЛГВ - в 40 раз, ГВ - в 300 раз. Разбавленные растворы доводили до заданного pH
Некоторые качественные показатели образцов гумусовых горизонтов чернозема типичного под разными системами землепользования
Вариант рНн20* C, %* N, %* Гумус, % (пересчет по содержанию Сорг.) C : N
Бессменный чистый пар 6,41±0,01 2,96±0,06 0,28±0,06 5,1 10,8
Севооборот 6,40±0,01 3,66±0,04 0,32±0,01 6,3 11,4
Монокультура (кукуруза) 6,58±0,00 3,28±0,04 0,30±0,01 5,7 10,9
Залежь 6,50±0,01 3,42±0,01 0,29±0,01 5,9 11,8
no-till 6,43±0,01 3,42±0,03 0,32±0,01 5,9 10,7
*измерение было проведено в двух повторностях (среднее ± стандартное отклонение, п = 3)
среды (3, 7 или 11) щелочью 0,1M NaOH или кислотой 0,1M HCl. Все растворы готовили на основе ультрачистой дистиллированной воды.
Спектрофотометрические измерения растворов проводили в течение 15 мин. после их приготовления, на спектрофотометре Shimadzu UV-1800 в диапазоне длин волн 200-800 нм. Фоновым раствором служил раствор 0,1M NaCl.
Результаты и обсуждение. Для демонстрации и оценки влияния землепользования, во всех вариантах определи содержание общего углерода (Сорг.) в двукратной повторности.
Как видно из таблицы, содержание углерода изменяется от 2,96% на бессменном чистом пару и 3,42% на варианте с нулевой обработкой до 3,66% от массы почвы на варианте под севооборотом. Обращает на себя внимание одинаковое процентное содержание Сорг. на варианте с нулевой обработкой и залежном варианте. Так как варианты по содержанию ОВ различаются, можно предложить, что и качественные характеристикам ОВ будут различаться по вариантам опыта. Данное предположение в дальнейшем подтвердилось на спектрах фракций ОВ, экстрагированных различными растворителями при разных значениях pH.
Образцы гумусовых горизонтов черноземов разного вида использования обладают нейтральной реакцией среды и характеризуются средним содержанием гумуса (5,1-6,3%). Обогащенность гумуса азотом по соотношению С : N оценивается от низкой на варианте с применением севооборота и залежном варианте до средней на вариантах под паром, монокультурой и с применением технологии no-till.
Полученные УФ-видимые спектры фракций РОВ, ЛГВ и ГВ чернозема разных видов использования, измеренные при значениях pH 3,0; 7,0 и 11,0 представлены на рисунке 1 .
Общий вид спектров представляет собой пологую полосу, оптическая плотность которой постепенно уменьшается с увеличением длины волны. При этом каждый спектр имеет собственную характерную область поглощения, расположенную в ближней УФ-области поглощения в интервале 200380 нм. Данная спектральная область соответствует следующим типам электронных переходов: n—o* и л—л*, n—л*. Переходы n—o* и л—л* возбужда-
ются, квантами света с длиной волны 190-220 нм (исключение: в ароматических соединениях л-электроны возбуждается в области 230-280 нм). Переход n—л* требует меньше энергии для возбуждения, а именно кванта света с длиной волны около 230-350 нм исключение составляют свободные электроны на карбонильном кислороде в карбоксильных группах, которые возбуждаются в области 200-210 нм [29]. Таким образом, полосы поглощения можно соотнести с электронными переходами отдельных хромофорных групп, при этом важно не забывать, что внутримолекулярные взаимодействия в крупных органических молекулах чаще всего смещают полосы поглощения в длинноволновую область [30].
Во всех измеренных спектрах РОВ чернозема наблюдались характерные максимумы полос поглощения в области следующих длин волн: от 200 до 210 нм, было выделено несколько пиков, и в области 260 нм. Помимо этого, на спектрах чернозема под паром, кукурузой и севооборотом полоса поглощения возрастала вплоть до длины волны 200 нм (рис. 1 а, б, в), что предположительно свидетельствует о максимуме поглощения в области более коротких длин волн (< 200 нм).
При изменении кислотности среды максимумы полос поглощения в области 200-210 нм смещались (это батохромный и гипсохромный сдвиги), что свидетельствует о наличии протонируемых функциональных групп вблизи хромофоров. Максимум поглощения в области 260 нм при подщелачивании среды сдвигался в длинноволновую область на спектрах РОВ чернозема под залежью, паром и с применением технологии no-till (рис. 1 а, б, д), но не смещался на спектрах чернозема под кукурузой и в севообороте (рис. 1 в, г). Следовательно, можно предположить, что в вариантах «кукуруза» и «севооборот» максимум в области 260 нм соответствует преимущественно электронным переходам л—л* пара-полосы ароматических структур, не способных к депротонированию, тогда как в вариантах «залежь», «пар» и «no-till», помимо хромофоров ароматических соединений присутствуют, хромофорные группы, в которых осуществляется п—>л* переход, то есть структуры, в которых непо-деленная электронная пара гетероатома азота или
длинна волны.нм
Рис. 1. УФ-видимые спектры фракций РОВ, ЛГВ и ГВ, выделенных из образца гумусового горизонта чернозема типичного: а) под бессменным чистым паром, б) при традиционно системе обработки и использовании севооборота, в) под монокультурой кукурузы, г) под залежью, д) при использовании почвосберегающей технологии no-till, снятые при pH 3,0; 7,0 и 11,0.
кислорода взаимодействует с п-электронной ароматической системой. Это объясняет батохромный сдвиг при подщелачивании среды, так как на гете-роатомах в щелочной среде может накапливаться
избыточный отрицательный заряд, снижающий энергию возбуждения электронов.
УФ-видимые спектры фракций ЛГВ имеют характерные максимумы поглощения в областях от
200 до 210 нм и широкий максимум в области 260280 нм. Помимо этого на всех спектрах полосы поглощения достигают максимума при 200 нм (рис. 1).
В области коротких длин волн на УФ-видимых спектрах вариантов «севооборот» и «кукуруза» (рис. 1 в, г) отображаются несколько слабовыра-женных пиков (при 201 нм, 203 нм, 205 нм, 207 нм), при этом на спектрах других вариантов (рис. 1 а, б, д) наблюдается только один плохо выраженный пик при 201-202 нм. При изменении реакции среды на всех УФ-видимых спектрах максимумы поглощения сдвигаются, что указывает на наличие кислых ауксохромных групп, присоединенных к поглощающим электромагнитное излучение хромофорам. Интересно то, что батохромный сдвиг наблюдается исключительно в двух случаях: когда реакция среды подщелачивается (рис. 1 б, г, д), что, по-видимому, вызвано депротонированием OH-группы карбоксильных групп (n—л* переход при 200-210 нм); или когда раствор ЛГВ выводится из нейтральной реакции среды, то есть батохромный сдвиг наблюдается на спектрах, как при подкисле-нии, так и при подщелачивании среды (рис. 1 а, в, г), что может объясняться наличием рядом с хромофором амфотерной функциональной группы, способной ионизироваться как в кислой, так и в щелочной среде (например, аминогруппы).
Положение широкого максимума поглощения на спектрах в области 260-280 нм практически не зависит от реакции среды, за исключением варианта «залежь», где при нейтрализации и подщелачива-нии раствора на спектрах наблюдались батохром-ные сдвиги (рис. 1 б), что свидетельствует о наличии депротонируемых гетероатомов в ароматической структуре ЛГВ (например, фенольных групп, анилинных фрагментов и др.).
УФ-видимые спектры фракций ГВ чернозема между собой сильно различаются. Так, в спектрах варианта с использованием технологии no-till и залежным вариантом (рис. 1 б и г) не обнаружено характерных максимумов полос поглощения. Единственным максимумом здесь служит значение оптической плотности при 200 нм. В УФ-видимых спектрах вариантов «пар», «севооборот», «кукуруза» (рис. 1 а, в, г) выявлен максимум поглощения при 202-204 нм. Помимо данного пика в варианте «севооборот» (рис. 1 в) присутствуют еще два небольших пика при 201 и 205 нм. При этом положение пиков в коротковолновой области поглощения сильно зависит от реакции среды.
Максимум поглощения в длинноволновой области наблюдается для вариантов «севооборот» и «кукуруза» в области 260 нм (рис. 1 в и г). Положение пика не зависит от реакции среды, то есть, данный максимум поглощения, по-видимому, можно связать с электронным переходом л—л* пара-полосы ароматических хромофоров. Таким обра-
зом, анализ расположения максимумов поглощения при различных рН среды на УФ-видимых спектрах РОВ, ЛГВ и ГВ позволяет сделать некоторые выводы о структуре ОВ и об отличиях почвенного ОВ.
Для получения более детальной информации о протонирующих группах, присоединенных к хромофорам, в составе фракций ОВ почв были построены рН-дифференцированные УФ-видимые спектры. Дифференциальный спектр строится как зависимость дифференцированного поглощения от длины волны. Под дифференциальным поглощением (Д оптической плотности) понимают разницу оптических плотностей при измененном рН и условно исходном рН среды [19]. За исходное значение рН принималось рН 7. Такое строение рН-дифференцированного спектра позволяет выявить из множества максимумов поглощения исходного УФ-видимого спектра только те пики, интенсивность поглощения которых изменилась при изменении кислотности среды. Иными словами, дифференциальный спектр отображает максимумы поглощения, претерпевающие в результате подкисле-ния или подщелачивания среды гиперхромный эффект (увеличение интенсивности поглощения) или гипохромный эффект (уменьшение интенсивности поглощения). Полученные рН-дифференцирован-ные УФ-видимые спектры фракций РОВ, ЛОВ, ГВ чернозема разного вида использования представлены на рисунке 2.
Анализ спектров выявил, что при подщелачива-нии среды практически во всех фракциях ОВ наблюдается гиперхромный эффект, который предположительно связан с диссоциацией ионов, приводящей к поляризации молекулы, то есть, вызван депротонированием функциональных групп. Напротив, при подкислении среды во всех фракциях, за исключением фракций РОВ в вариантах «кукуруза» и «севооборот», наблюдается снижение интенсивности поглощения (гипохромный эффект), что может быть объяснено как деполяризацией органической молекул, так и изменением их пространственной конфигурации [18]. На спектрах фракции РОВ вариантов «севооборот» и «кукуруза» вне зависимости от того, в какую сторону изменяется кислотность среды, интенсивность поглощения возрастала по сравнению с оптической плотностью, измеренной при нейтральном рН. Следовательно, органические молекулы данной фракции способны ионизироваться как в кислой, так и в щелочной среде, что может указывать на достаточно высокое содержание амфотерных групп (например, аминогрупп) в составе макромолекул.
Важно подчеркнуть, что максимумы поглощения на исходном УФ-видимом спектре и рН-дифференцированном спектре не всегда совпадали в длинноволновом диапазоне. Так, характерный на УФ-видимых спектрах максимум при 260 нм сме-
щается на pH-дифференцированном спектре в область 250-255 нм в вариантах «севооборот» и «кукуруза» фракции РОВ (рис. 2 б, в). Данное наблюдение, согласуется с выше выдвинутым предположением о том, что максимум поглощения при 260 нм на УФ-видимом спектре соответствует преимущественно электронным переходам ароматических структур, в то время как именно благодаря построению дифференцированных спектров удается выделить ранее «маскирующиеся» пики в области поглощения 250-255 нм. На pH-дифференцированных спектрах фракций ЛГВ и ГВ вариантов «пар», «залежь», «no-till» также проявились ранее не наблюдаемые на УФ-видимых спектрах максимумы по-
глощения в областях 230-280 нм и 300-350 нм. При этом во фракциях ГВ всех перечисленных выше вариантов максимум поглощения при 230-300 нм пропадает при подщелачивании среды (рис. 2 а, г, д), что, предположительно объясняется разрывом водородных связей в щелочной среде. Так как разрыв водородных связей ведет к изменению конфигурации макромолекул, это влечет за собой перераспределение электронной плотности, приводящей к деполяризации макромолекулы, следовательно, к резкому уменьшению интенсивности поглощения. Таким образом, построение и анализ pH-дифференцированных спектров позволяет выделить максимумы поглощения не только хромофо-
юо ш «о но но »о но
длинна волны, нм
Рис. 2. pH-дифференцированные УФ-видимые спектры фракций РОВ, ЛГВ и ГВ, выделенных из образца гумусового горизонта чернозема типичного а) под бессменным чистым паром, б) при традиционно системе обработки и использовании севооборота, в) под монокультурой кукурузы, г) под залежью, д) при использовании почвосберегающей технологии no-till, снятые
при pH 3,0; 7,0 и 11,0.
ров, непосредственно связанных с протонирующи-ми ауксохромами, но групп хромофоров, пространственная структура которых сильно зависит от реакции среды.
На основании вышеизложенного можно заключить, что анализ УФ-видимых спектров при различных значениях рН и анализ рН-дифференциальных спектров позволяет выявить:
- хромофоры, соединенные с ионизирующимися ауксохромами в щелочной среде. Хромофоры выявлены в диапазоне длин волн 200-210 нм (предположительно, карбоксильные группы) и в диапазоне 250-270 нм (предположительно, фенольные группы, аминные фрагменты, гетероциклические фрагменты органических соединений);
- хромофоры, связанные с амфотерными ауксо-хромами, максимум поглощения которых в диапазоне длин волн 200-210 нм (предположительно, аминогруппы);
- хромофоры ароматических структур, не зависящих от изменения реакции среды, максимум поглощения которых зафиксирован в диапазоне 260-270 нм (предположительно, ароматические фрагменты);
- хромофорные группы, поглощение которых сильно зависит от пространственной конфигурации макромолекулы, с максимумом поглощения в различных диапазонах длин волн, обнаружены при 200-210 нм и при 250-350 нм (предположительно, органические макромолекулы, структурные части которых соединены водородными связями).
Таким образом, фракции РОВ, ЛОВ и ГВ чернозема разного вида использования можно охарактеризовать, исходя из наличия или отсутствия в строении органических соединений перечисленных групп хромофоров. Так, фракции РОВ и ЛГВ чернозема под паром характеризуются содержанием преимущественно кислых функциональных групп вблизи ароматических фрагментов, таких как фе-нольные группы, гетероциклы. Во фракции ЛГВ помимо этого обнаружены амфотерные группы. Во фракции ГВ варианта «пар» присутствуют, главным образом, кислые функциональные группы карбоксильной природы, также обнаружены различные молекулярные структуры, конфигурация которых сильно зависит от реакции среды.
Фракция РОВ чернозема под севооборотом и под кукурузой характеризуется содержанием разнообразного числа кислых функциональных групп (карбоксильные группы, фенольные группы, амин-ные фрагменты, гетероциклы), в том числе амфо-терных групп (аминогрупп). При этом в структуре макромолекул есть ярко выраженные на УФ-видимых спектрах ароматические фрагменты, не зависящие от рН среды, которые не были обнаружены в других вариантах. Фракция ЛОВ этих вариантов характеризуется содержанием преимущественно кислыми функциональными группами кар-
боксильной природы и амфотерными группами, а также наличием ароматических фрагментов, аналогичных по спектрам, найденным во фракции РОВ. Фракция ГВ в обоих случаях практически не отличается от фракции ЛГВ, за исключением того, что в данной фракции не обнаружено амфотерных групп.
Фракция РОВ чернозема под залежью характеризуется содержанием кислых гетероатомных групп в непосредственной близости от ароматических фрагментов (фенольные группы и/или гетеро-циклы). Во фракции ЛГВ, помимо вышеописанных кислых функциональных групп, встречаются также функциональные группы карбоксильной природы. Однако во фракции ГВ не удалось обнаружить никаких признаков наличия кислых функциональных групп, по результатам анализа выявлены только структуры макромолекул с конфигурацией, сильно зависящей от реакции среды.
Фракции РОВ и ЛГВ чернозема при использовании почвосберегающей технологии no-till характеризуются содержанием как кислых функциональных групп карбоксильной природы, так и гете-роатомных групп вблизи ароматических структур (фенольные группы, гетероциклы). Во фракции ЛГВ помимо этого присутствуют ярко выраженные ароматические фрагменты, не зависящие от реакции среды. Фракция ГВ варианта «no-till» характеризуется наличием кислых функциональных групп карбоксильной природы, а также молекулярными структурами макромолекул, конфигурации которых зависят от pH среды.
Для количественной характеристики УФ-видимых спектров поглощения фракций РОВ, ЛГВ, ГВ чернозема разного вида использования, измеренных при разных значения pH среды, были рассчитаны индексы цветности E4/E6 и E2/E3. Показатель E4/E6 рассчитывается как отношение интен-сивностей в спектрах при длине волн 465 и 665 нм. Он характеризует отношение ароматических фрагментов ОВ к алифатическим, иными словами степень гумификации ОВ. Полученные значения данного показателя приведены на рисунке 3.
Фракции ОВ чернозема разного вида использования были классифицированы по значения E4/E6 кластерным анализом (рис. 4).
Результаты кластеризации показали (рис. 4а), сходство всех фракции ЛГВ вне зависимости от вида использования почв. Наибольшее сходство отмечается между вариантами «севооборот» и «кукуруза» (сходство на 90%), а также между вариантами «залежь» и «пар» (90%). Так же сходство по степени гумификации было обнаружено для фракции ГВ вариантов «залежь» «пар», «no-till». Кластеризация определила в один кластер фракций РОВ и ГВ вариантов ««севооборот» и «кукуруза» (сходство 93%). Фракции РОВ «залежь» и «пар» были сходны на 90%, а фракция РОВ «no-till»,
Рис. 3. Значения параметра E4/E6 для фракций РОВ, ЛГВ и ГВ, извлекаемых из образцов гумусового горизонта типичных чернозема разных вариантов использования:
пар, севооборот, монокультура (кукуруза), залежь, no-till.
"б
120
100
£ 80 £
i 60
rVr^ ^^
i i i ё s
s s > >
± i о о _ -J cc
i i i
105 100 95 90 85 80 75 " 70 65 60 55 50
pH 7
pH 11
pH 3
Рис. 4. а) Дендрограмма иерархической группировки фракций чернозема разного вида использования по результатам кластерного анализа значений коэффициентов E4^6.
Обозначение вариантов: Par_ROV - фракция РОВ чернозема под паром; Par_LHV - фракция ЛГВ чернозема под паром; Par_HV - фракция ГВ чернозема под паром; Sevooborot_ROV, Sevooborot_LHV, Sevoobo-rot_HV - соответственно, фракции РОВ, ЛГВ и ГВ чернозема под севооборотом; Kukuruza_ROV, Kuku-ruza_LHV, Kukuruza_HV - соответственно, фракции РОВ, ЛГВ и ГВ чернозема под монокультурой кукурузы; Zalej_ROV, Zalej_LHV, Zalej_HV - соответственно, фракции РОВ, ЛГВ и ГВ чернозема под залежью; no-till_ROV, no-till _LHV, no-till _HV - соответственно, фракции РОВ, ЛГВ и ГВ чернозема под нулевой системой обработки; б) Дендрограмма иерархической группировки коэффициентов E4^6 фракций чернозема разного вида использования в зависимости от кислотности среды.
10,0 9,0 8,0
7,0 6,0
m
^ 5,0
CN
ш 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0
1 Ни
РОВ ЛГВ ГВ РОВ ЛГВ ГВ РОВ ЛГВ ГВ РОВ ЛГВ ГВ РОВ ЛГВ ГВ
Пар Севооборот Кукуруза Залежь No-till
I рН 3 и рН 7 «рН11
Рис. 5. Значения параметра E2/E3 для фракций РОВ, ЛГВ и ГВ, извлекаемых из образцов гумусового горизонта типичных чернозема в разных вариантах использования: пар, севооборот, монокультура (кукуруза), залежь, no-till.
Рис. 6. а) Дендрограмма иерархической группировки фракций чернозема разного вида использования по результатам кластерного анализа значений коэффициентов Е2/Е3.
Обозначение вариантов: Обозначение вариантов: Par_ROV - фракция РОВ чернозема под паром; Par_LHV
- фракция ЛГВ чернозема под паром; Par_HV - фракция ГВ чернозема под паром; Sevooborot_ROV, Sevooborot_LHV, Sevooborot_HV - соответственно, фракции РОВ, ЛГВ и ГВ чернозема под севооборотом; Kukuruza_ROV, Kukuruza_LHV, Kukuruza_HV - соответственно, фракции РОВ, ЛГВ и ГВ чернозема под монокультурой кукурузы; Zalej_ROV, Zalej_LHV, Zalej_HV - соответственно, фракции РОВ, ЛГВ и ГВ чернозема под залежью; no-till_ROV, no-till _LHV, no-till _HV - соответственно, фракции РОВ, ЛГВ и ГВ
чернозема под нулевой системой обработки; б) Дендрограмма иерархической группировки коэффициентов Е2/Е3 фракций чернозема разного вида использования в зависимости от кислотности среды
наиболее отличающаяся от всех остальных фракций по степени гумификации, попала в отдельный кластер (сходство на 38%). Кластеризация показала (рис. 4б), что наибольшим сходством по степени гумификации между собой обладали фракции измеренные при pH 3,0 и pH 11,0 (сходство 58%), тогда как фракции, измеренные при нейтральном pH существенно отличались от них. Таким образом, чтобы корректно сравнивать между собой по степени гумификации фракции РОВ, ЛГВ и ГВ необходимо проводить спектральные измерения при одном заданном pH.
Показатель Е2/Е3 рассчитывается как отношение интенсивностей при 250 и 365 нм, характеризует степень окисленности ОВ. Рассчитанные значения данного показателя представлены на рисунке 5.
Также была проведена классификация фракций ОВ чернозема разного вида использования по степени окисленности ОВ методом кластерного анализа, результаты показаны на рисунке 6.
Выявлено 94% сходство фракции ГВ все вариантов. Фракции ЛГВ вариантов «залежь», «пар» и «no-till» образовали отдельный кластер с 95% сходством. Фракция ЛГВ вариантов «севооборот» и «кукуруза» по степени окисленности оказались ближе к фракции «РОВ» вариантов «залежь», «пар» и «no-till» (сходство на 85%). При этом фракция «РОВ» «севооборот» и «кукуруза» образовали от-
дельный кластер, отличающийся на 53% от всех других фракций. Результаты кластеризации также показал, что по степень окисленности наиболее близки те фракций, спектры которых были измерены при кислой и щелочной реакции среды (рис.6б). Они на 52% различаются по степень окисленности от фракций, измеренных при нейтральной реакции среды. Таким образом, кислотность среды, при которой проводят спектральные измерения фракций ОВ, является важным фактором, влияющим на сопоставимость результатов измерения.
Таким образом, впервые осуществлена адаптация методики рН-дифференцированной УФ-видимой спектрометрии для изучения ОВ почв. Предложено методическое решение для обеспечения дисперсионной устойчивости гуминовых веществ в кислой и нейтральной средах, которое позволяет изучать фракции ОВ при различных значениях рН среды. В работе впервые было охарактеризовано строение фракций РОВ, ЛГВ, ГВ чернозема типичного разного вида использования с помощью метода рН-дифференцированной УФ-видимой спектрометрии. Продемонстрировано, что предложенный метод рН-дифференцирован-ной УФ-видимой спектрометрии позволяет характеризовать фракции ОВ пахотного горизонта типичного чернозема в условиях разной агротехнической обработки.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 18-31600128 и с привлечением оборудования Центра коллективного пользования научным оборудованием «Функции и свойства почв и почвенного покрова» Почвенного института им. В.В. Докучаева.
Литература
1. Тюрин И.В. Органическое вещество почвы и его роль в плодородии. - М.: Наука, 1965. - 320 с.
2. Орлов Д.С., Садовникова Л.К., Суханова Н.И. Химия почв. - М.: Высшая школа, 2005. - 561 c.
3. Семенов В.М., Когут Б.М. Почвенное органическое вещество. - М.: ГЕОС, 2015. - 233 с.
4. Зинякова Н.Б., Семенов В.М. Влияние возрастающих доз органического и минерального удобрений на пулы растворенного, подвижного и активного органического вещества в серой лесной почве // Агрохимия, 2014, № 6. - С. 8-19.
5. Сысуев С.А. Содержание и состав органического вещества агрегатов черноземов: дисс. к.с.-х.н. - М.: Почвенный институт им. В.В. Докучаева, 2005. - 137 с.
6. Тюрин И.В., Найденова О.А. К характеристике состава и свойств гуминовых кислот, растворимых в разведенных щелочах непосредственно и после декальцирования // Труды Почвенного ин-та АН СССР, 1951, Т. 38. - С. 59-64.
7. Elliott E.T. Aggregate structure and carbon, nitrogen, and phosphorus in native and cultivated soils // Soil Sci. Soc. Am. J., 1986, V. 50. - P. 627-633.
8. Six J., Elliott E.T., Paustian K., Doran J.W. Aggregation and soil organic matter accumulation in cultivated and native grassland soils // Soil Sci. Soc. Am. J., 1998, V. 62. - P. 1367-1377.
9. Six J., Paustian K., Elliott E. T., Combrink C. Soil structure and organic matter: I. Distribution of aggregate-size classes and aggregate-associated carbon // Soil Sci. Soc. Am. J., 2000, V. 64. - P. 681-689.
10. Когут Б.М., Титова Н.А., Булеева В.С. Антропогенная трансформация качественного состава гумуса черноземов Каменной степи // Бюллетень Почвенного института им. В.В. Докучаева, 2009, Вып. 64. - С. 41-49.
11. Кононова М.М. Органическое вещество почвы. - М.: Изд-во АН СССР, 1963. - 315 с.
12. Jones D.L., Simfukwe P., Hill P.W., Mills R.T.E., Emmett B.A. Evaluation of Dissolved Organic Carbon as a Soil Quality Indicator in National Monitoring Schemes // PloS One, 2014, V. 9(3). - P. 1 -6.
13. Matilainen A., Gjessing E.T., Lahtinen T., Hed L., Bhatnagar A., Sillanpaa M. An overview of the methods used in the characterisation of natural organic matter (NOM) in relation to drinking water treatment // Chemosphere, 2011, V. 83(11). - P. 1431-1442.
14. Fasurova N., Pospisilova L. Characterization of soil humic substances by ultraviolet-visible and synchronous fluorescence spectroscopy // Journal of Central European Agriculture, 2010, V. 11(3). - P. 351-358.
15. Hartemik A.E., McSweeney K. Soil Carbon. Springer International Publishing Switzerland, 2014. - P. 127-136.
16. Караванова Е.И. Оптические свойства почв и их природа. - М.: Изд-во МГУ, 2003. - 151 c.
17. Korshin G.V., Benjamin M.M., Li Ch.-W. Use of differential spectroscopy to evaluate the structure and reactivity of humics // Water Science and Technology, 1999, V. 40(9). - P. 9-16.
18. Korshin G.V., Li C.W., Benjamin M.M. Monitoring the properties of natural organic matter through UV spectroscopy: A consistent theory // Water Research, 1997, V. 31(7). - P. 1787-1795.
19. Yan M., Dryer D., Korshin G.V. Spectroscopic characterization of changes of DOM deprotonation-protonation properties in water treatment processes // Chemosphere, 2016, V. 148(4). - P. 426-435.
20. Sutton R., Sposito G. Molecular structure in soil humic substances: the new view // Environmental Science and Tech-nol., 2005, V. 39. - P. 9009-9015.
21. Дорохова Е.Н., Прохорова Г.В. Аналитическая химия. Физико-химические методы анализа. - М.: Изд-во Высшая школа, 1991. - 256 с.
22. Воробьева Л.А. Теория и практика химического анализа почв. - М.: ГЕОС, 2006. - 400 с.
23. Когут Б.М., Булкина Л.Ю. Сравнительная оценка воспроизводимости методов определения лабильных форм гумуса черноземов // Почвоведение, 1987, № 7. - C. 38-45.
24. Холодов В.А., Иванов В.А., Фарходов Ю.Р., Артемьева З.С., Сафронова Н.А., Ярославцева Н.В. Оптические характеристики фракций органического вещества агрегатов типичных черноземов // Бюллетень Почвенного института им. В.В. Докучаева, 2017, Вып. 90. - С. 57-73.
25. Холодов В.А., Ярославцева Н.В., Константинов А.И., Перминова И.В. Препаративный выход и свойства гуминовых кислот при последовательных щелочных экстракциях // Почвоведение, 2015, № 10. - С. 1222-1231.
26. Kim H.T. Sampling, Preparation, and Analysis. - New York: CRC Press, 1995. - 432 р.
27. Kawahigashi M., Sumida H., Yamamoto K. Size and shape of soil humic acids estimated by viscosity and molecular weight // Journal of Colloid and Interface Science, 2005, V. 284(2). - P. 463-469.
28. De Haan H, Werlemark G. Effect of pH on molecular weight and size of fulvic acids in drainage water from peaty grassland in NW Netherlands // Plant and Soil, 1983, V. 75(1). - P. 63-73.
29. Сильверстейн Р., Басслер Г., Моррил Т. Спектрометрическая идентификация органических соединений. - М.: Мир, 1977. - 591 с.
30. Свердлова О.В. Электронные спектры в органической химии. - Л.: Химия, 1985. - 248 с.
ПОЗДРАВЛЯЕМ
В соответствии с Указом Президента Российской Федерации от 19 декабря 2019 г. № 611 «О награждении государственными наградами Российской Федерации» Орденом Почета награжден директор ФГБНУ «Почвенный институт им. В.В. Докучаева», академик РАН Иванов Андрей Леонидович.
