CC BY
6УДК 619:616.993.192 БОТ: 10.56660/77368 2023 7 81
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ В
ВЕТЕРИНАРНОЙ ПРАКТИКЕ
A. Е. Святогорова - младший научный сотрудник, к.с.-х.н., ОЯСГО: 0000-
0003-4233-1740, БРШ-код: 2369-0027, АиШогГО: 719399
B. В. Чекрышева - директор, к.в.н., доцент, ОЯСГО: 0000-0002-2793-321Х,
БРШ-код: 5247-5424, АиШогГО: 810594
Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт - филиал федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»
Аннотация. Наиболее совершенными методами обнаружения инфекционных заболеваний животных являются молекулярно-генетические методы анализа. В статье представлено обоснование важности ПЦР- ЯеаШше для обнаружения генетического материала возбудителей инфекций у животных, позволяющего проводить одновременную идентификацию нескольких мишеней в одной пробирке и измерения экспрессии генов в отдельных клетках или тканях без взаимодействия с патогенными агентами, а также проводить количественную оценку содержания патогенов в организме животного. Количественный анализ ПЦР-ЯеаШше дает возможность ветеринарным специалистам контролировать динамику заболевания. Благодаря автоматической регистрации, интерпретации результатов и возможности проведения сравнительного анализа графических изображений специалисты могут верифицировать диагноз и подобрать самый оптимальный способ лечения.
Ключевые слова: генетика, ПЦР - ЯеаШте, диагностика заболеваний, ветеринарная медицина, животные.
APPLICATION OF THE REAL-TIME PCR METHOD IN VETERINARY
PRACTICE
A.E. Svyatogorova - junior researcher, Candidate of Agricultural Sciences, ORCID: 0000-0003-4233-1740, SPIN-code: 2369-0027, AuthorlD: 719399
V. V. Chekrysheva - Director, candidate of veterinary sciences, Associate Professor, ORCID: 0000-0002-2793-321X, SPIN-code: 5247-5424, AuthorlD:
810594
North-Caucasus Zonal Scientific Research Veterinary Institute - Branch of the Federal State Budget Scientific Institution «Federal Rostov Agricultural Research
Centre»
Annotation. The most advanced methods of detecting infectious diseases of animals are molecular genetic methods of analysis. The article substantiates the importance of RealTime PCR for detecting the genetic material of infectious agents in animals, which allows simultaneous identification of several targets in one test tube and measurement of gene expression in individual cells or tissues without interaction with pathogenic agents, as well as quantitative assessment of the content of pathogens in the animal body. Quantitative analysis of PCR-RealTime enables veterinary specialists to monitor the dynamics of the disease. Thanks to automatic registration, interpretation of the results and the possibility of comparative analysis of graphic images, specialists can verify the diagnosis and choose the most optimal method of treatment.
Keywords: genetics, PCR - RealTime, disease diagnostics, veterinary medicine, animals.
Введение. Особенность метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени проявляется в проведении количественного анализа, с помощью которого происходит накопление фрагментов генома возбудителя заболевания, а также автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов [10]. При проведении ПЦР - RealTime отличительной особенностью от классического метода ПЦР является отсутствие стадии детекции результатов с помощью горизонтального электрофореза в геле. Это
8 2
дает возможность избежать ошибок и ложноположительных результатов и исключить контаминацию, а также значительно ускорить получение результатов анализа. С помощью ПЦР - RealTime можно проводить оценку показателей реакции и проводить сравнительный анализ графиков амплификации для количественного определения матрицы, что позволяет уточнить диагноз и выбрать наиболее верный способ лечения. Благодаря высокоспецифичности и чувствительности, метод ПЦР - RealTime является надежным. Данный метод довольно простой в проведении анализа, исследование биологического материала на 2-3 часа проводится быстрее, чем при классическом методе ПЦР. Согласно литературным данным, с помощью ПЦР - RealTime можно выявить даже одну молекулу ДНК или РНК в исследуемой пробе материала [1]. Эти преимущества были достигнуты благодаря использованию флуоресцентной детекции продуктов реакции амплификации в режиме реального времени, автоматизации, применению компьютерных приемов регистрации и интерпретации данных. В мире разработаны тест-системы [2, 3, 4], благодаря которым возможна детекция геномов одновременно нескольких возбудителей заболеваний. Что очень удобно при обследовании животного с подозрением сразу на несколько заболеваний или при наличии клинических и иных признаков, схожих для разных болезней. Во время проведения анализа ПЦР - RealTime происходит флуоресцентная детекция, при которой продукт реакции амплификации не извлекается и свечение учитывают в закрытой пробирке, что решает проблему контаминации в ветеринарной лабораторной практике. Крупные диагностические центры в основном используют для проведения метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени многолуночные стрипы или планшеты, работа производится с помощью роботизированных дозаторов, благодаря которым исключается вероятность ошибки действий оператора и практически полностью исключается неправильная интерпретация данных.
83
Цель ветеринарного специалиста: с помощью тест-систем, используемых в ПЦР - RealTime диагностике, быстро и точно принимать верные решения при постановке диагноза, проводить дифференциальную диагностику заболеваний, своевременно начинать специфическое лечение животного, определить напряжённость иммунитета, избежать вакцинации инфицированных животных и распространения инфекции.
Материалы и методы. Для проведения анализа ПЦР - RealTime используют такие биологические материалы, как кровь, слюну, соскобы, биоптаты (материал, полученный путём биопсии) и т.д. В ПЦР - RealTime можно исследовать любой биологический материал, поскольку реакция не требует стерильности, фиксации, антисептики и прочих традиционных элементов пробоотбора. При этом материал может быть гниющим, трупным, аутолизированным или контаминированным посторонними микроорганизмами. Это объясняется тем, что для анализа ПЦР - RealTime необходимы не белковые составляющие, а молекула ДНК, проявляющая как химическая структура высокую устойчивость в разных естественных условиях окружающей среды. Наиболее стандартным биологическим материалом для количественного анализа ПЦР - RealTime является кровь, для которой количество инфекционного агента обычно выражают в числе копий генома возбудителя заболевания в 1 мл цельной крови. При отборе биологических материалов для исследования в ПЦР - RealTime важно избегать внесения в пробу ингибирующих ПЦР веществ, а также соединений, которые влияют на фоновую флуоресценцию смеси реагентов реакции амплификации. Так, например, кровь чаще всего берут с применением антикоагулянтов. Однако некоторые из них (в частности, гепарин и хелатирующие агенты, родственные этилендиаминтетраацетату) оказывают выраженное ингибирующее влияние на реакцию амплификации. При использовании гепарина операторы ПЦР-РВ применяют сорбционные методики выделения генома возбудителя заболевания с применением кремнийсодержащих частиц, способных удалить из биологического образца большинство ингибиторов реакции.
Препятствовать реакции амплификации также может гемоглобин цельной крови, поэтому операторы для выделения нуклеиновых кислот используют специальные приемы, позволяющие максимально эффективно удалять остатки гемоглобина из образца. Серьезной ошибкой на этапе отбора проб является неправильный выбор места взятия биологического материала. Для анализа ПЦР - RealTime необходимо соблюдать патогенетические аксиомы и брать материал из места предполагаемой локализации инфекционного процесса. Так, при ящуре следует отбирать эпителий из не вскрывшихся или только что вскрывшихся афт либо афтозную жидкость. Если это невозможно, в качестве альтернативного источника вируса берут пробы крови и/или образцы жидкости из глотки и пищевода (с помощью пищеводно-глоточного зонда у жвачных животных или мазки из зева у свиней) [1]. Важно также учитывать особенности инфекционного цикла возбудителя заболевания. Если нарушить данные правила, то высока вероятность, что результат анализа ПЦР - RealTime будет ошибочным.
Заключение. Совершенствование технологий амплификации ДНК возбудителей инфекционных заболеваний среди животных произвело революцию в клинической вирусологии и бактериологии, позволив довольно просто, быстро, достоверно определять наличие инфекционного агента в биологическом материале и использовать полученные сведения для борьбы с заболеваниями. В настоящее время молекулярно-генетические методы анализа, в частности, ПЦР, широко применяют в лабораторных исследованиях [5, 6, 7, 8] при различных инфекционных заболеваниях животных; они прочно вошли в повседневную практику научно-исследовательских и клинических лабораторий ветеринарного профиля. Спектр применения ПЦР растет с каждым годом, поскольку при лабораторном исследовании (в процессе экспресс-диагностики) нужно доказать или опровергнуть наличие генома возбудителя заболевания; а при проведении количественного анализа оценить степень вирусной или бактериальной нагрузки на организм или отдельный орган. Количественное определение возбудителей болезней, особенно
вирусов, крайне важно как при острых, так и персистирующих инфекциях, для анализа которых качественная детекция не дает необходимой информации о течении заболевания и ходе лечения; а также при выявлении нецитопатогенных и некультивируемых патогенов. Использование ПЦР -RealTime для количественной оценки нагрузки организма инфекционным агентом позволяет сделать вывод о прогрессировании заболевания и назначить упреждающую терапию в доклинической фазе инфекции; оценить эффективность антивирусной и антибактериальной терапии и отслеживать устойчивость возбудителя болезни к лечебным препаратам.
В настоящее время в РФ разработаны тест-системы для ПЦР-диагностики [9] большинства особо опасных и экономически значимых болезней животных, что имеет большое значение для обеспечения ветеринарной безопасности страны.
Литература
1. Доронин М. И., Лозовой Д. А., Щербаков А. В., Макаров В. В. Применение метода ПЦР в режиме реального времени в ветеринарной практике // Российский ветеринарный журнал. - 2020. - № 2. - С. 5-12. - DOI 10.32416/2500-4379-2020-2-5-12. - EDN GHGJJS.
2. Глотов А. Г., Нефедченко А. В., Глотова Т. И., Котенева С. В. Разработка ПЦР в режиме реального времени для идентификации пестивируса Н крупного рогатого скота. Молекулярная диагностика // Молекулярная диагностика, Москва, 09-11 ноября 2021 года / Коллектив авторов. - Москва: ООО Фирма "Юлис", 2021. - С. 178-179. - EDN CDLAUO.
3. Глотова, Т. И., Семенова О. В., Глотов А. Г. Распространение Feline calicivirus среди кошек и его филогенетический анализ. Молекулярная диагностика // Молекулярная диагностика, Москва, 09-11 ноября 2021 года / Коллектив авторов. - Москва: ООО Фирма "Юлис", 2021. - С. 184-185. - EDN ITBAFI.
4. Нефедченко А. В., Глотов А. Г., Котенева С. В., Глотова Т. И. Выявление и количественная оценка вирусных и бактериальных возбудителей
респираторных болезней крупного рогатого скота при помощи ПЦР в реальном времени // Сельскохозяйственная биология. - 2021. - Т. 56. - № 4. -С. 695-706. - ЭО1 10.15389/авгоЬю1ову.2021.4.695гш. - БЭК БРТТОР.
5. Святогорова, А. Е. Влияние генетического полиморфизма гена РОи^1 на откормочные и мясные качества свиней породы дюрок / А. Е. Святогорова // Неделя науки 2015 : Сборник тезисов, Ростов-на-Дону, 20-24 апреля 2015 года. - Ростов-на-Дону: Южный федеральный университет, 2015. - С. 10-13. -БЭК ОБЕО^.
6. Святогорова А. Е., Третьякова О. Л., Гетманцева Л. В., Святогоров Н. А., Клименко А. И. Влияние полиморфизма гена MC4R на откормочные и мясные качества свиней / Известия НВ АУК. 2022. 2 (66). 298-306. ЭО1: 10.32786/20719485-2022-02-37.
7. Святогорова А. Е., Третьякова О. Л., Гетманцева Л. В., Святогоров Н. А. Исследование ядерного гена гипофизарного фактора транскрипции и его влияние на племенную ценность свиней / Сборник научных трудов Краснодарского научного центра по зоотехнии и ветеринарии. - 2022. - Т. 11. - № 1. - С. 327-331. - ЭО1 10.48612/вЬогшк-2022-1-83. - БЭК КБССОС.
8. Святогорова А. Е., Усатов А. В., Третьякова О. Л., Гетманцева Л. В. Влияние генетического полиморфизма гена MC4R на откормочные и мясные качества свиней породы дюрок / Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины: Материалы VI Международной научно-практической конференции, Ростов-на-Дону, 01-03 октября 2015 года. -Ростов-на-Дону: Южный федеральный университет, 2015. - С. 105-106. - БЭК
9. Святогорова, А. Е. Использование ПЦР тест-систем для диагностики заболеваний в ветеринарии / А. Е. Святогорова, В. В. Чекрышева // Ветеринария Северного Кавказа. - 2023. - № 6. - С. 91-98. - ЭО1 10.56660/77368_2023_6_91. - БЭК Р^^^.
10. Святогорова А. Е., Чекрышева В. В. Перспективы генетического исследования в ветеринарной практике // Ветеринария Северного Кавказа. -2022. - № 4. - С. 34-40. - DOI 10.56660/77368_2022_4_39. - EDN ZLWVZB.
References
1. Doronin M. I., Lozovoy D. A., Shcherbakov A.V., Makarov V. V. Application of the real-time PCR method in veterinary practice // Russian Veterinary Journal. -2020. - No. 2. - pp. 5-12. - DOI 10.32416/2500-4379-2020-2-5-12. - EDN GHGJJS.
2. Glotov A. G., Nefedchenko A.V., Glotova T. I., Koteneva S. V. Development of real-time PCR for identification of pestivirus H in cattle. Molecular diagnostics // Molecular Diagnostics, Moscow, November 09-11, 2021 / A team of authors. -Moscow: LLC Firm "Yulis", 2021. - pp. 178-179. - EDN CDLAUO.
3. Glotova, T. I., Semenova O. V., Glotov A. G. Distribution of Feline calicivirus among cats and its phylogenetic analysis. Molecular diagnostics // Molecular Diagnostics, Moscow, November 09-11, 2021 / A team of authors. - Moscow: LLC Firm "Yulis", 2021. - pp. 184-185. - EDN ITBAFI.
4. Nefedchenko A.V., Glotov A. G., Koteneva S. V., Glotova T. I. Identification and quantitative assessment of viral and bacterial pathogens of respiratory diseases of cattle using real-time PCR // Agricultural biology. - 2021. - Vol. 56. - No. 4. -pp. 695-706. - DOI 10.15389/agrobiology.2021.4.695rus. - EDN SPTTQP.
5. Svyatogorova, A. E. The influence of genetic polymorphism of the POU1F1 gene on the fattening and meat qualities of Duroc pigs / A. E. Svyatogorova // Science Week 2015 : Collection of abstracts, Rostov-on-Don, April 20-24, 2015. -Rostov-on-Don: Southern Federal University, 2015. - pp. 10-13. - EDN GFEDJL.
6. Svyatogorova A. E., Tretyakova O. L., Getmantseva L. V., Svyatogorov N. A., Klimenko A. I. Influence of MC4R gene polymorphism on fattening and meat qualities of pigs / Izvestiya NV AUK. 2022. 2 (66). 298-306. DOI: 10.32786/20719485-2022-02-37.
7. Svyatogorova A. E., Tretyakova O. L., Getmantseva L. V., Svyatogorov N.
A. Investigation of the nuclear gene of the pituitary transcription factor and its effect о
88
on the breeding value of pigs / Collection of scientific papers of the Krasnodar Scientific Center for Animal Science and Veterinary Medicine. - 2022. - Vol. 11. -No. 1. - pp. 327-331. - DOI 10.48612/sbornik-2022-1-83 . - EDN KECCGC.
8. Svyatogorova A. E., Usatov A.V., Tretyakova O. L., Getmantseva L. V. The influence of genetic polymorphism of the MC4R gene on the fattening and meat qualities of Duroc pigs / Actual problems of biology, nanotechnology and medicine : Proceedings of the VI International Scientific and Practical Conference, Rostov-on-Don, October 01 -03, 2015. - Rostov-on-Don: Southern Federal University, 2015.
- pp. 105-106. - EDN ZEODDZ.
9. 10. Svyatogorova, A. E. The use of PCR test systems for the diagnosis of diseases in veterinary medicine / A. E. Svyatogorova, V. V. Chekrysheva // Veterinary Medicine of the North Caucasus. - 2023. - No. 6. - pp. 91-98. - DOI 10.56660/77368_2023_6_91. - EDN PIQZWW.
10. Svyatogorova A. E., Chekrysheva V. V. Prospects of genetic research in veterinary practice // Veterinary Medicine of the North Caucasus. - 2022. - No. 4.
- pp. 34-40. - DOI 10.56660/77368_2022_4_39. - EDN ZLWVZB.
УДК 619:616.993.192 DOI: 10.56660/77368 2023 7 89
НОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ БЕНЗТИОФЕНА, ОБЛАДАЮЩИЕ СОЧЕТАННОЙ АНТИПРОТОЗОЙНОЙ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ
АКТИВНОСТЬЮ
Л. Н. Фетисов - ведущий научный сотрудник, к.в.н., ОЯСГО: 0000-00022618-1079, SPIN-код: 8809-2266, АиШогГО: 508873
А. А. Зубенко - главный научный сотрудник, д.б.н., ОЯСГО: 0000-0001-79437667, SPIN-код: 7776-8122, АиШогГО: 180846
А. Е. Святогорова - младший научный сотрудник, к.с.-х.н., ОЯСГО: 00000003-4233-1740, SPIN-код: 2369-0027, АиШогГО: 719399
Э. Н. Авагян - лаборант-исследователь, ОЯСГО: 0009-0005-1466-5972, SPIN-
код:5981-4820, АиШогГО: 1186642
89
