CC BY
28Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия» Том 19 (58). 2006. № 3. С. 121-130.
УДК 591.1: 615.849.11
ПРИМЕНЕНИЕ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО МИКРОСПЕКТРАЛЬНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ КАТЕХОЛАМИНОВ В ЛЕЙКОЦИТАХ КРОВИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ
Чуян Е.Н., Махонина М.М., Костюк И.В.
В настоящее время общепризнанно, что в формировании ответа организма на действие раздражителей различной природы и интенсивности существенную роль играет симпатоадреналовая система (САС), как одна из основных стресс-реализующих систем организма. Ее как центральное гипоталамическое, так и периферические звенья (в частности, адреномедуллярное) активно участвуют в формировании адаптационных реакций [1, 2].
В наших предыдущих исследованиях [3] показано изменение активности САС при гипокинетическом (ГК) стрессе, изолированном и комбинированном с ГК воздействии низкоинтенсивного электромагнитного излучения крайне высокой частоты (ЭМИ КВЧ). Кроме того, поскольку на основании представления о стресс-лимитирующих системах [4] можно полагать, что защитный эффект этих систем при стрессе состоит в том, что они взаимодействуют со стресс-реализующими системами, ограничивая активацию последних, мы изучили взаимодействие САС с системой эндогеннных опиоидных пептидов (ОпП) - одной из главных стресс-лимитирующих систем организма [5]. В этих экспериментальных исследованиях мы использовали гистофлуоресцентный [6, 7] и цитохимический [8] методы, адекватно характеризующие функциональную активность САС. Однако применяемые нами и другими исследователями гистофлуоресцентные методы, в основе которых лежит способность глиоксалевой кислоты образовывать при взаимодействии с моноаминами флюорофоры, позволяют в основном выявлять определенные изменения морфологических характеристик разных отделов САС при различных воздействиях, а, следовательно, не дают возможности получить точные количественные характеристик наблюдаемых изменений. Кроме того, эти методы являются очень трудоемкими и требуют сложной, дорогой аппаратуры. Наиболее простым в техническом исполнении является цитохимический анализ катехоламинов (КА) в эритроцитах периферической крови [7], позволяющий судить об изменении активности САС в целом, поскольку содержание КА в этих клетках коррелирует с уровнем адреналина и норадреналина в плазме крови [9, 10]. Однако и этот метод не лишен недостатков, поскольку является полуколичественным, а значит, связан с субъективизмом оценки полученных результатов.
Вместе с тем в настоящее время активно разрабатываются методы, позволяющие in vivo исследовать функциональные изменения органов и тканей на клеточном и молекулярном уровнях. Наиболее перспективными и активно разрабатываемыми подходами для решения подобных задач являются флуоресцентные методы. Основными преимуществами люминесцентной микроскопии являются высокая чувствительность (чувствительнее обычных цито- и гистохимических методов не менее чем в 1000 раз), возможность количественного измерения содержания различных химических компонентов ткани и клеток, доступность аппаратуры [11].
В связи с этим целью данной работы явилось обоснование применения микроспектрального люминесцентного анализа для определения содержания КА в лейкоцитах крови крыс при воздействиях ЭМИ КВЧ, стресса и введения налоксона, что может дать важную информацию о состоянии обмена КА в организме.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Экспериментальная часть работы выполнена на 80 белых беспородных белых крысах-самцах, массой 180 - 220 граммов, полученных из опытно-экспериментального питомника Института Гигиены и Медицинской Экологии, фирма «Феникс» (г. Киев).
В экспериментальные группы отбирали животных одинакового возраста и веса со средней двигательной активностью и низкой эмоциональностью, определяемых в тесте «открытого поля». Такой отбор позволил сформировать однородные группы животных, однотипно реагирующих на воздействия. Предварительно отобранные животные были разделены на восемь групп по десять особей в каждой.
К первой группе относились животные, которые в течение девяти суток содержались в обычных условиях вивария и служили биологическим контролем (К). Крысы второй группы ежедневно подвергались 30-тиминутному воздействию ЭМИ КВЧ на затылочно-воротниковую область (КВЧ). Третью группу составляли крысы, находившиеся в условиях экспериментальной стресс-реакции, которая моделировалась девятисуточным ограничением подвижности (гипокинезия, ГК). Крысы четвертой группы подвергались комбинированному воздействию ГК и ЭМИ КВЧ (ГК+КВЧ).
Воздействие ЭМИ КВЧ осуществляли ежедневно с 8.30 до 11.00 часов по 30 минут в течение девяти суток с помощью одноканальных генераторов «Луч. КВЧ-071» (регистрационное свидетельство № 783/99 от 14.07.99, выданное КНМТ МОЗ Украины о праве на применение в медицинской практике в Украине): рабочая длина волны - 7,1 мм; плотность потока мощности - 0,1 мВт/см2; частота модуляции 10±0,1 Гц; габаритные размеры излучателя, выполненного в виде «точки» - 18 x 23 мм. Для осуществления контроля над наличием ЭМИ и его мощности на выходе канала излучателя использовали сервисный прибор «РАМЕД. ЭКСПЕРТ» (ТМ 0158.00.00.00. - СП). Приборы изготовлены Центром радиофизических методов диагностики и терапии «РАМЕД» Института технической механики НАНУ, г. Днепропетровск.
ГК создавалась путем помещения крыс в специальные кассеты из оргстекла (140 х 60 х 60 мм для каждой крысы), в которых они находились в течение девяти суток по 20 часов. Ограничение подвижности крыс в клетках-пеналах вызывает стрессовую реакцию, которая зависит от степени жесткости ГК [12]. В течение четырех остальных часов проводили экспериментальные исследования, кормление и уход за животными. Полученная экспериментальная модель позволила создать одинаковую степень «жесткости» ГК для всех животных, что является необходимым условием для получения сопоставимых результатов.
Крысам пятой (К+Н), шестой (КВЧ+Н), седьмой (ГК+Н) и восьмой (ГК+КВЧ+Н) групп дополнительно с описанными экспериментальными воздействиями вводили синтетический блокатор рецепторов ОпП внутримышечно (наружная поверхность бедра) налоксон в дозе 0,4 мг/кг.
Налоксон-М 0,04% раствор по 1 мл в ампулах, разработка ГНЦЛС, г. Харьков и ХГФП «Здоров'я народу». Налаксон-М является ((-)-17-аллил-4,5(-эпокси-3,14-дигидроксиморфин-6-он) гидрохлорида дигидратом, принадлежит к группе неселективных блокаторов всех субтипов опиоидных рецепторов (ОР), устраняет центральное и периферическое действие ОпП, включая эндогенные эндорфины, проникает через гематоэнцефалический и плацентарный барьеры. Препарат вводили в течение девяти дней эксперимента в одно и то же время с 8.00 до 10.00 часов, т.е. за 30 минут до КВЧ-воздействия. Это связано с тем, что при внутримышечном введении начинает действовать через 2-3 минуты, продолжительность его действия 2,5-3 часа, средний период полувыведения составляет 1 - 1,5 часа [13].
Забор периферической крови осуществлялся в первые, третьи, пятые, седьмые и девятые сутки эксперимента путем пункции хвостовой вены.
Содержание КА в лейкоцитах периферической крови проводили по методу В. Falck [14] в модификации В.П. Новицкой [15]. Метод основан на реакции моноаминов с формальдегидными парами, в ходе которой образуются флуоресцирующие соединения, дающие ярко-зеленое свечение. Иных методов выявления моноаминов в мазках периферической крови в доступной нам литературе мы не встретили, тогда как определения уровня моноаминов в клетках крови могло бы дать важную информацию о состоянии обмена моноаминов в организме.
Установка для регистрации спектров люминесценции одиночных лейкоцитов состоит из люминесцентного микроскопа МЛ-4 со спектрализующим устройством (фотометрическая насадка ФМЭЛ-1К), фотоэлектронного умножителя (ФЭУ -прибор, необходимый для преобразования света в электрический ток), аналогово-цифрового преобразователя, персонального компьютера. Для регистрации и обработки сигналов с микрофлюориметра была написана программа (автор -Попов В.В.) (рис. 1).
После инкубации в формальдегидных парах мазки крови исследовали под глицериновой иммерсией с использованием люминесцентного микроскопа на длине волны 450 нм при длине возбуждающего света 405 нм. Величину сигнала рассчитывали в условных единицах, что не является истинным показателем абсолютного количества вещества в клетке, но прямо пропорционально этому количеству. Среднее содержание КА рассчитывали после измерения яркости
свечения десяти лейкоцитов в каждом мазке крови. Автофлуоресценцию предметного стекла без мазка крови использовали как контроль и вычитали из средней величины флуоресценции лейкоцитов.
Рис. 1. Интерфейс программы регистрации сигналов микрофлюориметра.
Оценку достоверности наблюдаемых изменений проводили с помощью t-критерия Стьюдента для независимых выборок после проверки на нормальность распределения. Корреляционный анализ проводили по методу Пирсона. Расчеты и графическое оформление полученных в работе данных проводились с использованием программы Microsoft Excell [16] и программного пакета «STATISTICA - 6.0» [17].
Крыс содержали в условиях вивария при температуре 18 - 22оС на стандартном пищевом рационе и в стандартных условиях освещения (12 часов темнота: 12 часов свет). Световая фаза начиналась в 7.00 утра. Эксперименты проводились с соблюдением принципов «Европейской конвенции о защите позвоночных
животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986) и постановления первого национального конгресса по биоэтике (Киев, 2001).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
У интактных животных содержание КА в лейкоцитах находилось в пределах от 98,77±9,85 до 115,30+18,36 усл.ед. Значения этого показателя в контрольной группе животных в течение всех суток эксперимента изменялись незначительно (р>0,05). При введении антагониста ОР налоксона интактным животным содержание КА достоверно не отличалось от значений, зарегистрированных у животных первой группы (рис. 2-А). Эти результаты согласуются с нашими предыдущими исследованиями [5] и с данными о том, что в норме введение налоксона не действует на фоновое артериальное давление [18] и не влияет на порог болевой чувствительности [19]. По-видимому, это связано с тем, что высвобождение ОпП происходит не «тонически», а лишь при отклонении гомеостаза от нормы.
После девятикратного воздействия ЭМИ КВЧ на интактных животных уровень КА в лейкоцитах снизился относительно соответствующих значений этого показателя у животных контрольной группы на 40,87% (р<0,001). Полученные данные согласуются с нашими предыдущими исследованиями, в которых зарегистрировано снижение содержания КА в эритроцитах периферической крови крыс под влиянием ЭМИ КВЧ тех же параметров [5].
Под влиянием вводимого налоксона у животных шестой группы, подвергнутых ежедневному КВЧ-воздействию наблюдалось достоверное повышение значений изученного показателя на 49,61% (р<0,05) относительно значений у животных второй группы (КВЧ) на девятые сутки наблюдения. При этом достоверных различий с контрольной группой животных не наблюдалось (рис. 2-Б), что так же сопоставимо с изменением содержания КА в эритроцитах крови крыс [5]. Таким образом, блокада рецепторов ОпП у животных, нивелировала снижение содержания КА в клетках крови, происходящее под влиянием ЭМИ КВЧ.
При ограничении двигательной активности крыс содержание КА в лейкоцитах возросло на 20,78% (р<0,001) уже к седьмым суткам наблюдения, а максимального значения достигло к девятым суткам ГК и составило 136,58% (р<0,001) относительно значений в контрольной группе (рис. 2-В).
Ежедневное введение налоксона животным, подвергнутым ГК стрессу привело к еще более значительному повышению КА в лейкоцитах уже на пятые сутки (р<0,05) эксперимента, а максимальные различия были зафиксированы на девятые сутки наблюдения (на 14,21%, р<0,001 от уровня этого показателя у гипокинезированных животных, которым налоксон не вводился).
Данные об изменении содержания КА в лейкоцитах крови крыс при действии ГК стресса и вводимого налоксона согласуются с динамикой содержания КА в эритроцитах при тех же экспериментальных воздействиях [5].
160 160п
140 140-
120 120-
100
80 80-
60 60-
40 40-
160 160-
140 140-
120 120-
100 100-
80 80-
60 60-
40 40-
3 5 7
Сутки эксперимента
---КВЧ
- -- КВЧ+н
Б
3 5 7
Сутки эксперимента
160 140 120 100°^ 80 60 40
ГК+КВЧ -ГК+КВЧ+н Г
~ - -I- - " -
г' \ -
3 5 7
Сутки эксперимента
160 140 120 100 80 60 40
Рис. 2. Динамика содержания катехоламинов в лейкоцитах периферической крови интактных крыс (А), при воздействиях ЭМИ КВЧ (КВЧ) (Б), гипокинезии (ГК) (В), их комбинации (ГК+КВЧ) (Г) и введении налоксона (н) (в % относительно значений контрольной группы).
При комбинированном воздействии ГК и ЭМИ КВЧ уровень КА в лейкоцитах значительно отличался от значений этого показателя у животных, которые также находились в условиях ограничения подвижности, но дополнительно не подвергались КВЧ-воздействию (рис. 2-Г). Так произошло достоверное снижение содержания КА в лейкоцитах уже на пятые сутки эксперимента на 43,01% (р<0,05), максимальное снижение наблюдалось на девятые сутки наблюдения и составило 54,46% (р<0,001). Аналогичные изменения при сочетаном действии ГК и ЭМИ КВЧ наблюдались в динамике ЦПС КА в эритроцитах [5].
Введение налоксона животным, подвергнутым комбинированному действию ЭМИ КВЧ и ГК, напротив, привело к увеличению содержания КА на 64,05% (р<0,05) относительно значений этого показателя у животных четвертой группы (ГК+КВЧ) на пятый день эксперимента, а к девятым суткам разница составила 95,70% (р<0,01). При этом содержание КА достоверно не отличалось от значений данного показателя у животных второй группы, находившихся в условиях изолированного ГК стресса, что согласуется с данными по изучению содержжания
1
9
9
1
9
КА в эритроцитах, что согласуется динамикой содержания КА в эритроцитах при тех же экспериментальных воздействиях [5].
Таким образом, в данной работе показано, что динамка содержания КА в лейкоцитах периферической крови крыс, подвергнутых воздействиям ЭМИ КВЧ, ГК, их комбинации и введению налоксона в основном соответствовала изменению цитохимического показателя содержания КА в эритроцитах крови крыс тех же экспериментальных групп [5]. Результаты корреляционного анализа (рис. 3) выявили высокую положительную корреляционную связь между этими показателями (г=0,77, р<0,001). Подобный результат, вероятно, свидетельствует о том, что при изменении концентрации КА в плазме крови происходит изменение содержания не только в эритроцитах, но и в лейкоцитах, которые также выполняют транспортную функцию.
слиеюплм' I _ п|1\|р<л'пл!
.160 -180 500 550 5^0 560 580 300
Ц 1С КА в эЬмтЬоИытэх1 Аси еУ'
Рис. 3. Корреляционная связь между содержанием КА в лейкоцитах и цитохимическим показателем содержания (ЦПС) эритроцитов периферической крови крыс во всех группах экспериментальных животных.
Явление связывания КА с форменными элементами крови (эритроцитами, тромбоцитами, лейкоцитами) обнаружено уже давно [20]. Известно, что при увеличении концентрации КА в крови усиливается и скорость их элиминации. Увеличение содержания КА в плазме крови приводит к повышению депонирующей функции клеток крови [8]. Этому способствуют наличие Р-адренорецепторов на мембранах форменных элементов крови, высокая связующая емкость и адсорбционные свойства этих клеток. Следовательно, выявленные в наших и других исследованиях высокие положительные корреляции между содержанием КА в лейкоцитах и эритроцитах (г = +0,77; р<0,001), весовым коэффициентом
надпочечников и ЦПС КА в эритроцитах (г = +0,88; р<0,05) [3] и лейкоцитах (г = +0,71; р<0,05) (рис. 4), между содержанием КА в плазме крови и их уровнем в эритроцитах (г = +0,95; р<0,05) [10], уровнем КА в мезентериальных лимфозлах, в тимусе, в селезенке и крови крыс (г = +0,67; р<0,05) [21] позволяют считать, что изменение содержания КА в лейкоцитах, определенное микроспектральным флуоресцентным методом, свидетельствует об изменении активности САС в целом.
списюпт г I - п'\!' Ь<п'пп
40
.10 19 30 39 30 39 40 49 90
весовой коэффициент наЧиочечнижов' ЛсиеЧ'
Рис. 4. Корреляционная связь между содержанием КА в лейкоцитах периферической крови крыс и весовых коэффициентов надпочечников у интактных животных, при воздействии ЭМИ КВЧ, гипокинезии и их комбинации.
Следовательно ГК стресс приводит к значительному увеличению активности САС, играющей роль пускового фактора в развитии стресса. Систематическое введение неселективного блокатора всех субтипов ОР налоксона животным, подвергнутым ГК стрессу, способствовало еще большей активации САС, свидетельствующее о том, что при ГК стрессе ОпП могут оказывать защитное действие, ограничивая чрезмерную активацию САС и предупреждая тем самым катехоламиновые повреждения организма [22-25]. Снижение активности САС, происходящее у крыс под влиянием изолированного и комбинированного с ГК миллиметрового излучения низкой интенсивности, блокировалось предварительным введением антагониста ОР - налоксона. Такое явление может быть обусловлено активацией системы ОпП при воздействии ЭМИ КВЧ.
Полученные результаты согласуются с нашими [3, 5] и литературными данными, в которых показано, что в основе изменений функционирования организма при стрессе лежит активация стресс-реализующих систем и, в том числе, САС [26], при этом увеличивается продукция КА, которые играют роль пускового фактора в развитии стресса [27].
Таким образом, применение микроспектрального люминесцентного метода определения содержания КА в лейкоцитах является адекватным для определения изменения активности САС при экспериментальных воздействиях разной природы и интенсивности. Этот метод прост в методическом отношении и при минимальных затратах времени позволяет объективно оценить результаты исследования.
ВЫВОДЫ
1. Динамика содержания катехоламинов в лейкоцитах соответствует изменению этого показателя в эритроцитах крови крыс, что подтверждается корреляционным анализом (г = 0,77, р<0,001).
2. Применение микроспектрального люминесцентного метода определения содержания катехоламинов в лейкоцитах является адекватным для определения активности симпатоадреналовой системы.
Список литературы
1. Пшенникова М.Г. Феномен стресса. Эмоциональный стресс и его роль в патологии // Пат. физиол.
- 2000.- № 2.- С. 25-31.
2. Пшенникова М.Г., Попкова Е.В., Бондаренко Н.А. и др. Катехоламины, оксид азота и устойчивость к стрессорным повреждениям: влияние адаптации к гипоксии // Росс. Физиол. журн.. - 2001.
3. Чуян Е.Н. Нейроиммуноэндокринные механизмы адаптации к действию низкоинтенсивного электромагнитного излучения крайне высокой частоты: Автореф. дисс. ... доктора биол. наук: 03.00.13 / КНУ. - Киев, 2004. - 40 с.
4. Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г., Кузнецова Б.А. Развитие адаптации к стрессу в результате курса транскраниальной электростимуляции // Бюл. экспер. биол. и мед. - 1994. - № 1.- С. 16-18.
5. Чуян О.М., Махонша М.М., Заячшкова Т.В., Джелдубаева Е.Р. Взаeмодiя симпатоадреналово! i ото!дерпчно! систем у реакщях оргашзму на iзольований i комбшований з гiпокiнезiею вплив низькоштенсивного випромшювання надто високо! частоти //Вюник проблем бюлогп i медицини.
- 2006.-№1.- С. 230-236.
6. Axelsson S., Bjoklung М., Falck B., Lindvall O., Svensson L. Glycooxylic acid condensation: a new fluorescencence method for the histochemical demonstration of biogenic monoamines //Acta Physiol. Shand. - 1973. - Vol. 87, № 1. - P. 57-62.
7. Швелев В.Н., Жучкова Н.И. Простой способ выявления адренергических нервных структур в тканях человека и животных с применением раствора глиоксалевой кислоты // Арх. анат., гистол., эмбриол. - 1979. - Т. 76, № 6. - С.114-116.
8. Мардарь А.И., Кладиенко Д.П. Цитохимический способ выявления катехоламинов в эритроцитах // Лаборат. дело. - 1986. - № 10. - С. 586-590.
9. Мардар Г.1. Депонування катехоламшв i структурш змши в еритроцитах за умов порушення функцп симпатико-адреналово! системи // Фiзiол. журн. - 2001. - Т. 47, № 1. - С. 53-60.
10. Малыгина В.И. Симпатоадреналовая система крыс при адаптации к гипокинезии: Автореф. дис... канд. биол. наук: 03.00.13 / СГУ. - Симферополь, 1989. - 23 с.
11. Самойлов В.О., Барский И.Я., Бигдай Е.В. и др. Прижизненная флюориметрия в физиологии и клинике // Мед. техника. - 1997. - №. 3. - С. 3 - 7.
12. Коваленко Е.А., Гуровский Н.Н., Гипокинезия. - М.: Медицина, 1980. - 307 с.
13. Лоуренс Д.Р., Бенитт П.Н. Клин. фармакол. - 1993.- Т. 1-2.- 1358 с.
14. Falck B., Owman C. A detailed methodological description of the fluorescence method for the cellular demonstration of biogenic monoamines. Acta Univ. Lundensis, Section II. - 1965. - № 7.
15. Новицкая В.П. Модификация метода определения моноаминов в лейкоцитах на мазках периферической крови // Клиническая лабораторная диагностика. - № 1. - 2002. - С. 24-33.
16. Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Exсel. - К.: Модмон, 2000. - 319 с.
17. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. - М.: МедиаСфера, 2006. - 312 с
18. Holaday J. W. Cardiovascular consequences of endogenous opiate antagonism //' Biochem. Pharmacol. — 1983.— Vol. 32, № 4 — P. 573—585.
19. Goldstein A., Pryor G.T., Otis L. 5. et al. On the role of endogenous opioid peptides: Failure of naloxone to influence shock escape threshold in the rat // Life Sic. — 1976. — V. 18. — P. 599—604.
20. Утевский А.М, Осинская В.О. Обмен катехоламинов и некоторые механизмы адаптации // Новое о гормонах и механизмах их действия. - К.: Наукова думка, 1977. - С. 123-133.
21. Шурлыгина А.В., Труфакин В.А. Гущин Г.В., Корнева Е.А. Суточные вариации содержания адреналина, норадреналина и Р-адренорецепторов в крови и лимфоидных органах здоровых крыс // Бюллетень экспер. биологии и медицины. - 1999. - Т. 128, № 9. - С. 344-346.
22. Henderson G. Effect of normorphine and enkephalin on spontaneous potentials in the vas deferens // Eur. J. Pharmacol. - 1976. - Vol. 39(2). - P. 409-412.
23. Belle E.A., D'Souza T.J., Zarzour J.Y., Lemieux M., Wong C.C. Hospital epidemic of scabies: diagnosis and control // Can. J. Public. Health. - 1979. - Vol. 70(2). - P. 133-135.
24. Millan M.J. The neurobiology and control of anxious states // Progress in Neurobiology. - 2003. - Vol. 70. - P. 83-244
25. Erdo S. L. Peripheral GABAergic mechanisms // Trends Phami. Sci. - 1985. - Vol. 6. - P. 205-208.
26. Chrousos G.P., Gold P.W. The concepts of stress system disorders: overview of behavioral and physical homeostasis // J. A. M. A. - 1992. - Vol. 267. - P. 1244 - 1252.
27. Селье Г. Очерки об адаптационном синдроме. - М.: Медицина, 1960. - 254 с.
Поступила в редакцию 20.10.2006 г.
