CC BY
36
УДК 612.822.3-f539.19
Вестник СПбГУ. Сер. 3, 2003, вып. 2 (№11)
А. Д. Ноздранее, М. Л. МажКи, Б. Ф Щеголев, В. Б. Плахова, И. В. Рогачевский, С. А. Подзорова, Б. В. Крылов, В. Н. Кокряков
ПРИМЕНЕНИЕ KBАНТОВОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ И МЕТОДА ЛОКАЛЬНОЙ ФИКСАЦИИ ПОТЕНЦИАЛА ДЛЯ ВЫЯСНЕНИЯ ВОЗМОЖНЫХ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ ПИРАЗИНОВ И ДЕФЕНСИНОВ
Медленные натриевые каналы, играющие важную роль в механизмах сенсорной рецепции, структурно связаны с мембранными рецепторами [3]. В качестве исследуемых агонистов этих рецепторов нами исследованы: молекула пиразинкарбоновой кислоты и молекула дефенсина. Пиразинкарбоновая кислота относится к семейству пиразинов, особый интерес к изучению которых обусловлен тем, что некоторые молекулы этого семейства выступают в качестве феромонов* Не менее интересны и дефенсины, которые, являясь эндогенными антибиотиками, играют ключевую роль в инактивации микроорганизмов при фагоцитозе и воспалении [2].
Исследование молекулярных механизмов взаимодействия этих агентов с мембраной сенсорного нейрона должно привести к ответам на несколько фундаментальных вопросов, первый среди которых — вопрос о природе взаимодействия молекул агонистов с мембранными мишенями. Ответ на этот вопрос предполагает знание топографии узнающих участков мембранных белков-мишеней, их функциональных групп, способных взаимодействовать с активными центрами молекул агонистов. Природа и взаимное расположение активных центров мишеней и атакующих молекул приводит к образованию лиганд-рецепторных комплексов за счет формирования электростатических или донор-но-акцепторных связей. Несомненную пользу здесь могут принести современные кван-товохимические методы, дающие представление о пространственном строении молекул агонистов, стерической доступности и химической активности их отдельньсс фрагментов и атомов. Особое внимание при этом уделяется определению в молекулах-лиган-дах активных центров, потенциально ответственных за лиганд-рецепторное связывание. Такими центрами являются атомы, способные вступать в донорно-акцепторные взаимодействия (азот, кислород, сера, фтор), а также сильно заряженные группы (четвертичные амины, анионы кислот). Последующая экспериментальная проверка заключений, произведенных с помощью квантовохимических расчетов, методом локальной фиксации потенциала позволяет подробно исследовать молекулярные механизмы взаимодействия изучаемых молекул-лигандов с возбудимой мембраной сенсорного нейрона.
Методы исследования. Равновесная геометрия и электронное строение молекулы пиразинкарбоновой кислоты (ПКК) были подвергнуты неэмпирическому исследованию в рамках базиса 6-31G* [9] с использованием программы GAUSSIAN 98 [7].-Геометрия молекулы дефенсина кролика NP-1, содержащей 545 атомов, была построена на основании имеющейся первичной аминокислотной последовательности Val-Val-Cys-Ala-Cys-Arg-Arg-Ala-Leu-Cys-Leu-Pro-Arg-Glu-Arg-Arg-Ala-Gly-Phe-Cys-Arg-Ile-Arg-Gly-Arg-Ile-ffis-Pro-Leu-Cys-Cys-Arg-Arg [2, 15] и полностью оптимизирована методом MNDO с помощью комплекса квантовохимических программ GAUSSIAN 98 [7], реализованного на суперкомпьютере Cray-J90-Unicos (США).
© А. Д. Ноздрачев, М. Л. МакКи, Б. Ф. Щеголев, В. Б. Плахова, И. В. Рогачевский, С. А. Подзорова, Б. В. Крылов, В. Н. Кокряков, 2003
Все эксперименты были выполнены на культивируемых изолированных нейронах спинальных ганглиев крыс линии Вистар. Ганглии выделяли из областей L5-S1 спинного мозга новорожденных крысят, наркотизированных нембуталом (50 мг/кг, внутри-брюшинно), и помещали в раствор Хенкса. Ферментативную обработку J14] проводили в течение 8 мин при 37° С в растворе следующего состава: 1 мл раствора Хенкса, 2 мг/мл коллагеназы (тип 1А), 1 мг/мл проназы-Е. В- качестве буфера использовали 10 ммоль HEPES-Na (рН 7,4). После ферментативной обработки ганглии тщательно отмывались путем центрифугирования (1 мин, 900 об./мин) и последующей сменой надосадочной жидкости. Для отмывки и культивирования использовалась среда, состоящая из среды Игла с глютамином, эмбриональной сыворотки коровы (10%), глюкозы (0,6%), ген-тамицина 40 ед./мл. Механическую диссоциацию проводили путем пипетирования. К полученной клеточной суспензии добавляли культуральную среду до достижения соответствующей плотности клеток в объеме чашки Петри. Культуру клеток, состоящую преимущественно из нейронов спинальных ганглиев, получали с помощью предварительного осаждения нервных клеток (шванновских клеток и фибробластов) на пластиковой поверхности 60-миллиметровой чашки Петри в течение 25 мин при 37°С. Далее клетки культивировали на покрытой коллагеном поверхности 16-миллиметровой чашки Петри.
В раббте-использовались следующие стандартные растворы (концентрации представлены в ммоль/л): внеклеточный раствор: NaCl —65, СаСЬ —2, MgCb —2, Choline CI-70, HEPES-Na—10, TTX-0,0001, рН 7,4; внутриклеточный раствор: CsF-100, NaCl —10, CsCl —40, MgCl2 — 2, HEPES-Na —10, рН 7,2. Исключение ионов калия позволило избавиться от всех компонентов калиевого тока, а ионы фтора во внутриклеточном растворе обеспечивали блокирование кальциевых токов [6, 13]. В работе применены реактивы фирмы «Sigma». Все опыты проведены при комнатной температуре 22-24°С.
Регистрацию интегральных ионных токов осуществляли с помощью метода фиксации потенциала в варианте регистрации активности целой клетки «whole-cell» [8]. В работе использовался аппаратно-программный комплекс, включающий в себя усилитель ЕРС 7 (patch-clamp L/M-EPC 7), IBM-совместимый персональный компьютер и систему автоматизации [4]. Система автоматизации служила для формирования программы эксперимента, генерации стимулирующих воздействий на объект в соответствии с выбранной программой для регистрации ионных токов. Экспресс-обработка данных в ходе эксперимента позволяла определять величину «хордовой» проводимости, а также значение эффективного заряда активационной воротной системы (Zef) медленных на-триевьрс каналов. При этом постоянно контролировалась величина последовательного сопротивления (Rs) — принципиально важного параметра ирй количественном исследовании изменений эффективного заряда, поскольку Rs не только определяет динамическую и стационарную погрешность метода [16], но и существенно влияет на точность определения Zef (в наших опытах величина Rs не превышала 2 МОм).
Результаты и их обсуждение. Эффект пиразинкарбоновой кислоты. Действие ПКК с наружной стороны мембраны приводит к изменению ряда характеристик медленных натриевых каналов. Сравнение двух семейств натриевых токов, зарегистрированных до и после действия ПКК, позволяет заключить, что изменяется амплитуда тока (рис. 1). Пиковые вольт-амперные характеристики были построены обычным способом [12]: при подаче последовательности ступенек напряжения (Е) регистрируются амплитудные (пиковые) значения токов (2™**), которые могут бьггь представлены в виде функции fin ax(i?). После приложения ПКК в концентрации 50 нмоль/л становится
Рис. 1. Семейство медленных натриевых токов до (Л) и после (Б) приложения ПКК в концентрации 50 нмоль/л.
Тестирующий потенциал изменялся от -25 до +25 мВ с шагом 10 мВ.. Поддерживаемый потенциал, длительность которого составляла 500 мс, был равен 110 мВ. Токи утечки и емкостные токи вычтены программным способом.
явным изменение крутизны левой (спадающей) ветви (рис. 2). Эффект изменения крутизны становится более наглядным при построении потенциалозависимости «хордовой» проводимости. Эта функция рассчитывается по максимальным (пиковым) значениям натриевого тока следующим образом:
Ош{Е) = 1тах{Е)/{Е - Еыш), (1)
где .Ена ~ величина потенциала реверсии натриевого тока, 1тж(Е) — амплитудное значение тока при деполяризующем потенциале Е. Функция Оца(Е) имеет начальный Б-образный участок, крутизна которого отражает особенности потенциалочувствитель-ности активационного процесса. Крутизна функции С?ма(.Е) определяется величиной эффективного воротного заряда переносимого активационной воротной систе-
мой при Открывании канала. Способ определения до к послс воздействия ПКК
-20 _I_
20
40
£.мВ
-2- о о
I, нА
Рис. 2. Влияние ПКК на пиковую вольт-амперную характеристику медленных натриевых каналов. Функции 1тех(Е) построены по данным контрольного эксперимента (белые кружки) и после приложения 50 нмоль/л ПКК (черные кружки),
иллюстрирован на рис.3, А. Можно предположить, что число открытых каналов (ЛГ0) пропорционально величине хордовой проводимости а число закрытых каналов
(Л/с) соответствует {в^ - вш{Е)}. Тогда [1, 11]
Иш(ЛГ0/ЛГС) = Иш[СМа(Е)/{С^ - СШ(Е)}} Сех?{ге{еЕ/кТ], (2)
Е-^—оо Е-¥—оо 22—►—ОО
где С — константа, — эффективный заряд, выраженный в единицах заряда электрона«, к — постоянная Больцмана, Т — абсолютная температура. Тангенсы углов наклона регрессионных прямых, построенных по первым четырем точкам и определяющих предельную логарифмическую чувствительность [1] к потенциалу медленных натриевых каналов, позволяют наглядно представить величину эффективного заряда их актива-ционной'воротной системы (см. рис.3, А). Действие ПКК (50 нмоль/л) с наружной стороны мембраны приводило к изменению среднего значения от 6,2 ± 0,6 (п = 17, контроль) до 5,1 ± 0,3 (п = 23). Обнаруженный эффект ПКК устранялся предварительным приложением налтрексона (№ГХ) (50 мкмоль/л) к наружной стороне мембраны (рис.3, Б). Сдвиг вправо, в сторону больших Е, функции (2) после воздействия ИТХ совпадает с данными, полученными в'другой работе [3], что может объясняться взаимодействием молекулы ЫТХ с одним из активных центров опиоидного рецептора.
Тот факт, что налтрексон блокирует действие пиразинкарбоновой кислоты, свидетельствует об участии опиоидных рецепторов в «рецепции» этого агента. Его влияние на эффективный заряд в относительно низкой концентрации (Кд приблизительно равно 50 нмоль/л) также свидетельствует о существовании в мембране сенсорного нейрона рецепторной мишени ПКК. Заманчиво предположить, что обнаруженный нами эффект возможного участия опиоидных рецепторов в «рецепции» феромонов может играть важную роль при регуляции поведенческих-реакций в животном царстве.
Расчет равновесной геометрии молекулы ПКК (рис. 4) {Еполн = -450,3 ат. ед.) показал, что ее дипоЛьный момент составляет 1,98 Б. Эффективные заряды на атомах
ä,
f °
X 12
£ 6
-40
Контроль 6,1
ПКК Zeff=5,0
Контроль Zcff=6,6
ШХ+ПКК ZefT=6,6
-20
20 mB
Pitc. 3. Неспецифический антагонист опиоидных рецепторов налтрексон полностью устраняет эффект пиразинкарбоновой кислоты.
А — влияние ПКК на потенциалочувствительность активационной воротноЙГсистемы медленных натриевых каналов. Экспоненциальная функция (уравнение 2),' представленная в логарифмическом масштабе (ось ординат),,позволяет определить значения Zef по тангенсам углов наклона регрессионных прямых, проведенных через 4 начальные точки этих функций в контрольном опыте (белые кружки) и после приложения 50,нмоль/л ПКК (черные кружки), В — предварительное приложение NTX с наружной стороны мембрйны (50 мкмоль/л) полностью устраняет эффект ПКК.
азота равны = —0,469, q(N6) — —0,467. Отметим чрезвычайно важную роль
группы -ОН (Ron = 0,952 Ä, q(О) = -0,680, ?(Н) ~ +0,472), присутствующей в данной молекуле. Можно предположить, что эта гидроксильная группа образовывает одну водородную связь с активным центром мембранного рецептора. Вторая водородная связь, необходимая для того, чтобы этот рецептор был активирован [3], создается вторым активным центром рецептора и атомом азота Ng, обладающим активной неподеленной парой. В результате именно образование этих двух водородных связей приводит к активации рецептора и к передаче сигнала от него к медленным натриевым каналам [3]. Тот факт, что действующая концентрация ПКК очень мала и ее эффект устраняется NTX, подтверждает нашу гипотезу о возможном лиганд-рецепторном взаимодействии этого агента и мембраны сенсорного нейрона.
Механизм действия дефенсина кролика NP-1. Согласно данным наших расчетов (рис. 5), оптимизированная молекула дефенсина NP-1 принимает форму, близкую к эллипсоидальной (с параметрами 30 Ä-18 А-16 Ä), что вполне сопоставимо с экспериментальными данными, полученными для молекулы дефенсина человека HNP-3 (26 Ä45 Ä-15 Ä) [10]. Пространственная структура исследуемой молекулы обладает рядом особенностей. С ее внешней стороны располагаются боковые цепи аргининовых фрагментов, имеющих в составе основные и легко протонируемые гуанидиновые группы, которые во многом определяют гидрофильные свойства этой молекулы. Внутренняя поверхность молекулы NP-1 образована гидрофобными аминокислотами, такими как Leu и Phe, S-S связями и пептидным скелетом. Таким образом, наши расчеты подтверждают, что гидрофильные и гидрофобные функциональные группы разнесены в
н
ю
н
9
В
Рис. 4■ Пространственное строение равновесной конформации молекулы ПКК по данным неэмпирических квантовохимических расчетов в базисе 6-ЗЮ*.
Рис. 5. Пространственное строение равновесной конформации молекулы дефенсина кролика ИР-1 по данным полуэмпирических квантовохимических расчетов методом МЫБО.
пространстве, что позволяет объяснить амфипатические свойства рассматриваемой молекулы.
При проведении полной оптимизации геометрии молекулы КР-1 полуэмпирическим методом М^БО, который в отличие от метода молекулярной механики учитывает элек-трон-электронные взаимодействия, были получены данные о распределении зарядов на атомах и дипольном моменте молекулы дефенсина. Он оказался равным 4,0 Б. Необходимо отметить, что расчетные данные получены для некоторой идеализированной формы молекулы дефенсина. В экспериментальных условиях рН физиологического раствора, в котором находится мембрана, составляет 7,4. При этом часть боковых гуани-диновых групп, входящих в состав неравномерно распределенных по внешней стороне молекулы аргининовых остатков, оказываются протонированными. Это обеспе-
чивает усиление электростатического взаимодействия дефенсина с цнтоплазматической мембраной, несущей (в случае бактериальной мембраны) значительный отрицательный заряд. Полученные результаты позволяют сформулировать требования к новым лекарственным ^бстанциям, которые на этапе их «доставки» к мембране-мишени должны
> ^^
обладать такими электростатическими свойствами (заряд, дипольный момент), которые обеспечили бы выполнение первого этапа молекулярного взаимодействия субстанции и клетки.
Второй этап этого взаимодействия связан с «узнаванием» и лиганд-рецепторным взаимодействием. Ранее было показано [5], что эта молекула способна селективно (в стехиометрии 1:1) связываться с неидентифицированным рецептором мембраны сенсорного нейрона. Связывание осуществляется, видимо, с участием стерически доступной гидроксильной группы, направленной наружу относительно молекулы дефенсина. Эта гидроксильная группа входит в состав карбоксильной у-группы Glu14, расположенной на внешней поверхности молекулы. При оптимизации геометрического строения было учтено [15], что в исследуемой молекуле присутствуют три внутримолекулярных дисульфидных мостика: Cys3-Cys31, Cys5-Cys20, Cys10-Cys30, придающих глобу-лоподобной молекуле пептида повышенную устойчивость к возможному гидролизному действию протеиназ и стабилизирующих вторичную структуру пептидной молекулы. Полученные ранее экспериментальные данные свидетельствуют о том, что дефенсин NP-1 имеет единственный центр связывания с мембранной мишенью сенсорного нейрона, но ею служит совершенно иной, чем в случае ПКК, мембранный рецептор, также включенный последовательно в цепь мембранной сигнализации, афферентным звеном которой являются медленные натриевые каналы.
Действительно, согласно наиболее известной гипотезе [15], антибиотики «узнают» клетки бактерий благодаря значительному заряду их поверхностной мембраны, поэтому этап молекулярного узнавания обусловлен электростатическими характеристиками системы антибиотик-мишень. Экспериментальные данные [5], свидетельствующие о дозозависимости со стехиометрией 1:1 действия дефенсина в очень низких концентрациях, указывают на существование в мембране сенсорного нейрона специфической мишени дефенсина.
Таким образом, в настоящей работе нами показано, что, используя данные квантово-химических расчетов вместе с экспериментальными данными, полученными с помощью метода локальной фиксации потенциала, можно предложить лиганд-рецепторный механизм биологического действия таких структурно и функционально различающихся соединений, как ПКК и дефенсин NP-1. Впервые рассчитанная величина дипольно-го момента непротонированной формы молекулы дефенсина оказалась равной 4,0 D. Эта величина в сумме с электростатическим вкладом от протонированных боковых гуанидиновых групп, видимо, достаточна для того, чтобы механизм узнавания дефен-сином отрицательно заряженной бактериальной мембраны имел электростатическую природу. Действие же дефенсинов на нейрональную мембрану имеет совершенно другую природу. Наши данные свидетельствуют: у указанной молекулы своя мишень на мембране сенсорного нейрона, а их взаимодействие осуществляется, похоже, по лиганд-рецепторному механизму. Сформулированный выше подход, комбинирующий экспериментальные и расчетные методы, позволяет исследовать механизмы взаимодействия мембранных белков-(их активных центров) и активных атомов атакующих молекул.
Работа выполнена при поддержке ПрЪграммы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине» (X» 10103-267).
Summary
Nozdrachev A. D., МсКее M. L., Shchegolev В. F., Rogachevsky I. V., Plakhova V. В., Podzorova S. А., Krylov В. V.. Kokryakov V. N. Application of quantumchemical methods and patch-clamp method for investigation of probable mechanisms of ругаяпез and defensins action.
An approach to study the action of different , agents to rat dorsal ganglia sensory neuron membranes combining the patch-clamp experimental and quantum chemical techniques is discussed using the examples of pyrazinecarbonic acid and rabbit defensin NP-1. It is shown that both molecules decrease the effective charge of activation gating system. This process depends upon the concentration of agents in question. The optimized structures of defensin and pyrazinecarbonic acid molecules were obtained by MNDO and Hartree-Fock-Ruthaane with 6-31G* basis set ab initio calculations, correspondingly. The calculated value of dipole moment for defensin molecule is ц = 4,0 D. It is suggested that the probable interaction mechanism for defensin molecule with sensory neuron membrane is of receptor origin, rather than of the electrostatic one.
Литература
1. Алмерс В. Воротные токи и движение зарядов в возбудимых мембранах // Мембраны: ионные каналы. М., 1981. С. 129-236. 2. Кокряков В. Н. Биология антибиотиков животного происхождения. СПб., 1999. 3. Крылов Б. В., Дербенев А. В., Подзорова С. А., Людыно М.И., Кузьмин А. В., Изварина Н. Л. Морфин уменьшает чувствительность к потенциалу медленных натриевых каналов // Физиол. журн. 1999. Т. 85, №2. С. 225-236. 4. Крылов Б. В., Подзорова С. А., Вилин Ю.Ю. Кинетика инактивации натриевых каналов сенсорных нейронов зависит от вида буфера водородных ионов // Физиол. журн. 1996. Т. 82, №7. С. 1-10. 5. Плахова В. Б., Щеголев Б. Ф., Рогачевский И. В., Ноздрачев А. Д., Крылов Б. В., Подзорова С. А., Кокряков В. Н. Возможный молекулярный механизм взаимодействия дефенсина с мембраной сенсорного нейрона // Физиол. журн. 2000. Т. 86, if* 11. С. 1471-1480. 6. Elliott A. A., Elliott J.R. Characterization of TTX-sensitive and TTX-resistant sodium currents in small cells of adult rat dorsal root ganglia //J. Physiol. 1993. Vol. 463. P. 39-56. 7. Frisch M. J., Trucks G. W., Schlegel H. В., Gill P. M. W., Johnson B. G., Robb M. A., Cheeseman J. R., Keith Т., Peters son G. A., Montgomery J. A., Raghavachari K., Al-Laham M. A., Zakrzewski V. G., Ortiz J. V., Fores-man J. В., Cioslowski J., Stefanov В. В., Nanayakkara A., Challacombe M., Peng C. Y., Ayala P. Y., Chen W., Wong M. W., Andres J. L., Replogle E. S., Gomperts R., Martin R. L., Fox D. J., Binkley J. S., Defrees D. J., Baker J., Stewart J. P., Head-Gordon M., Gonzalez C., Pople J. A. // Gaussian, Inc. Pittsburgh (PA), 1998. 8. Hamill O. P., Marty A., Neher E., Sackmann В., Sigxvorth F. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches // Pfluegers Arch. 1981. Vol.391, N2. P. 85-100. 9. Hehre W.J., Ditchfield R., Pople J.. A. Self-consistent molecular orbital methods. XII. Further extensions of Gaussian-Type basis sets for use in molecular orbital studies of organic molecules // J. Chem. Phys. 1972. Vol.56, N 5. P.2257-2261. 10. Hill C. P., Lee J., Selsted M. E., Eisenberg D. Crystal structure of defensin HNP-3, an amphiphilic dimer: mechanisms of membrane per-meabilization // Science. 1991. Vol.251. P. 1481-1485. 11. Hodgkin A.L., Huxley A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve //J. Physiol. 1952. Vol.117, N 4. P. 500-544. 12. Hodgkin A. L., Huxley A. F. Current carried by sodium and potassium ions through membrane of giant axon of Loligo // J. Physiol. 1952. Vol. 116, N 4. P. 449-472. 13. Kostyuk P. G., Krishtal O.A., Pidoplichko V.I. Effect of internal fluoride and phosphate on membrane cuurents during intracellular dialysis of nerve cells // Nature. 1975. Vol. 257, N 5528. P. 691-693. 14. Kostyuk P. G., Veselov-sky M.S., Tsyndrenko A. Y. Ionic currents in the somatic membrane of rat dorsal root ganglion neurons // Neuroscience. 1981. Vol.6, N 12. P.2423-2430. 15. Lehrer R. /.', Lichtenstein A. K., Ganz T. Defensins: antimicrobial and cytotoxic peptides of mammalian cells // Annu. Rev. Immunol. 1993. Vol. 11. P. 105-128. 16. Osipchuk Y. V., Timin E. N. Electrical measurements on perfused cells // Intracellular Perfusion of Excitable Cells / Ed. by P. G. Kostyuk and O. A. Krishtal. London, 1984. P. 103-129.
Статья поступила в редакцию 16 января 2003 г.
