CC BY
16
УДК: 616-089 DOI: 10.24412/1609-2163-2022-2-43-46 EDN DBAYGH
ПРИМЕНЕНИЕ КЛЕТОЧНО-ИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ В ХИРУРГИЧЕСКОМ ЛЕЧЕНИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ
АРТЕРИЙ КРУПНОГО ДИАМЕТРА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
О.В. ДРАКИНА*, А.И. СОКОЛОВ**, Е.В. БЛИНОВА*, Д.О. ШМАТОК**, А.Л. ИСТРАНОВ*, А.Ю. ГЕРАСИМЕНКО***
*ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), ул. Трубецкая, д. 8 стр. 1, г. Москва, 119991, Россия **ФГБОУ ВО «Национальный исследовательский Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва»,
ул. Советская, д. 68, г. Саранск, 430005, Россия ***Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Национальный исследовательский университет «Московский институт электронной техники», площадь Шокина, д. 1, г. Зеленоград, 124498, Россия
Аннотация. В работе были проведены имплантации трехмерных клеточно- и тканеинженерных конструкций природного происхождения, изготовленных в лаборатории ФГАОУ ВО «МИЭТ» методом лазерной печати, в область экспериментального дефекта брюшной аорты в опытах на лабораторных крысах. Цель исследования: изучение имплантации и васкуляризации трехмерных клеточно- и тканеинженерных конструкций в область экспериментального дефекта брюшной аорты в опытах на лабораторных крысах. Материалы и методы исследования. Наркотизированным белым лабораторным крысам линии Vistar наносили поперечное повреждение стенки брюшной аорты на протяжении 2-3 мм, после чего дефект ушивали 2-мя узловыми швами и закрывали его тканеинженерной конструкцией и тканеинженерной конструкцией, заселенной клетками. Через 4, 8 и 12 недель животных выводили из эксперимента, оценивали результаты имплантации и васкуляризацию мест повреждения с помощью морфологических, иммуногистохимических и биохимических методов. Результаты и их обсуждение. Имплантация тканеин-женерных конструкций на артериальный сосуд сопровождалась более интенсивной репарацией с формированием неоинтимы и гиперплазии гладкомышечных клеток при наличии стволовых клеток на матриксе тканеинженерной конструкции, заселенной клетками, что также подтверждается более высокой экспрессией Кг-67 и УБОР в опытах. Конструкция на аорте рассасывалась к 12 неделе после проведения имплантации. В случае с тканеинженерной конструкцией, полной биодеградации к 12 неделе добиться не удавалось, однако наблюдалась активная васкуляризация места повреждения, что подтверждалось увеличением сосудистых компонентов на единицу площади по результатам морфометрического анализа. Выводы. Полученные результаты могут рассматриваться в реконструктивной сердечно-сосудистой хирургии с точки зрения укрепления линии сосудистых швов за счёт клеточных технологий, что влияет на прочность зоны реконструкции, в том числе, в долгосрочной перспективе.
Ключевые слова: трехмерные клеточно- и тканеинженерные конструкции, ТКТК, К ТКТК крыса, повреждение, имплантация, васкуляризация, брюшная аорта.
IMPLANTATION OF CELL-ENGINEERED STRUCTURES IN THE EXPERIMENTAL SURGICAL TREATMENT OF
LARGE DIAMETER ARTERIAL INJURIES
O.V. DRAKINA*, A.I. SOKOLOV**, E.V. BLINOVA*, D.O. SHMATOK**, A.L. ISTRANOV*, A.Yu. GERASIMENKO***
*The First Moscow State Medical University (Sechenov University), Trubetskaya Str., 8-2, Moscow, 119991, Russia **N.P. Ogarev Mordovia State University, Bolshevistskaya Str., 68, Saransk, 430005, Russia
'"National Research University of Electronic Technology, Shokin Square, Bld. 1, Zelenograd, Moscow, 124498, Russia
Abstract. In the work, an implantation of three-dimensional cellular and tissue-engineered structures produced by the laboratory of the Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Education "MIET" by laser printing was carried out on an experimental abdominal aortic injury site in experiments on laboratory rats. The research purpose is to study the implantation and vascularization of three-dimensional cell- and tissue-engineered constructs in the area of an experimental defect in the abdominal aorta in experiments on laboratory rats. Materials and research methods. For this purpose, a 2-3 mm transverse incision has been performed on the anesthetized white laboratory rats of the Vistar line abdominal aorta. After that the incision was sutured by 2 interrupted sutures with tissue-engineered structures and tissue-engineered structures, populated with cells application. After 4, 8, and 12 weeks, the animals were taken out of the experiment, and the results of implantation and vascularization of injury sites were evaluated using morphological, immunohistochemical and biochemical methods. Results and its discussion. The implantation of tissue-engineered structures on an arterial vessel is accompanied by a more intense restoration with the neointima and smooth muscle cells hyperplasia formation in the presence of stem cells on the matrix of TCTS, which is also confirmed by a higher expression of Ki-67 and VEGF in experiments. The structure applied to the aorta resolves by 12 weeks after implantation. In the case of TCTS, a complete biodegradation was not achieved by 12 weeks, however, an active vascularization of the injury site was observed, that was confirmed by an increase of vascular components per unit area according to the results of morphometric analysis. Conclusions. Thus, the obtained results may be useful in reconstructive cardiovascular surgery in terms of strengthening the line of vascular sutures due to cellular technologies, which affects the strength of the reconstruction zone, including in the long-term follow-up period.
Keywords: tissue engineering constructs, TCTC, C TCTC, rat, injury, implantation, vascularization, abdominal aorta.
Введение. Заболевания сердечно-сосудистой системы в структуре смертности стоят на первом месте во всем мире, при этом унося около 17,9 миллионов жизней ежегодно. Согласно опубликованным данным Всемирной Организации Здравоохранения (World Health Organization), охватывающим период с 2000 по 2019 года, болезни сердца и магистральных сосудов остаются лидирующими причинами смертности уже более 20 лет. Кардиологические заболевания составляют на сегодня 16% всех случаев смертности в мире [3]. Основными причинами ужасающей мировой статистики сердечно-сосудистой патологии являются: мультифокальный атеросклероз (ишемическая болезнь сердца, цереброваскулярные заболевания, обли-терирующий атеросклероз висцеральных артерий и артерий нижних конечностей), травматическое повреждение артерий, развитие аневризм аорты и других магистральных сосудов, ревматические заболевания сердца, врождённые пороки развития, а также более редкая патология [1,5]. Частота развития аневризм брюшного отдела аорты составляют 29-37,8% от всех локализаций данного заболевания. При этом у 40% пациентов в течение первого года наблюдается разрыв аневризмы аорты, что является показанием к экстренному хирургическому лечению.
В современной медицине и биоинженерии биологические тканеинженерные и клеточно-инженер-ные конструкты довольно широко применяются для изучения потенциальных лекарственных средств, моделирования заболеваний, для стимуляции регенерации тканей органов. Одним из основоположников исследований «мезенхимальных стволовых клеток» является Российский учёный Фриденштейн А.Я., который показал их эффективность в репарации соединительной ткани [6,7]. Вместе с тем, современная молекулярная биология позволяет использовать последние достижения клеточных технологий в клинической хирургии, в том числе, для нужд сердечно-сосудистой хирургии [4]. В частности, в условиях in vitro была установлена способность фибробластов, заселенных на каркасные биодеградируемые конструкции, при определенных условиях стимулировать восстановление собственных сосудистых тканей, и, тем самым, восстанавливать целостность сосудистых структур на протяжении, что может быть использовано в реконструктивной сосудистой хирургии.
Цель исследования - изучение имплантации и васкуляризации трехмерных клеточно- и тканеинже-нерных конструкций в область экспериментального дефекта брюшной аорты в опытах на лабораторных крысах.
Материалы и методы исследования. Объектом исследования являлись тканеинженерные трехмерные конструкции (ТКТК) биодеградируемые на основе веществ природного происхождения и тканеин-женерные конструкции, заселенные клетками (К
ТКТК). Образцы ТКТК были изготовлены в лаборатории ФГАОУ ВО «МИЭТ» методом лазерной печати (рис. 1*) [2]. Стволовые клетки фибробластов крыс, которыми заселяли ТКТК, были получены в лаборатории культур тканей Института вирусологии им. Д.И. Ивановского. У наркотизированных животных забирали брюшную аорту и переносили в стерильную чашку Петри, с помощью ножниц и пинцета измельчали до кусочков величиной 4-7 мм, дважды промывали фосфатно-буферным раствором от слизи и элементов крови. Добавляли чистую питательную среду, антибиотик и переносили в колбу. Затем фрагменты аорты подвергались трипсинизации 0,25%-ным раствором трипсина и центрифугированию при 1000 об/мин. Осадок клеток ресуспензировали в питательной среде (1:10) при температуре 37 °С, добавляли по 0,5 мл 0,1%-гокристаллвиолета в растворе лимонной кислоты и перемешивали. Затем каплю суспензии помещали в счетную камеру Горяева и подсчитывали количество клеток, имеющих заметное ядро и неповрежденную цитоплазму для получения в дальнейшем качественного монослоя. Для культивирования клеток пробирки и флаконы заполняли суспензией клеток. Снятие культуры при пересеве производили на 5 сутки. Культуральные флаконы (матрасы) с клетками просматривали под микроскопом при увеличении 70-х и отбирали с полноценным монослоем и прозрачной средой. Из подготовленного матраса с клетками ростовую среду сливали в стерильный флакон и добавляли растворы Версена и 0,25% раствора химотрипсина. Далее сливали основную часть раствора (85-90%), наблюдали клетки при температуре 37 °С в течение 5 минут. За это время происходило «набухание» клеточного слоя и отслоение от поверхности стекла. При проведении экспериментальных исследований in vitro использовалась культуральная среда ДМЕМ.
Исследование было выполнено на 36 лабораторных белых крысах обоего пола линии Vistar с исходной массой 250-300 г, которые были разделены на 4 группы: 1-я - ложнооперированные животные, 2-я - группа контроля, 3-я - группа животных с ТКТК, 4-я - группа животных с К ТКТК, заселенная клетками. Наркотизированных животных укладывали на операционный столик производства фирмы «Precision Instruments» (США) на спину с фиксацией лапок и производили срединную лапаротомию с последующим выделением брюшной аорты. При помощи микрохирургического пинцета и скальпеля наносили поперечное повреждение стенки сосуда на протяжении 23 мм, после чего дефект зашивали 2-мя узловыми швами. На поврежденное место фиксировали фрагмент ТКТК и К ТКТК размером 2*2 мм четырьмя узловыми швами и ушивали рану (рис. 2).
Гистологическую проводку осуществляли по
* Рисунки данной статьи представлены на обложке 2
стандартной методике. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином по Хелленда-хелю. Для иммуногистохимических (ИГХ) исследований использовали мышиные антитела к К-67 - клон ММ1 (NovoCastra, Великобритания), УБОБ Мопос1о-nalAntibody (клон ]И121, Invitrogen, США) и РСШ (клон РС10, Dako, Дания, разведение 1:100). Иммуногисто-химический анализ реакции проводили в 6 полях зрения (3 поля брались из зоны имплантации ТКТК и 3 -из периферических отделов сердца) с помощью микроскопа «ОЬУЫРШВХ51» (Япония) при увеличении >100 и ><200.
С целью мониторинга общего состояния животных после имплантации ТКТК и возможных нежелательных реакций в плазме крови животных всех групп изучали концентрацию аспарагиновой амино-трансферазы, аланиновой аминотрансферазы, щелочной фосфатазы, общего белка, креатинина, общего билирубина и мочевины сухим способом на автоматическом ветеринарном биохимическом Японском экспресс-анализаторе FUJI-DRI-CHEM 4000ге. Проводили мониторирование АД, ЭКГ неинвазивным способом. Исследование выполнено при поддержке гранта Президента РФ НШ-843.2022.3.
Таблица 1
Значения некоторых биохимических показателей крыс и кроликов (М±Ж) на фоне имплантации клеточно- и тканеинженерных конструкций
Результаты и их обсуждение. Имплантация ТКТК, заселенной клетками и без клеточных элементов не вызвала гибели животных ни в одной из экспериментальных групп. Также на всех сроках наблюдения за животными не регистрировали увеличения сывороточной концентрации печеночных трансами-наз, что свидетельствовало об отсутствии цитолити-ческого синдрома. Концентрация общего билирубина в плазме периферической крови не повышалась выше референсных значений. Данный факт на фоне неизменной активности щелочной фосфатазы подтверждал отсутствие признаков эндогенной интокси-
кации. Показатели общего белка в крови не изменялись на фоне имплантации конструкций животным (табл. 1). Также регистрировали отсутствие динамики мочевины и креатинина, глюкозы и холестерина. Имплантация тканеинженерных конструкций на артериальный сосуд сопровождается более.
Интенсивной репарацией с формированием неоинтимы и гиперплазии гладкомышечных клеток при наличии стволовых клеток на матриксе (К ТКТК), что также подтверждается более высокой экспрессией К1-67 и УБОБ в опытах как на аортах крыс (рис. 3).
Конструкция на аорте рассасывается к 12 неделе после проведения имплантации. В случае с ТКТК, полной биодеградации к 12 неделе добиться не удавалось, однако наблюдалась активная васкуляриза-ция места повреждения, что подтверждалось увеличением сосудистых компонентов на единицу площади по результатам морфометрического анализа.
По результатам иммуногистохимического исследования на основании оценки интенсивности окрашивания на PCNA и УБОБ были рассчитаны индексы пролиферации (рис. 4).
Как хорошо видно на графике, по обоим изучаемым показателям, в области повреждения в отличие от контрольных участков происходит активация процессов клеточного деления, при этом имплантация клеточноинженерной ТКТК приводит к статистически значимой большей активации регенерационно-пролиферационных процессов в области сосудистого повреждения и более интенсивным явлениям неоан-гиогенеза (по показателю УБОР).
Выводы. Таким образом, в результате выполненного исследования нами получены результаты, которые можно обобщить в следующие выводы:
1. Экспериментально-хирургическая методика воспроизведения повреждения сосуда с последующей одномоментной имплантацией клеточно- и тканеинженерной конструкции к зоне повреждения позволяет воспроизвести клинически-релевантный подход к изучению новых интервенционных технологий клеточной артериопластики.
2. Экспериментально-хирургическая имплантация клеточно- и тканеинженерной конструкции на основе углеродных нанотрубок на поврежденный сосуд не приводит к развитию реакции отторжения, не вызывает явлений эндогенной интоксикации и нарушений выделительной функции почек у лабораторных крыс.
3. Имплантация тканеинженерных конструкций на артериальный сосуд приводит к активации репара-тивного процесса в месте повреждения, в том числе с формированием новых сосудов в регенерирующих тканях. При этом, имплантация сопровождается более интенсивной репарацией с формированием неоинтимы и гиперплазии гладкомышечных клеток при
Группа АСТ U/л АЛТ U/л Билируби н мкмоль/л Общий белок г/л ЩФ U/л Альбуми н г/л
Клеточноинженерная ТКТК
Референ с 10-20 5-15 4,5-20,5 20-60 150-250 10-30
Крысы 4 нед. 13,8±2,3 11,3±1,4 6,5±1,2 28,5±2,3 219,5±8,5 11,1±2,3
Крысы 8 нед. 15,7±1,2 9,1±2,2 7,5±2,2 23,25±3,7 203,6±6,1 12,1±1,7
Крысы 12 нед. 11,8±1,5 10,0±1,3 9,2±1,5 28,4±1,0 132,3±7,7 11,2±1,4
Тканеинженерная ТКТК
Крысы 4 нед. 16,3±8,3 10,7±2,8 10,5±3,2 26,5±2,3 206,5±5,1 13,2±2,5
Крысы 8 нед. 14,6±3,1 7,9±3,6 8,2±1,4 29,8±2,2 211,0±3,4 12,2±1,5
Крысы 12 нед. 12,7±2,6 10,8±2,7 12,4±1,7 25,7±3,1 224,9±7,9 12,9±2,3
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2022 - Vol. 29, № 2 - P. 43-46
наличии стволовых клеток на матриксе (тканеинже-нерная конструкция, заселенная клетками), что также подтверждается более высокой экспрессией Ki-67 и VEGF. Индексы пролиферации, рассчитанные по уровню экспрессии PCNA и VEGF свидетельствуют об индукции клеточной дифференцировки и неоангиоге-неза в области механического повреждения сосуди-стой стенке. Имплантация клеточноинженерной кон-струкции ведет к статистически более значимой акти-вации вышеуказанных процессов.
Таким образом, полученные результаты могут рассматриваться в реконструктивной сердечно-сосудистой хирургии с точки зрения укрепления линии сосудистых швов и повлиять на прочность зоны реконструкции за счёт клеточных технологий, в том числе, в долгосрочной перспективе. Также данный высокотехнологичный материал в виде тканеинже-нерной конструкции, заселенной клетками - может быть применён для ускорения процессов создания неоинтимы изнутри ауто- и аллотрансплантатов, а также, для создания внутреннего слоя сосудистых протезов.
Литература / References
1. Атеросклероз (краткие сведения истории развития, причины, патогенез заболевания, факторы риска, принципы профилактики) / И.А. Латфуллин [и др.]. Казань.: Изд-во Казан. ун-та, 2015. 144 с. / Latfullin IA, et al. Ateroskleroz (kratkie svedeniya istorii razvitiya, prichiny, patogenez zabolevaniya, faktory riska, prin-tsipy profilaktiki) [Atherosclerosis (brief information on the history of development, causes, pathogenesis of the disease, risk factors, principles of prevention)]. Kazan'.: Izd-vo Kazan. un-ta; 2015. Russian.
2. Блинова Е.В., Герасименко А.Ю., Соколов А.И., Шматок Д.О. Оценка эффективности тканеинженерных конструкций при ишеми-ческом повреждении сердца в эксперименте // Оперативная хирургия и клиническая анатомия (Пироговский научный журнал). 2021.
T. 5, №2. С. 12-18 / Blinova EV, Gerasimenko AYu, Sokolov AI, Shma-tok DO. Otsenka effektivnosti tkaneinzhenernykh konstruktsiy pri ishem-iche-skom povrezhdenii serdtsa v eksperimente [Evaluation of the effectiveness of tissue engineering structures in ischemic heart damage in the experiment]. Operativnaya khirurgiya i klinicheskaya anatomiya (Pirogovskiy nauchnyy zhurnal). 2021;5(2):12-8. Russian.
3. Здравоохранение в России. М.: Стат.сб./ Росстат , 2015. 174 c. / Zdravookhranenie v Rossii [Zdravookhranenie v Rossii]. Moscow: Stat.sb./ Rosstat; 2015. Russian.
4. Иванов Д.В., Субботина Т.И., Лищук А.Н., Колтунов А.Н., Корниенко А.Н., Есион Г.А., Карпенко И.Г. Возможности клеточных технологий в коррекции дислипидемий (обзор литературы) // Вестник новых медицинских технологий. Электронное издание. 2019. №3. Публикация 3-2. URL: http://www.medtsu.tula.ru/VNMT/Bulletin /E2019-3/3-2.pdf (дата обращения 13.05.2019). DOI: 10.24411/20754094-2019-16399 / Ivanov DV, Subbotina TI, Lischuk AN, Koltunov AN, Kornienko AN, Esion GA, Karpenko IG. Vozmozhnosti kletochnyh tehnologij v korrekcii dislipidemij [Potential of cells technologies in correction of dyslipidemia (literature review)]. Journal of New Medical Technologies, e-edition. 2019 [cited 2019 May 13];3 [about 14 p.]. Russian. Available from: http://www.medtsu.tula.ru/VNMT/Bulletin/E2019-3/3-2.pdf. DOI: 10.24411/2075-4094-2019-16399.
5. Покровский А.В., Гаврилюк А.Л. Состояние сосудистой хирургии в 2018 г. // Ангиология и сосудистая хирургия. 2019. Vol. 25, №2 / Pokrovskiy AV, Gavrilyuk AL. Sostoyanie sosudistoy khirurgii v 2018 g. [The state of vascular surgery in 2018]. Angiologiya i sosudi-staya khirurgiya. 2019;25(2). Russian.
6. Фриденштейн А.Я., Петракова К.В., Куролесова А.И., Фролова Г.П. Клетки предшественники для остеогенной и кроветворной тканей // Анализ гетеротопных трансплантантов костного мозга. Цитология. 1968. Т. 5. С. 557-567 / Fridenshteyn AYa, Petrakova KV, Ku-rolesova AI, Frolova GP. Kletki predshestvenniki dlya osteogennoy i krovetvornoy tkaney [Progenitor cells for osteogenic and hematopoietic tissues]. Analiz geterotopnykh transplantantov kostnogo mozga. Tsitologiya. 1968;5:557-67. Russian.
7. Friedenstein A.J., Gorskaya U.F., Kulagina N.N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hemopoietic organs // Exper He-matol. 1976. Vol. 4. P. 267-274 / Friedenstein AJ, Gorskaya UF, Kulagina NN. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hemopoietic organs. Exper Hematol. 1976;4:267-74.
Библиографическая ссылка:
Дракина О.В., Соколов А.И., Блинова Е.В., Шматок Д.О., Истранов А.Л., Герасименко А.Ю. Применение клеточно-инженерных конструкций в хирургическом лечении повреждений артерий крупного диаметра в эксперименте // Вестник новых медицинских технологий. 2022. №2. С. 43-46. Б01: 10.24412/1609-2163-2022-2-43-46. EDN ББАУСН.
Bibliographic reference:
Drakina OV, Sokolov AI, Blinova EV, Shmatok DO, Istranov AL, Gerasimenko AYu. Primenenie kletochno-inzhenernykh konstruktsiy v khirurgicheskom lechenii povrezhdeniy arteriy krupnogo diametra v eksperimente [Implantation of cell-engineered struc-tures in the experimental surgical treatment of large diameter arterial injuries]. Journal of New Medical Technologies. 2022;2:43-46. DOI: 10.24412/1609-2163-2022-2-43-46. EDN DBAYGH. Russian.
