CC BY
122
Корнеева О.С., Божко О.Ю.
ГОУ ВПО «Воронежская государственная технологическая академия»
ПРИМЕНЕНИЕ ИЗОМАЛЬТУЛОЗОСИНТАЗЫ ERWINIA ЙИАРОЫПС!
С ЦЕЛЬЮ ТРАНСФОРМАЦИИ САХАРОЗЫ В ИЗОМАЛЬТУЛОЗУ
Выбраны оптимальные условия биосинтеза изомальтулозосинтазы бактериями Егю1п1а гЬаропйеI при глубинном культивировании: температура культивирования 30 оС; исходная величина рН питательной среды 7,5; продолжительность культивирования 54 ч на среде с содержанием сахарозы 10%. Получен электрофоретически гомогенный ферментный препарат с удельной активностью 281,67 Е/мг белка. Определены оптимальные параметры трансформации сахарозы в изомальтулозу: дозировка ИС - 5 Е/мг сахарозы, концентрация сахарозы - 10%, время трансформации - 3 ч.
Ключевые слова: биосинтез изомальтулозосинтазы, трансформация сахарозы в изомальту-лозу,
Актуальной задачей пищевой биотехнологии является поиск натуральных заменителей сахара, не оказывающих отрицательного влияния на организм человека [1]. Одним из таких сахарозаменителей является изомальтулоза (па-латиноза, б-О-б-Б-глюкопиранозид-Б-фрукто-за) - редуцирующий дисахарид, состоящий из остатков глюкозы и фруктозы. Изомальтулоза не вызывает кариеса зубов, ее переваривание незначительно влияет на концентрацию глюкозы и инсулина в крови. Изомальтулоза не метабо-лизируется большинством бактерий и дрожжей, устойчива в кислых растворах [2].
За рубежом изомальтулоза и ее гидроге-низированное производное изомальт широко используются как заменитель сахарозы в продуктах диетического и диабетического назначения [3]. Кроме того, Wu и Birch разработали способ получения изомальтулозы из сахарного тростника путем внедрения в его геном гена микробного происхождения, ответственного за синтез фермента изомальтулозосинтазы [4]. Промышленному получению изомальтулозы с использованием клеток бактерий посвящены исследования Kawaguti [5]. Однако в России исследования по получению изомальтуло-зы отсутствуют. Интерес к изомальтулозе вызван и тем, что данный дисахарид обладает пре-биотическими свойствами и способствует развитию полезной микрофлоры желудочно-кишечного тракта, улучшая иммунную систему организма человека.
Превращение сахарозы в изомальтулозу катализирует фермент изомальтулозосинтаза (ИС) КФ 5.4.99.11, также известный как саха-розоизомераза, б-гликозилтрансфераза [б]. ИС была обнаружена у таких родов микроорганизмов, как Protaminobacter, Erwinia, Serratia,
Pseudomonas, Leuconostoc, Agrobacterium, Enterobacter, Klebsiella [7, 8, 9, 10].
В литературе описывается два типа изо-мальтулозопродуцирующего фермента [10]. Один из них способствует образованию изо-мальтулозы как побочного продукта, например, при каталитическом действии фермента декст-рансахаразы Leuconostoc mesenteroides. Второй тип фермента способствует образованию изо-мальтулозы как одного из нескольких конечных продуктов в процессе каталитического превращения сахарозы. Однако известные продуценты ИС проявляют недостаточно высокую активность к биосинтезу фермента. В связи с этим поиск высокоактивных продуцентов ИС, исследование физико-химических свойств фермента, изучение динамики трансформации сахарозы в изомальтулозу являются актуальной задачей.
Цель работы - оптимизация условий культивирования бактерий E. rhapontici - активного продуцента ИС, исследование физико-химических свойств фермента, изучение динамики трансформации сахарозы в изомальтулозу при оптимальных условиях действия фермента.
Условия эксперимента
Объектом исследования служили бактерии E. rhapontici штамм В-9292 (ВКПМ, г. Москва). Для поддержания и выращивания E. rhapontici использовали мясо-пептонный агар. Культивирование бактерий проводили на среде следующего состава (г/л): пептон - 10; дрожжевой экстракт -5; NaCl - 10; сахароза - 40. Культуру выращивали в периодических условиях в течение 3 суток при температуре 28-30 °С при рН 7,0±0,1.
Отделение культуральной жидкости от бактериальных клеток проводили путем центрифугирования при 8000 g в течение 15 минут. Надо-
садочную жидкость собирали для определения внеклеточной активности фермента. Внутриклеточную активность фермента определяли, отмывая клетки от культуральной жидкости и ресус-пендируя в дистиллированной воде.
При изучении влияния начального рН на активность фермента культуру выращивали на среде с сахарозой (4%), в которой устанавливали значения рН от 4,0 до 9,0 с помощью 1 н NaOH или H2SO4. Содержание сахарозы в среде культивирования варьировали от 2 до 12%.
Об активности фермента судили по изменению концентрации изомальтулозы, полученной в результате трансформации сахарозы, и выражали в Е/см соответственно разбавленной культуры клеток. Количество изомальту-лозы определяли по методу Сомоджи - Нельсона [11]. За единицу активности принимали количество фермента, которое образует 1 мкмоль изомальтулозы за 1 минуту.
Очистку фермента проводили при 0-4 °С в несколько стадий.
1. Гомогенат получали разрушением бактериальных клеток с помощью ультразвукового дезинтегратора УЗДН-2Т при мощности 500 Вт и частоте 22 кГц в течение 2 мин в ледяной бане.
2. Супернатант получали центрифугированием клеточного экстракта при 4000 g в течение 5 минут при 4°С.
3. Ферментную вытяжку пропускали через колонку (1,5x20 см) с сефадексом G-25 (medium) («Pharmacia», Швеция) для освобождения от низкомолекулярных примесей и элюировали со скоростью 0,5 см /мин 0,05 M трис-HCl буфером, рН 6,0. Объем наносимого образца не превышал 4 см . Объем фракций составлял 2 см .
4. Ионообменную хроматографию (ИОХ) проводили на колонке (1,5x12 см) с ДЭАЭ-цел-люлозой («Reanal», Венгрия). Элюцию осуществляли ступенчатым градиентом концентрации КС1 (от 0 до 200 мМ) в трис- HCl буфере рН 6,0. Фракции собирали по 2 см и определяли в них активность фермента. Скорость элю-ции составила 0,3 см /мин.
5. Полученную фракцию наносили на колонку (1,5x10 см) с сефадексом G-150 (superfine) («Pharmacia», Швеция) для очистки от высокомолекулярных примесей и элюировали со скоростью 0,5 см /мин.
Гомогенность определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле (9%) в тече-
ние 2-2,5 ч. при напряжении 260 В и силе тока 5 мА [12]. Для проявления на белок использовали методику с нитратом серебра [13]. ДДС-Ыа-ПААГ-электрофорез осуществляли при концентрации полиакриламидного геля 10% в присутствии 0,1% ДДС-№ после обработки фермента 0,1 М меркаптоэтанолом. Использовался 3% концентрирующий гель с рН 6,8 и 10% разделяющий гель с рН 8,8. В качестве калибровочных белков использовали стандартные белковые маркеры («ДиаМ», Москва).
Определение общего количества белка проводили по методу Лоури и др. [14].
Для изучения влияния рН на активность ИС Е. тНаропґісі изомеризацию сахарозы осуществляли в интервале рН 4,0-8,0. Заданное значение рН субстрата поддерживали с помощью ацетатного буфера в зоне рН 4,0-5,0 и фосфатного в зоне рН 6,0-8,0.
Динамику трансформации сахарозы в изо-мальтулозу изучали при использовании дозировок ферментного препарата ИС от 2 до 18 Е/мг сахарозы, концентрацию сахарозы варьировали в диапазоне значений от 4 до 50%.
Результаты и обсуждение
В результате скрининга микроорганизмов нами был выбран продуцент ИС - Е. тНаропіісі. Активность фермента в 40-50 раз превышала значение активности ранее известных микроорганизмов - продуцентов фермента. В таблице 1 представлена сравнительная характеристика активности ИС различных бактериальных видов.
Определение локализации ИС Е. тЬаропНЫ. Из литературных источников известно, что фермент ИС, синтезируемый такими микроорганизмами, как БеттаЫа рІушиґНіса, РгоґашіпоЬасґет тиЬтиш, имеет внутриклеточную локализацию [10]. Биосинтез ИС выбранного нами продуцента Е. ткаропйсі исследовали при культивировании бактерий в течение 72 часов. Ак-
Таблица 1. Активность ИС различных бактериальных видов
№ Микроорганизмы Активность ИС, E/см 3
1 Pantoea dispersa UQ68J 72,0
2 Protaminobacter rubrum CBS574.77 33,0
3 Klebsiella planticola MX-10 4,3
4 Klebsiella planticola CCRC 19112 9,0 - 12,0
5 Klebsiella sp. LX 3 5 1 2 О
6 Erwinia rhapontici B 9292 3308,7
тивность фермента определяли через каждые 12 часов культивирования в фильтрате культуральной жидкости и в клеточной суспензии бактерий. Установлено, что клетки бактерий проявляли максимальную активность ИС к 54 часам культивирования, которая составляла 4726,8 Е/см соответственно разбавленной культуры клеток. В фильтрате культуральной жидкости активность фермента не была обнаружена.
Оптимизация биосинтеза ИС Е. тЬиропИсг. В качестве факторов, влияющих на биосинтез ИС Е. тНаропйа, были исследованы следующие: продолжительность культивирования, рН среды, температура культивирования, аэрация, концентрация сахарозы в среде.
Исследование активности ИС от исходного значения рН среды культивирования показало, что максимальный биосинтез ИС бактериями Е. тНаропйа наблюдался при рН 7,5. Отклонение рН питательной среды от оптимальных для синтеза фермента значений в кислую и в щелочную сторону способствовало снижению активности ИС.
На биосинтез ИС в процессе культивирования Е. тНаропИа также оказывает влияние температура культивирования. Установлено, что максимальный биосинтез ИС наблюдался при 30 °С. Снижение температуры культивирования до16 °С или повышение температуры до 40 °С в значительной степени угнетало синтез фермента.
Исследование влияния источников углерода на биосинтез бактериями ИС показало, что ферментативная активность проявляется на разных источниках углерода (глюкоза, фруктоза, мальтоза), однако максимальный биосинтез фермента наблюдался на среде с сахарозой, что согласуется с литературными данными [7]. Оптимальной концентрацией сахарозы для биосинтеза ИС в среде культивирования Е. тНаропйа являлась концентрация 10%.
Известно, что бактерии Е. тНаропйа относятся к группе факультативно анаэробных микроорганизмов. Варьируя изменение объема пи-
тательной среды в колбах емкостью 750 см от 100 до 350 см , установили, что максимальное значение активности ИС наблюдалось при содержании питательной среды в колбах в объеме 300 см , т. е. соотношение объема среды к объему кислорода составляло 1:2,5. Дальнейшее увеличение количества кислорода приводило к снижению активности фермента.
Таким образом, оптимальными условиями для глубинного культивирования бактерий Е. ткаропйсі и биосинтеза ими ИС являются следующие: температура культивирования 30 С; исходная величина рН питательной среды 7,5; продолжительность культивирования 54 ч. на среде с содержанием сахарозы 10%.
Очистка фермента, его физико-химические характеристики. Результаты по очистке ИС бактерий Е. ткаропйсі приведены в таблице
2. Был получен гомогенный ферментный препарат со степенью очистки 63,9 и удельной активностью 281,67 Е/мг белка.
Ключевой стадией очистки являлась ионообменная хроматография. Применение в качестве ионообменника ДЭАЭ-целлюлозы позволило получить ИС с высокой степенью очистки (63,9). Пик максимальной активности ИС соответствовал градиенту концентрации КС1, равному 20 мМ, что, вероятно, представляет собой одну изоформу ИС, локализованную в пе-риплазматическом пространстве бактериальной клетки Е. ткаропйсі.
Максимальный выход белка, определенный спектрофотометрически при длине волны 280 нм, наблюдался также при градиенте концентрации КС1, равном 20 мМ, что соответствовало максимальной активности ферментного препарата ИС.
Проведенный электрофоретический анализ очищенного препарата показал наличие одной белковой полосы с Rf = 0,45.
С помощью ДДС-№-ПААГ-электрофоре-за установлено, что фермент является мономером. Молекулярная масса нативного фермента
Таблица 2. Очистка ИС из бактерий Е. ткаропйсі
№ Стадии очистки Общий объем, см3 Общая активность, ФЕ Белок, см3 Удельная активность, Е/мг Степень очистки Выход, %
1 Гомогенат 6,8 921,7 209,0 4,41 1 100
2 Супернатант 5,2 803,6 81,6 9,85 2,23 87,2
3 Гель-фильтрация на G-25 4,0 236,3 20,8 11,4 2,6 25,6
4 ИОХ на ДЭАЭ-целлюлозе 3,0 67,5 0,38 177,6 40,3 7,3
5 Гель-фильтрация на G-150 1,5 33,8 0,12 281,7 63,9 3,7
находится в пределах значений 70-80 кДа, что согласуется с данными литературы. Так, в работе McAllister показано, что молекулярная масса нативной ИС Serratia plymuthica ATCC 15928 равна 79,5 кДа [10]. ИС, очищенная из Klebsiella sp. имеет молекулярную массу 74 кДа [15].
Влияние температуры и рН на активность ИС исследовали в интервале значений температур 20-60 °С и рН 4,0-8,0. Результаты определения оптимальных условий трансформации сахарозы в изомальтулозу показали, что ферментный препарат ИС бактерий E. rhapontici проявлял максимум активности при температуре 30 °С и рН 6,0 (рис. 1 а, б), что характерно для ИС из бактерий рода Erwinia [5,16].
Полученный гомогенный препарат фермента был исследован для определения его функциональных характеристик. Инактивацию фермента изучали в диапазоне рН 4,0-8,0 и температуры 20-60 °С. Ферментный препарат проявлял наибольшую стабильность в интервале температуры 20-30 °С и рН 6,0-7,0 (рис. 2, 3).
На рисунке представлена кислотная инактивация ферментного препарата ИС с удельной активностью 281,67 Е/мг белка. Отклонение рН и температуры от указанного интервала приводило к снижению активности ИС на 20-40%.
Изучение динамики трансформации сахарозы в изомальтулозу ИС Е. ткаропИсї.
Одним из основных факторов, оказывающих значительное влияние на процесс трансформации сахарозы в изомальтулозу, является дозировка ферментного препарата ИС. На рис. 4 представлена зависимость степени трансформации сахарозы от продолжительности процесса при использовании различных дозировок ферментного препарата ИС при 30 °С и рН 6,0.
Внесение 2 Е/мг сахарозы обеспечивало трансформацию субстрата (4%) за 3 ч на 77,5%. При увеличении дозировки препарата до 5 Е/мг сахарозы степень трансформации достигала 95,0%. Внесение 8 Е/мг приводило к тому, что требуемая степень трансформации (не менее 98%) достигалась за 3 ч. Дальнейшее увеличение
а)
б)
♦ ♦ Температура,°С
Рисунок 1. а) Влияние рН на активность ИС E. rhapontici (А- активность фермента);
б) Влияние температуры на активность ИС E. rhapontici (А- активность фермента)
120 100 80 60 40 20 0
Т:
- • \ X
: \ Ї- : г— —о
: V . 4 .
■г. , :
O 1O 2O 3O 4O 5O 6O 7O SO
Рисунок 2. Кинетика кислотной инактивации ферментного препарата ИС E. тkapontici при 30 оС
-■-•• 4^)-.. 6 -х-.. 7 8
Рисунок 3. Кинетика кислотной инактивации ферментного препарата ИС E. ткapontici при 20 оС
4
5
6-х-.. 7
S
дозировки ферментного препарата до 18 Е/мг сахарозы не приводило к значительному усилению степени трансформации и поэтому нецелесообразно.
Важным фактором, от которого зависит действие фермента, является концентрация сахарозы. Зависимость степени трансформации от концентрации сахарозы исследовали при концентрации ферментного препарата 5 Е/мг сахарозы, рН среды 6,0, температура 30 °С (рис. 5).
Как видно из рисунка, при увеличении концентрации сахарозы от 5 до 10% степень трансформации увеличивалась. Если при 5% сахарозы степень трансформации за 3 ч. составляла 61,3%, то при концентрации сахарозы 10% она достигла 87,4%. Дальнейшее увеличение концентрации сахарозы от 20 до 50% приводило к снижению степени трансформации за указанный промежуток времени. Таким образом, концентрация сахарозы 10% является оптимальной для действия ИС. Проведенная серия экспериментов позволила установить следующие рациональные параметры трансформации сахарозы в изо-мальтулозу: дозировка ИС - 5 Е/мг сахарозы; массовая доля сахарозы - 10%, продолжительность изомеризации 3 ч.
На основании полученных данных в дальнейшем будет разработана биотехнология изо-мальтулозы с целью получения природного иммуномодулятора.
Список использованной литературы:
1. Bhosale S.H. Molecular and industrial aspects of glucose isomerase / S.H. Bhosale, M.B. Rao, V.V. Deshpande // Microbiol. Rev. - 1996. - V. 60. - №2. - P. 280 - 300.
2. Cheetham P.S.J. The extraction and mechanism of a noval isomaltulose-synthesizing enzyme from Erwinia rhapontici / P.S.J. Cheetham // Biochem. J. - 1984. - V. 220. - P. 213 - 220.
3. Li X. Substrate induction of isomaltulose synthase in a newly isolated Klebsiella sp. LX3 / X. Li, C. Zhao, Q. An, D. Zhang // Journal of Applied Microbiology. - 2003. - V. 95. - P. 521 - 527.
4. Wu L. Doubled sugar content in sugarcane plants modified to produce a sucrose isomer / L. Wu, R. Birch // J. Plant Biotechnology. - 2007. - №5. - P. 109 - 117.
5. Kawaguti H.Y. Application of response surface methodology for glucosyltrasferase production and conversion of sucrose into isomaltulose using free Erwinia sp. cells / H.Y. Kawaguti, E. Manrich, H.H. Sato // Electronic J. Biotechnology. - 2006. - V. 9. -№5. - P. 482 - 493.
6. Veronese T. Proposition for the biochemical mechanism occurring in the sucrose isomerase active site / T. Veronese, P. Perlot // FEBS Letters. - 1998. - V. 441. - P. 348 - 352.
7. Wu L. Characterization of Pantoea dispersa UQ68J: producer of a highly efficient sucrose isomerase for isomaltulose biosynthesis / L. Wu, R. Birch // Journal of Applied Microbiology. - 2004. - V. 97. - P. 93 - 103.
8. Huang J.H. Conversion of sucrose to isomaltulose by Klebsiellaplanticola CCRC 19112 / J.H. Huang, L.H. Hsu, Y.C. Su // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. - 1998. - V. 21. - P. 22 - 27.
9. Nagai Y. Characterization of б-glucosyltransferase from Pseudomonas mesoacidophila MX-45 / Y. Nagai, T. Sugitani, K. Tsuyuki // Biosci.Biotech.Biochem. - 1994. - V. 58. - №10. - P. 1789 - 1793.
10. McAllister M. The isomaltulose-synthesizing enzyme of Serratia plymuthica / M. McAllister, C.T. Kelly, E. Doyle, W.M. Fogarty // Biotechnol. Lett. - 1990. - V. 12. - P. 667 - 672.
11. Somogyi M.J. Determination of reducing sugar / M.J. Somogyi // J. Biol. Chem. - 1952. - V. 195. - P. 19 - 23.
12. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул/Мир, Москва, 1982, с.149-258.
13. Mann M. Mass spectrometric sequencing of proteins from silver-stained polyacrylamide gels / M. Mann // Anal. Chem. -1996. - V. 68. - №5. - P. 850-858.
14. Lowry O.H. Protein estimation with folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Resebrough, A.L. Farr, R.J. Randell // J. Biol. Chem. - 1951. -V. 193. - №1. - P. 265 - 275.
15. Park Y.K. Biochemical characterization of a microbial glucosyltransferase that converts sucrose to palatinose / Y.K. Park, R.T. Uekane, H.H. Sato // Revista De Microbiologia. - 1996. - V. 27. - P. 131 - 136.
16. Bornke F. Cloning and Charactirization of the Gene Cluster for Palatinose Metabolism from the Phytopathogenic Bacterium Erwinia rhapontici / F. Bornke, M. Hajirezaei, U. Sonnewald // Journal of Bacteriology. - 2001. - V. 183. - №8. - P. 2425 - 2430.
Время трансформации, ч
Рисунок 4. Влияние дозировки ферментного препарата ИС (Е/мг сахарозы) на степень трансформации 4% сахарозы
Время трансформации, ч
л 5 —■—10—0 - 20 --±--30....
Рисунок 5. Степень трансформации растворов сахарозы различной концентрации (%) ферментным препаратом ИС при дозировке 5 Е/мг сахарозы
