CC BY
25
УДК 616-006.81:636.7:615.849.19
ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОСТИМУЛЯТОРОВ И ФОТОТЕРМИЧЕСКОЙ ЛАЗЕРНОЙ ТЕРАПИИ ПРИ МЕЛАНОМЕ У СОБАКИ
© 2007г. Г.С. Терентюк, Л.Ф. Жандарова, О.М. Конопацкова, Е.М. Непомнящая,
Т.Н. Гудцкова, Л.В. Сулейманова, В.А. Черванев, И.Л. Максимова, Б.Н. Хлебцов,
В.А. Богатырев, Л.А. Дыкман, Н.Г. Хлебцов
The paper presents the first results of complex application of immunotherapy and laser photothermolysis with usage of gold nanoparticles at melanoma of mucosa of mouth cavity of dog.
Использование нанотехнологий в медицине - одно из приоритетных направлений в современной науке [14], к разряду которых относится лазерный фототермолиз опухолей с использованием светопоглощающих наночастиц. Конъюгаты золотых наночастиц с вторичными антителами селективно прикрепляются к раковым клеткам. Воздействие лазерного излучения приводит к эффективной деструкции раковых клеток без повреждения здоровых. Излучение в ближнем инфракрасном (ИК) диапазоне не причиняет вреда организму человека, причем в присутствии наночастиц клетки могут нагреваться до 70 °С за 2 мин. Этой температуры достаточно, чтобы уничтожить больные клетки, оставив нетронутым здоровые.
Метод апробирован при лечении собаки с меланомой слизистой полости рта. В марте 2006 г. в
000 «Первая ветеринарная клиника» г. Саратова поступил ризеншнауцер Дик, кобель 10 лет. В результате комплексного обследования, включающего общеклинические, цитологические и гистологические методы, а также, по данным рентгенологического обследования, был верифицирован следующий диагноз: меланома слизистой оболочки ротовой полости (ц.а. № 229-30). Отсутствие увеличенных лимфоузлов и отдаленных метастазов расценено как благоприятное состояние для начала комплексной иммунотерапии в сочетании с лазерным фототермолизом.
Проведено 3 курса иммунотерапии с интервалом
1 мес. 2-й курс сопровождался процедурой лазерного фототермолиза.
Непосредственно в опухоль введено 4 мл золотых нанооболочек с ядром из оксида кремния диаметром 150 нм (плазмонный резонанс на длине волны 700 нм). В течение 8 мин проведено облучение полупроводниковым лазером с длиной волны 808 нм, полная выходная мощность 2,5 Вт. С помощью волоконно-оптической системы формируется гауссов пучок с полушириной 2 см (рис. 1а), температура регистрируется инфракрасным бесконтактным термометром (пирометром) DT-8811 (рис. 1б). Пирометр фиксирует излучение в спектральном диапазоне 6-14 мкм, время одного измерения около 1 с. Расстояние от приемного элемента пирометра до исследуемого объекта 16 см, диаметр площадки, с которой регистрируется инфракрасное излучение, - 2 см, повышение температуры поверхности опухоли - около 8 °С.
До начала лечения у собаки наблюдалась гипоим-муноглобулинемия, причем наиболее резко снижено
Рис. 1. Лазерный фототермолиз: а - облучение полупроводниеовым лазером меланомы собаки после введения золотых наночастиц; б - регистрация температуры бесконтактным перометром
количество иммуноглобулинов 1£;М (до 1,3 и 1,7 г/л). При исследовании гормонального профиля отмечалось снижение кортизола, тиреотропного гормона. Количество паратгормонального белка рассматривалось как показатель тяжести патологического процесса. Показатели биохимического анализа крови свидетельствуют о наличии внутриклеточного цитолиза, гипофосфатемии.
После 1-го курса лечения, включающего применение интерлейкина-11 без использования лазерного воздействия, положительной динамики не наблюдалось, после 2-го улучшились показатели иммуногра-ммы. Произошла нормализация количества иммуноглобулинов ^А, ^М, что позволяет говорить о способности организма собаки связывать токсины и в комплексе с лизосомами инактивировать их. В то же время размах колебаний этих показателей не позволял надеяться, что этот процесс будет эффективен длительное время.
Продолжающийся внутриклеточный цитолиз можно интерпретировать как некоторый гепатотокси-ческий эффект проводимой терапии. Нормализация надпочечниковой недостаточности ко 2-му курсу
Клинические наблюдения
Клинический показатель До лечения Этап лечения
I II III
Размер опухоли, см 53 52 52 54
Пигментация Синяя с черным 25 % дипегментации 30 % дипегментации 10 % дипегментации
Регионарные лимфоузлы Норма Норма Увеличены Увеличены, спаяны конгл.
Отдаленные метастазы - - - Лимфат. узлы, пече., легкие
иммунотерапии давала надежду на более продолжительные компенсаторные явления. Однако после 3-го курса отмечается нарастание кальцитонина, регулирующего кальциево-фосфорный обмен. Снижение уровня фосфора привело к нарушению энергетического обмена в клетках, а также к возникновению полиорганной недостаточности (геперазотемия, гипопротеинемия, гипокалиемия, гипонатриемия).
Рост паратгормоноподобного белка коррелировал с началом появления регионарных лимфоузлов и отдаленных метастазов. Интоксикация вызвала снижение гемоглобина до 84 г/л. Об активности и распространении онкопроцесса свидетельствовала отрицательная динамика иммунограммы, что в совокупности с тотальной надпочечниковой недостаточностью и дисгормонозом привело в конечном итоге к гибели собаки 08.09.06 г.
Размер опухоли после 1 и 2-го этапов лечения несколько уменьшался (таблица).
Наблюдалась также депигментация меланомы, особенно выраженная (на 30 % относительно исходной) после 2-го курса терапии, включавшего применение лазерного фототермолиза (рис. 2).
Рис. 2. Меланома слизистой полости рта собаки на этапах лечения: а - опухоль до лечения; б - опухоль через 10 дней после лазерного воздействия; в - опухоль через 45 дней после
лазерного воздействия
Регионарные лимфотические узлы до лечения и на его 1-м этапе оставались в норме, после 2-го наблюдалось их увеличение, а после 3-го они оказались увеличены и спаяны конгломератом, что указывало на наличие метастазов. Кроме того, на последнем этапе лечения были обнаружены метастазы в печени и легких.
Паталогоанатомическое исследование подтвердило наличие злокачественной меланомы узловой формы. По линии резекции отмечался рост опухолевых клеток с высокими митотической активностью и степенью клеточной атипии, с изъявлениями, накоплением большого количества пигмента и отсутствием созревания меланоцитов в нижних отделах опухоли. Опухолевый уровень инвазии по Кларку - V (прорастание в жировую клетчатку). Выраженная лимфоидная инфильтрация.
В ткани опухоли наблюдалась выраженная дистрофия клеток с разделением их на отдельные гнезда и перераспределением меланина, а также резко выраженным отеком в межклеточном пространстве. Вышеописанная гистологическая картина сходна с III степенью лучевого патоморфоза.
Было проведено электронно-микроскопическое исследование образца ткани опухоли и получена серия трансмиссионных электронных микрофотографий. На электроннограмме (рис. 3а) можно видеть фрагмент меланоцита с многочисленными премеланосомами (Пм) и меланосомами (Мс) в цитоплазме. Наблюдаются явные признаки разрушения клетки: ядро (Я) вакуолизированно (В), цитоплазматическая мембрана разрушена и вещество цитоплазмы (Ц) вышло в межклеточное пространство, за счет чего определяются зоны его разреженности (Р) в самой клетке. Вокруг меланоцита расположены коллагеновые волокна (КВ). Рядом с клеткой среди коллагеновых волокон бесструктурные некротические массы (НМ) - остатки ранее погибших клеток.
На рис. 3б представлен типичный моноцит (клетка лейкоцитарного ряда) с сильно изрезанным ядром (Я), конденсированным по периферии хроматином (Хр), небольшим объемом цитоплазмы, в которой просматриваются митохондрия (М), эндоплазматический рети-кудум (ЭР), небольшие пузырьки (П). Он является непосредственным предшественником макрофофага соединительной ткани. Цитоплазматическая мембрана образует многочисленные псевдоподии (Пс), обеспечивающие передвижение клетки. Моноциты легко мигрируют через эндотелий, выстилающий капил-
ляры и мелкие венулы, оказываясь в рыхлой соединительной ткани, по которой они передвигаются и, достигнув зоны воспаления или некроза, превращаются в макрофаги. Наличие подобных клеток в опухоли указывает на активацию иммунного ответа организма.
Рис.3. Электроннограммы образца опухоли через 45 дней после введения частиц и лазерного облучения (х5700): а - меланоцит; б - моноцит
Полученные результаты позволяют утверждать, что (несмотря на прогностически неблагоприятный диагноз) проводимое лечение позволило отсрочить начало возникновения полиорганной недостаточности, связанной с генерализацией меланомы. Это подтверждается отсутствием изменений показателей красной крови, белкового, пигментного и липидного обмена. Положительным эффектом проводимой иммунотерапии в сочетании с лазерным фототермолизом с использованием золотых наночастиц являлось некоторое уменьшение размеров меланомы на фоне лечения и ее длительная депигментация, а также обнаруженный лечебный патоморфоз на световом и электронно-микроскопическом уровнях. К сожалению, плотность мощности лазерного излучения, применяемая в данном эксперименте, была недостаточной для эффективной гипертермии всей опухоли, учитывая значительные размеры последней.
Работа поддержана грантами CRDG PG05-006-2 и REC-006.
Литература
1. Khlebtsov B.N. et al. // Nanotechnology. 2006. Vol. 17.
P. 5267-5279.
2. Liao H., Nehl C.L., Hafner J.H. // Nanomedicine. 2006. Vol. 1. P. 201-208.
3. Niemeyer C.M., Mirkin C.A. Nanobio technology: concepts, applications and perspectives. Weinheim, 2004.
4. O 'Neal D.P. et al. // Cancer Letters. 2004. Vol. 209. P. 171-176.
Ставропольский государственный медицинский университет, Ставропольский государственный университет,
Первая ветеринарная клиника, г. Саратов, Воронежский государственный аграрный университет, Ростовский научно-исследовательский онкологический институт,
Лаборатория биосенсоров на основе наноразмерных структур ИБФРМ РАН_6 декабря 2006г.
