CC BY
26
cians. India. - 2000. - Vol. 48, № 6. - Р.603-605. 10. Perusicova J. // Vnitr. Lek - 2004. - Vol. 50, № 5. - P.338-343.
9. Maleki D., Locke G.R., Camilleri M, et al. // Arch. Intern. 11. Pourmoehaaaas A., Hekmatnia A. // Mol. Cell. Biochem. -Med. - 2000. - Vol. 160, № 18. - P.2808-2816. 2003. -Vol. 249, № 1-2. - P125-128.
© САФИН Р.Я. - 2007
ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДАВНОСТИ НАСТУПЛЕНИЯ СМЕРТИ
Р.Я. Сафин
(Челябинская государственная медицинская академия, ректор — д.м.н., проф. И.И. Долгушин, кафедра судебной
медицины, зав. — к.м.н., доц. М.И. Губайдуллин)
Резюме. Цель данной работы — оценить возможность использования иммунологических методов исследования для определения давности наступления смерти. Образцы крови, полученные от трупов людей и лабораторных крыс, а так же живых людей, были исследованы, для выявления и сравнения изменений, происходящих в процессе хранения крови в пробирке с посмертными изменениями, которым нейтрофилы крови подвергаются после наступления смерти организма. Это исследование показало, что с увеличением времени, прошедшего после наступления смерти организма, или времени хранения крови in vitro, происходит снижение уровня нейтрофильных лейкоцитов крови, а также их функциональной активности.
Ключевые слова: посмертный интервал, клеточные изменения, нейтрофильные лейкоциты.
Установление давности наступления смерти входит в число самых актуальных проблем судебной медицины. На сегодняшний день, одним из основных направлений в разработке данной проблемы является изучение посмертных процессов, протекающих в органах, тканях и жидкостях трупа, с помощью биохимических, иммунологических, гистохимических, морфологических методов [6]. В частности, ряд работ посвящен изучению аутолитических процессов, протекающих в лейкоцитах трупной крови [3,4,5]. Полученные таким образом результаты, наряду с показателями традиционных методов оценки давности наступления смерти, могут быть использованы для решения вопроса о времени, прошедшем после наступления смерти.
Целью настоящего исследования явилось изучение зависимости изменения некоторых параметров (процентного содержания нейтрофилов крови и оценка их функциональной активности) от времени, прошедшего с момента смерти организма или длительности хранения образцов крови in vitro.
Известно, что в период агонии и после смерти организма нарушается гомеостаз, изменяются концентрации газов, химических элементов, а так же ряда биологически активных веществ. В этих условиях нейтрофильные лейкоциты крови, будучи клетками, легко активирующимися различными изменениями внутренней среды, реагируют на возникающие стимулы изменением функциональной активности [2].
Материалы и методы
Исследования были выполнены на следующих объектах:
1. Образцы крови, полученные путем забора из полостей сердца трупов белых нелинейных лабораторных крыс обоего пола весом 170-280 грамм, находившихся при температуре окружающей среды 16-2ГС. Кровь забирали шприцем из полостей сердца. Забор осуществляли сразу и через 3, 6, 9, 12, 18, 24, 36, 48, 72 часа после гибели животного.
2. Образцы крови, забранные из локтевой вены случайно отобранных живых людей. Полученную кровь смешивали с раствором гепарина из расчета 25 ЕД на 1 мл крови, разделяли по двум стерильным пробиркам и помещали в различные температурные условия: 4°С и 16-2ГС. Исследования данных образцов крови проводились сразу после забора, а так же через 6, 24, 48, 72 часа хранения in vitro при соответствующих постоянных температурных параметрах окружающей среды.
3. Образцы крови, полученные путем забора стерильным шприцем из полости левого желудочка сердца трупов людей с достоверно известным временем и обстоятельствами смерти. Перед дальнейшими манипуляциями кровь в количестве 10 мл смешивалась с раствором гепарина в разведении 1:10 (из расчета 25 ЕД гепарина на 1 мл крови). Исследование материала проводилось сразу же после забора.
Изначально был произведен подсчет процентного содержания нейтрофильных лейкоцитов в полученных образцах крови. Для этого из каждого образца крови бралось по 0,003-0,005 мл крови. Далее готовились мазки, которые высушивались, фиксировались в 96% этиловом спирте и окрашивались по Романовскому-Гимзе. С помощью иммерсионной микроскопии подсчитывалась лейкоцитарная формула.
Функциональная активность нейтрофилов оценивалась с помощью исследования фагоцитарной активности (на модели поглощения частиц латекса диаметром 1,7 мкм (108 частиц/мл), полученного из ВНИИСК (Санкт-Петербург) и внутриклеточного кислородзависимого метаболизма (оценка интенсивности реакции спонтанного и индуцированного теста восстановления нитросинего тетразо-лия) [1].
Полученные данные подвергли статистической обработке с использованием пакета статистических программ “Statistica, version 6.0” компании StatSoft, Inc.
Результаты и обсуждение
Согласно представленным результатам исследований (табл. 1-3), величины показателей процентного содержания нейтрофильных лейкоцитов крови, активности и интенсивности фагоцитоза нейтрофильных лейкоцитов крови, а так же интенсивности реакции спонтанного и индуцированного теста восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) в нейтрофилах крови зависят от длительности хранения образцов крови in vitro или длительности интервала времени, прошедшего после наступления смерти организма. Отмечается закономерное снижение исследованных показателей с увеличением посмертного интервала времени или времени хранения крови in vitro. Статистический анализ с помощью непараметрического метода исследования (критерий Крускала-Уоллиса) показал наличие статистически значимых различий между значениями групп исследованных иммунологических показателей крови в зависимости от давности наступления смерти организма или длительности хранения крови in vitro (критический уровень значимости р при проверке в данном исследовании принимался равным 0,05).
Таблица 1
Динамика изменений исследованных показателей нейтрофильных лейкоцитов трупной крови лабораторных крыс на
различных этапах постмортального периода (М±б)
Показатели Время забора крови от момента наступления смерти, часы
0 3 б 9 12 18 24 3б 48 72
Процент нейтрофильных лейкоцитов крови, % 27,б+ б,80 n-91 22,9+ 8,94 п-12 18,1 + 9,93 п-14 18,9+ 4,38 п-16 16,5+ 5,29 n-20 13,3+ б,22 п-16 11,3+ 5,89 n-22 8,75+ б,84 n-8 2,80+ 2,59 n-5 0,40+ 0,89 n-5
Активность фагоцитоза нейтрофильных лейкоцитов, % 41,1 + 9,59 n-80 29,8+ 4,б2 п-17 23,1 + 5,7б п-14 23,9+ б,27 п-11 20,1 + 4,12 n-10 б,81 + 2,23 п-16 2,85+ 0,97 n-22 1,50+ 0,71 n-5 0,00+ 0,00 n-5 0,00+ 0,00 n-2
Интенсивность фагоцитоза нейтрофильных лейкоцитов, ед. 1,30+ 0,50 n-80 0,72+ 0,20 п-17 0,5б+ 0,17 п-14 0,49+ 0,17 п-11 0,39+ 0,17 n-10 0,10+ 0,04 п-16 0,04+ 0,02 n-22 0,02+ 0,01 n-5 0,00+ 0,00 n-5 0,00+ 0,00 n-2
Интенсивность реакции спонтанного НСТ-теста, усл. ед. 0,0б+ 0,05 п-96 0,09+ 0,0б п-17 0,11 + 0,0б п-14 0,03+ 0,02 п-16 0,02+ 0,02 n-20 0,01 + 0,02 п-16 0,00+ 0,01 n-27 0,00+ 0,00 n-8 0,00+ 0,00 n-5 0,00+ 0,00 n-2
Интенсивность реакции индуцированного НСТ-теста, усл. ед. 0,18+ 0,11 п-96 0,17+ 0,08 п-17 0,20+ 0,08 п-14 0,10+ 0,03 п-16 0,08+ 0,05 n-20 0,03+ 0,02 п-16 0,01+ 0,02 n-27 0,00+ 0,00 n-8 0,00+ 0,00 n-5 0,00+ 0,00 n-2
Примечание здесь и в табл. 2, 3: М — выборочное среднее, 8 — выборочное стандартное отклонение, п — объем выборки (количество наблюдений, случаев).
Проведенные исследования показали почти полное исчезновение нейтрофильных лейкоцитов в крови к концу третьих суток после наступления биологической смерти или хранения крови в пробирке. Это согласуется с дан-
ными других исследователей, которые отмечают полное разрушение нейтрофилов крови в результате аутолиза на сроках бб-9б часов после наступления биологической смерти организма или хранения крови in vitro [3,4,5].
Tаблица 2
Динамика изменений исследованньк показателей нeйтpoфильныx лейкоцитов вдови людей в зависимости от длительности xpaнeния oбpaзцoв вдови in vitro (M±s)
Показатели Время исследования от момента забора крови, часы
0 б 24 48 72
Процент нейтрофильных лейкоцитов крови (образцы крови находились при температуре среды 4оС), % 61,75+ 7,9б n-8 45,2+ 5,б n-5 40,5+ 10,4 n-8 18,0+ 5,б n-8 2,00+ 2,83 n-4
Процент нейтрофильных лейкоцитов крови (образцы крови находились при температуре среды 16-21оС), % 61,75+ 7,9б n-8 45,2+ 7,4 n-5 3б,0+ 9,44 n-8 15,75+ 5,б n-8 1,0+ 2,0 n-4
Активность фагоцитоза (образцы крови находились при температуре среды 4оС), % 42,81+ 21,0 п-21 34,0+ 12,2 п-21 1б,7+ 8,85 n-21 б,7+ б,25 n-20 0,5б+ 1,0 п-16
Активность фагоцитоза (образцы крови находились при температуре среды 16-21оС), % 42,81+ 21,0 п-21 35,3+ 13,9 п-21 16,95+ 10,б n-20 5,39+ 4,5 п-18 0,14+ 0,55 п-14
Интенсивность фагоцитоза (образцы крови находились при температуре среды 4оС), ед. 1,40+ 0,82 п-21 0,82+ 0,35 п-21 0,32+ 0,2 n-21 0,1+ 0,12 n-20 0,01+ 0,01 п-16
Интенсивность фагоцитоза (образцы крови находились при температуре среды 16-21оС), ед. 1,40+ 0,82 n-21 0,95+ 0,б п-21 0,29+ 0,19 n-20 0,08+ 0,07 п-18 0,00+ 0,01 п-14
Интенсивность реакции спонтанного НСТ-теста (образцы крови находились при температуре среды 4оС), усл. ед. 0,48+ 0,24 п-21 0,27+ 0,15 n-21 0,13+ 0,09 n-20 0,01+ 0,01 п-21 0,00+ 0,00 п-17
Интенсивность реакции спонтанного НСТ-теста (образцы крови находились при температуре среды 16-21оС), усл. ед. 0,48+ 0,24 п-21 0,2б+ 0,15 n-21 0,12+ 0,10 n-20 0,01+ 0,01 n-20 0,00+ 0,00 п-16
Интенсивность реакции индуцированного НСТ-теста (образцы крови находились при температуре среды 4оС), усл. ед. 0,70+ 0,30 п-21 0,43+ 0,21 n-20 0,20+ 0,13 n-20 0,04+ 0,03 n-20 0,00+ 0,01 п-17
Интенсивность реакции индуцированного НСТ-теста (образцы крови находились при температуре среды 16-21оС), усл. ед. 0,70+ 0,30 п-21 0,42+ 0,20 n-21 0,19+ 0,13 п-19 0,03+ 0,03 n-20 0,00+ 0,00 п-16
Показатели функциональной активности нейтро-фильных лейкоцитов крови: активность и интенсивность фагоцитоза, интенсивность реакции спонтанного и индуцированного НСТ-теста, во всех сериях исследований наиболее резко снижались в течение первый суток после смерти организма или хранения крови в пробирках. К 72-м часам от момента наступления биологической смерти или хранения образцов крови in vitro функциональная активность нейтрофилов крови почти не определялась.
ду значениями групп соответствующих показателей при одинаковых временных промежутках хранения образцов крови.
В ходе проведенных исследований быто выявлено, что в нейтрофильных лейкоцитах крови после наступления биологической смерти организма или хранения крови in vitro происходят существенные изменения, динамика который находится в зависимости от давности наступления смерти или длительности хранения крови в пробирке.
Tаблица 3
Динамика изменений исследованнык показателей нeйтpoфильныx лейкоцитов тpyпнoй вдови людей на paзличныx этaпax пocтмopтaльнoгo і комода (M± s)
Показатели Время забора крови от момента наступления смерти, часы
9.00- 11.59 12.00- 17.59 18.00- 23.59 24.00- 35.59 3б.00- 47.59 48.00- 71.59 Более 72.00
Количество случаев, п 1 5 б 12 7 2 2
Процент нейтрофильных б4,0+ 61,2+ 54,5+ 50,83+ 4б,29+ 4б,0+ 14,00+
лейкоцитов крови, % 0,0 9,7б 10,1 12,1 11,3 0,0 2,83
Активность 44,0+ 40,80+ 38,33+ 3б,б7+ 29,71+ 17,00+ 5,00+
фагоцитоза, % 0,0 15,1 10,6 11,9 9,83 12,7 1,41
Интенсивность 1,44+ 0,7б+ 0,59+ 0,84+ 0,58+ 0,21+ 0,07+
фагоцитоза, ед. 0,0 0,37 0,22 0,48 0,27 0,18 0,01
Интенсивность реакции 0,24+ 0,21+ 0,14+ 0,14+ 0,10+ 0,05+ 0,00+
спонтанного НСТ-теста, усл. ед. 0,0 0,10 0,0б 0,04 0,02 0,01 0,00
Интенсивность реакции 0,б0+ 0,48+ 0,37+ 0,31+ 0,18+ 0,09+ 0,01+
индуцированного НСТ-теста, усл. ед. 0,0 0,22 0,11 0,09 0,05 0,01 0,01
Так же быто проведено исследование иммунологических показателей нейтрофильных лейкоцитов крови людей, хранившейся в пробирках при различныгх температурных условиях окружающей среды (табл. 2). При статистическом анализе полученный результатов с использованием критерия Манна-Уитни не было вышв-лено статистически значимых различий (р=0,05) меж-
Полученные результаты в значительной степени расширяют существующие представления о динамике посмертный изменений в нейтрофильныгх лейкоцитах крови и могут иметь научно-прикладное значение в судебной медицине (возможность использования иммунологических методов исследования для определения давности наступления смерти).
THE USE OF IMMUNOLOGICAL METHODS IN ESTIMATING THE TIME OF DEATH
R.J. Safin (Cheljabinsk State Medical Academy)
The aim of this research was to study the usefulness of immunological methods for estimating time of death. Blood samples which were obtained from human and rat cadavers and alive persons have been evaluated to observe and compare changes, during the in vitro storage and postmortem changes that neutrophils undergo throughout the given postmortem intervals. This study showed significantly lower level of neutrophils and its functional activity, compared with the increasing of time after death or in vitro storage.
ЛИТЕРАТУРА
1. Долгушин И.И., Бухарин О.Б. Нейтрофилы и гомеостаз. — Екатеринбург: УрО РАН, 2001. — 278 с.
2. Пальцын А.А., Захарова О.А., Каем Р.И. и др. Элеетрон-но-радиографическое исследование жизнеспособности клеток человека после смерти. Посмертная активация синтеза РНК в нейтрофилах // Бюл. экспериментальной биологии и медицины. — 1991. — Т 111, № 2. — С. 199-201.
3. Babapulle C.J., Jayasundera N.P. Cellular changes and time since death // Med. Sci. Law. — 1993. — Vol. 33, № 3. —
P.213-222.
Dokgoz H., Arican N., Elmas I., et al. Comparison of morphological changes in white blood cells after death and in vitro storage of blood for the estimation of postmortem interval // Forensic Science Int. — 2001. — Vol. 124, № 1. — P.25-31.
Laiho K., Penttila A. Autolytic changes in blood cells and other tissues of human cadavers viability and ion studies // Forensic Science Int. — 1981. — Vol. 17, № 2. — P109-120. Henssge C., Knight B., Krompecher T., et al. The estimation of the death in early postmortem period. — London: Edward Arnold, 2002. — 271 p.
4
5
б
