Научная статья на тему 'ПРИМЕНЕНИЕ ХИТОЗАН-КОЛЛАГЕНОВОГО КОМПЛЕКСА С НАНО-ЧАСТИЦАМИ СЕРЕБРА И ХИМОТРИПСИНОМ В ЛЕЧЕНИИ ГНОЙНО-НЕКРОТИЧЕСКИХ РАН'

ПРИМЕНЕНИЕ ХИТОЗАН-КОЛЛАГЕНОВОГО КОМПЛЕКСА С НАНО-ЧАСТИЦАМИ СЕРЕБРА И ХИМОТРИПСИНОМ В ЛЕЧЕНИИ ГНОЙНО-НЕКРОТИЧЕСКИХ РАН Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

CC BY
470
67
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ГНОЙНО-НЕКРОТИЧЕСКАЯ РАНА / ХИТОЗАН-КОЛЛАГЕНОВЙ КОМПЛЕКС / ХИМОТРИПСИН / НАНОЧАСТИЦЫ СЕРЕБРА / ГИДРОКСИПРОЛИН / ЛЕЧЕНИЕ РАН / PURULENT-NECROTIC WOUND / CHITOSAN-COLLAGEN COMPLEX / CHYMOTRYPSIN / SILVER NANOPARTICLES / HYDROXYPROLINE / WOUND TREATMENT

Аннотация научной статьи по клинической медицине, автор научной работы — Бежин А.И., Липатов В.А., Фрончек Э.В., Григорьян А.Ю., Наимзада М.Д.З.

Цель исследования - изучить ранозаживляющее свойство хитозан-коллагенового комплекса с наночастицами серебра и химотрипсином при местном воздействии на гнойно-некротическую рану в эксперименте и оценить его токсическое воздействие на печень и почки. Материалы и методы исследования. Материалом для исследования послужило раневое покрытие из полиэлектролитного хитозан-коллагенового комплекса, которое представляло собой высокопористую губку размером 22*0,4 см. Объектом исследования были крысы -самцы породы Вистар, которым моделировалась гнойнонекротическая рана. В ходе исследования были применены следующие методы: планиметрический, бактериологический, гистологический, биохимический, гематологический, статистический. Результаты и их обсуждение. При планиметрии ран было отмечено, что к 21 суткам площадь раны сократилась на 98,8 (98,4; 99,2)%. При этом максимальная скорость заживления была на 5-10 и 10-15 сутки и составляла 7 (4,8; 8,2) и 8 (6,3; 10,2)%/сутки соответственно. В анализе крови отмечался лейкоцитоз с лимфоцитозом и гранулоцитопенией. Уровень лейкоцитов и лимфоцитов нормализовался к 21 и 15 суткам соответственно. Обсемененность ран к 21 суткам снижалась более чем в 65 раз от исходного значения. Уровень гидроксипролина в тканях раневого дефекта к 21 суткам возрастал в 2,5 раза от исходного. К 21 суткам при гистологическом исследовании наблюдалось завершение фазы пролиферации и начало процессов ремоделирования плотной волокнистой соединительной ткани с последующим изменением пространственной конфигурации волокнистого каркаса. Проведенное исследование подтвердило эффективность применения раневого покрытия с химотрипсином и нано-частицами серебра в лечении гнойно-некротических ран в эксперименте. Заключение. Таким образом, применение хитозан-коллагенового комплекса с нано-частицами серебра и химотрипсином при местном воздействии на гнойно-некротическую рану стимулирует процесс заживления, не оказывает пагубного влияния на печень и почки, и может быть рекомендован для дальнейшего исследования на доклиническом уровне.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по клинической медицине , автор научной работы — Бежин А.И., Липатов В.А., Фрончек Э.В., Григорьян А.Ю., Наимзада М.Д.З.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Application chitosan-collagen complex nano-particles of silver and chymotrypsin in the treatment of purulent necrotic wounds

The research purpose was to study the wound-healing property of the chitosan-collagen complex with silver nanoparticles and chymotrypsin at a local effect on the purulent-necrotic wound in the experiment and to evaluate its toxic effect on the liver and kidneys. Materials and methods. The material for the study was a wound covering of the polyelectrolyte chitosan-collagen complex, which was a highly porous sponge 2*2*4.4 cm in size. The object of the study was Wistar male rats, which were used to simulate a purulent-necrotic wound. During the study, the following methods were applied: planimetric, bacteriological, histological, biochemical, hematologic, statistical. Results. It was noted that by 21 days the wound area had decreased by 98.8 (98.4; 99.2) %. The maximum healing rate was 5-10 and 10-15 days and was 7 (4.8; 8.2) and 8 (6.3; 10.2) % day, respectively. In the analysis of blood was observed leukocytosis with lymphocytosis and granulocytopenia. The level of leukocytes and lymphocytes returned to normal by 21 and 15 days, respectively. Wound contamination by 21 days decreased by more than 65 times from the initial value. The level of hydroxyproline in the tissues of the wound defect by21 days increased 2.5 times from the original. By21 days, histological examination showed the completion of the proliferation phase and the beginning of the remodeling process of dense fibrous connective tissue with the subsequent change in the spatial configuration of the fibrous skeleton. The study confirmed the effectiveness of the use of wound dressing with chymotrypsin and silver nano-particles in the treatment of purulent-necrotic wounds in the experiment. Conclusion. The use of chitosan-collagen complex with silver nano-particles and chymotrypsin with a local effect on the purulent-necrotic wound stimulates the healing process, does not adversely affect the liver and kidneys, and can be recommended for further research at the preclinical level.

Текст научной работы на тему «ПРИМЕНЕНИЕ ХИТОЗАН-КОЛЛАГЕНОВОГО КОМПЛЕКСА С НАНО-ЧАСТИЦАМИ СЕРЕБРА И ХИМОТРИПСИНОМ В ЛЕЧЕНИИ ГНОЙНО-НЕКРОТИЧЕСКИХ РАН»

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2019 - V. 26, № 3 - P. 23-28

УДК: 616-001.4-002.3-08-092.9 DOI: 10.24411/1609-2163-2019-16419

ПРИМЕНЕНИЕ ХИТОЗАН-КОЛЛАГЕНОВОГО КОМПЛЕКСА С НАНО-ЧАСТИЦАМИ СЕРЕБРА И ХИМОТРИПСИНОМ В ЛЕЧЕНИИ ГНОЙНО-НЕКРОТИЧЕСКИХ РАН

А.И. БЕЖИН*, В .А. ЛИПАТОВ*, Э.В. ФРОНЧЕК**, А.Ю. ГРИГОРЬЯН*, М.Д.З. НАИМЗАДА*

*Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации,

ул. Карла Маркса, д. 3, Курск, 305041, Россия "ООО «Эверс Груп Рус», ул. Флотская, д. 5, Москва, 125493, Россия

Аннотация. Цель исследования - изучить ранозаживляющее свойство хитозан-коллагенового комплекса с нано-частицами серебра и химотрипсином при местном воздействии на гнойно-некротическую рану в эксперименте и оценить его токсическое воздействие на печень и почки. Материалы и методы исследования. Материалом для исследования послужило раневое покрытие из полиэлектролитного хитозан-коллагенового комплекса, которое представляло собой высокопористую губку размером 22x0,4 см. Объектом исследования были крысы -самцы породы Вистар, которым моделировалась гнойно-некротическая рана. В ходе исследования были применены следующие методы: планиметрический, бактериологический, гистологический, биохимический, гематологический, статистический. Результаты и их обсуждение. При планиметрии ран было отмечено, что к 21 суткам площадь раны сократилась на 98,8 (98,4; 99,2)96. При этом максимальная скорость заживления была на 5-10 и 10-15 сутки и составляла 7 (4,8; 8,2) и 8 (6,3; 10,2)/6/сутки соответственно. В анализе крови отмечался лейкоцитоз с лимфоцитозом и гранулоцитопенией. Уровень лейкоцитов и лимфоцитов нормализовался к 21 и 15 суткам соответственно. Обсемененность ран к 21 суткам снижалась более чем в 65 раз от исходного значения. Уровень гидроксипролина в тканях раневого дефекта к 21 суткам возрастал в 2,5 раза от исходного. К 21 суткам при гистологическом исследовании наблюдалось завершение фазы пролиферации и начало процессов ремоделирования плотной волокнистой соединительной ткани с последующим изменением пространственной конфигурации волокнистого каркаса. Проведенное исследование подтвердило эффективность применения раневого покрытия с химотрипсином и нано-частицами серебра в лечении гнойно-некротических ран в эксперименте. Заключение. Таким образом, применение хитозан-коллагенового комплекса с нано-частицами серебра и химотрипсином при местном воздействии на гнойно-некротическую рану стимулирует процесс заживления, не оказывает пагубного влияния на печень и почки, и может быть рекомендован для дальнейшего исследования на доклиническом уровне.

Ключевые слова: гнойно-некротическая рана, хитозан-коллагеновй комплекс, химотрипсин, нано-частицы серебра, гидроксипролин, лечение ран.

APPLICATION CHITOSAN-COLLAGEN COMPLEX NANO-PARTICLES OF SILVER AND CHYMOTRYPSIN IN THE

TREATMENT OF PURULENT NECROTIC WOUNDS

A.I. BEZHIN*, V.A. LIPATOV*, E.V. FRONCHEK**, A.YU. GRIGORYAN*, M.D.Z. NAIMZADA*

"Kursk State Medical University, К Marx Str., 3, Kursk, Kursk region, 305041, Russia ""Evers Group Rus", Flotskaya St, 5, Moscow, 125493, Russia

Abstract. The research purpose was to study the wound-healing property of the chitosan-collagen complex with silver nano-particles and chymotrypsin at a local effect on the purulent-necrotic wound in the experiment and to evaluate its toxic effect on the liver and kidneys. Materials and methods. The material for the study was a wound covering of the polyelectrolyte chitosan-collagen complex, which was a highly porous sponge 2x2x4.4 cm in size. The object of the study was Wistar male rats, which were used to simulate a purulent-necrotic wound. During the study, the following methods were applied: planimetric, bacteriological, histological, biochemical, hematologic, statistical. Results. It was noted that by 21 days the wound area had decreased by 98.8 (98.4; 99.2) %. The maximum healing rate was 5-10 and 10-15 days and was 7 (4.8; 8.2) and 8 (6.3; 10.2) % day, respectively. In the analysis of blood was observed leukocytosis with lymphocytosis and granulocytopenia. The level of leukocytes and lymphocytes returned to normal by 21 and 15 days, respectively. Wound contamination by 21 days decreased by more than 65 times from the initial value. The level of hydroxyproline in the tissues of the wound defect by 21 days increased 2.5 times from the original. By 21 days, histological examination showed the completion of the proliferation phase and the beginning of the remodeling process of dense fibrous connective tissue with the subsequent change in the spatial configuration of the fibrous skeleton. The study confirmed the effectiveness of the use of wound dressing with chymotrypsin and silver nano-particles in the treatment of purulent-necrotic wounds in the experiment. Conclusion. The use of chitosan-collagen complex with silver nano-particles and chymotrypsin with a local effect on the purulent-necrotic wound stimulates the healing process, does not adversely affect the liver and kidneys, and can be recommended for further research at the preclinical level.

Keywords: purulent-necrotic wound, chitosan-collagen complex, chymotrypsin, silver nano-particles, hydroxyproline, wound treatment.

Введение. Проблема хирургической инфекции мягких тканей имеет широкое распространение не только в России, но и в странах Европы, где ежегодно около 1 млн пациентов госпитализируется по поводу гнойно-воспалительного процесса мягких тка-

ней, что составляет до 40% от всех хирургических пациентов [8,14,15].

Зачастую инфицирование ран наступает и после плановых оперативных вмешательств [7], особое место занимают больные с синдромом диабетиче-

ской стопы (сопровождается некрозом тканей), количество которых только возрастает [12,18]. Факторами, способствующими этому являются: развитие резистентных форм микроорганизмов, появление Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), чаще всего инфекционный процесс вызывается ассоциациями микроорганизмов, кроме того применение местной формы антибиотика может сопровождаться ростом устойчивости возбудителей к антимикробным препаратам [8,17].

Сегодня применяются и разрабатываются новые устройства и способы для физического воздействия на рану (УЗ, лазер, отрицательное давление, направленный поток газовых смесей, сорбционно-дренажные устройства [6]), так же совершенствуются методы местного медикаментозного воздействия: биоактивные сорбенты, монтморлиллонитовые глины [16], применение биодеградируемых носителей с иммобилизованными лекарственными веществами [13], металлами [10], обладающими антисептическими свойствами, протеолитическими ферментами [11].

Таким образом, совершенствование средств для местного медикаментозного воздействия на гнойно-некротические процессы кожи и мягких тканей представляет большой интерес для современной хирургии.

Цель исследования - изучить ранозаживляю-щее свойство хитозан-коллагенового комплекса с нано-частицами серебра и химотрипсином при местном воздействии на гнойно-некротическую рану в эксперименте и оценить его токсическое воздействие на печень и почки.

Материалы и методы исследования. В качестве материала для исследования было использовано раневое покрытие из полиэлектролитного комплекса состава хитозан: коллаген 2:1, в виде высокопористой губки размером (2*2*0,4) см, способной к биодеградации, с включением коллоидных (ультрадисперсных) частиц металлического (нульвалентно-го) серебра и химотрипсина.

Основные физико-химические характеристики образцов: поверхностная плотность 8-12 мг/см2, поглотительная способность по воде (раневому экссудату) 20-30 г/г или 0,2-0,3 мл/см2, рН водной вытяжки 5,4-5,6, массовая доля серебра 0,3%, ферментативная активность 15 БТЕ/мг.

Эксперимент in vivo выполнен на 50 белых крысах-самцах породы «Вистар» массой 180-200 г, в соответствии с Европейской Конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г.) ETS АГ123. Для исследования отбирали животных без внешних признаков заболевания, прошедших карантин в экспериментально-биологической клинике при Курском государственном медицинском университете. Все животные содержались в одинаковых условиях на стандартном пищевом рационе.

Моделирование раны производилось следующим образом: в стерильных условиях под ингаляционным наркозом, на предварительно выбритом участке спины крысы иссекался кожно-подкожный лос-

кут площадью 250 мм2, далее с 4 сторон раны производилась инъекция в подкожный слой 0,1 мл 10% кальция хлорида, затем в рану вносился марлевый шарик пропитанный 1 мл миллиардной взвеси следующих штаммов микроорганизмов: Е. coli, St. Aureus (MRSA и MRSE), Proteus vulgaris и Pseudomonas aeruginosa, после чего к ране подшивали устройство для защиты ран (патент РФ на полезную модель № 94844). Лечение начинали на 4 сутки после моделирования путем наложения исследуемого раневого покрытия на рану и фиксации пластырной повязкой (при этом устройство для защиты ран удалялось).

Для объективной оценки скорости заживления раны по изменению ее площади использовали планиметрический метод Л.Н. Поповой (процент уменьшения площади ран от исходного размера, скорость заживления ран).

Бактериологическое исследование включало количественное определение микроорганизмов в динамике в 1 г ткани инфильтрата, выражали в ко-лониеобразующих единицах (КОЕ/г).

Гистологическое изучение препаратов ран производили после выведения подопытного животного из эксперимента. Забор материала осуществляли путем иссечения участка мягких тканей дна и прилежащего края раны лезвием. Изготавливали срезы кожи и внутренних органов толщиной 5-7 мкм и после окраски гематоксилин-эозином или по Ван-Гизон заключали в среду Биомаунт под покровное стекло.

Световая микроскопия осуществлялась на микроскопе Leica СМЕ. Микрофотографирование производили с использованием окуляр камеры DCM-510.

Так же было выполнено морфометрическое исследование, заключающееся в следующем: на срезах гистологических препаратов при увеличении ><400, на выбранном участке в пределах раневого дефекта под лейкоцитарно-фибринозным струпом производили подсчет фибробластов, гранулоцитов, лимфоцитов и макрофагов до 100 клеток, полученные результаты выражали в процентах.

Биохимические исследования: производились автоматическим биохимическим анализатором «ACCENT 200» производства компании PZ CORMAY S.A Определяли уровень креатинина, мочевины, АЛТ и ACT.

Гематологические исследования: производились автоматическим гематологическим анализатором «RT-7600S» версия для ветеринарии производства компании RAYTO LIFE AND ANALYTICAL SCIENCES CO Ltd. Определяли следующие показатели: лейкоциты, лимфоциты, гранулоциты, эритроциты, гемоглобин, гематокрит, тромбоциты.

Для определения концентрации гидроксипро-лина в образцах использовали колориметрический метод определения продуктов реакции окисленного гидроксипролина и реактива Эрлиха. Оптическую плотность определяли при длине волны 557 нм. Для приготовления стандартов использовали кристаллический гидроксипролин производства Sigma (США).

Результаты обработаны статистически с помощью пакета Microsoft Excel 2010 и Statistica v. 6.0. Количественные признаки представляли в виде медианы, 25-го и 75-го перцентилей (Ме(25;75)). При мно-

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2019 - V. 26, № 3 - P. 23-28

жественном сравнении использовали Kruskal-Wallis test, с последующим сравнением средних рангов по группам. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0,05.

Результаты и их обсуждение. На первые сутки начала лечения (четвертые сутки после моделирования раны) отмечался отек вокруг раневого дефекта, мутное отделяемое из ран в количестве 0,2-0,5 мл, присутствовали участки некроза.

Таблица 1

Динамика площади (мм2) и процент уменьшения площади ран (%), Me (25;75)

Показатель 1 сутки (и=50) 5 сутки (и=40) 10 сутки (и=30) 15 сутки (и=20) 21 сутки (и=10)

Площадь ран 251 (250; 253)* 219 (200; 238)" 132 (110; 150) 26 (22; 30) 3 (2; 4)

Процент уменьшения площади ран 13,8 (5,9;20,З)5 47,3 (40; 56,5)* 89,7 (88,1; 91,3) 98,8 (98,4; 99,2)

Примечание: площадь ран: * - на 1 и 5 сутки показатели статистически достоверно отличались от всех остальных суток (р=0,005). Процент уменьшения площади ран: * - на 5 и 10 сутки показатели статистически достоверно отличались от всех остальных суток (р=0,01)

Результаты гематологического исследования, Me (25;75), и=8

Показатель Единица измерения Референтные значения Сутки

1 5 10 15 21

Лейкоциты 10®/л 5,2-19,0 19,4 (14,4; 24,9) 18,6 (15,9; 19,9) 22,7 (21,8; 23,6) 21,8 (18,9; 26) 12,6 (12,3; 12,6)«®

Лимфоциты 10®/л 4,4-16,9 12,9 (9,2; 14,2) 11,1 (10,2; 11,6) 17,2 (13,9; 20,3)" 15,7 (14,1; 17,2) 8,6 (8,2; 9,2)®®

Гранулоциты 10®/л 2,0-7,8 4,5 (3,4; 5,4) 1,4 (0,9; 1,7)* 1,3 (0,9; 1,5)* 1,8 (1,3; 2,2) 0,8 (0,7; 0,9)*®

Эритроциты 1012/л 5,3-9,1 5,7 (3,9; 6,4) 9,4 (8,4; 9,9)* 8,2 (7,9; 8,3) 9,5 (9,4; 9,5)* 10,5 (10,2; 11)**

Гемоглобин г/л 128-176 70 (64; 78) 105,5 (100;109) 100 (94,5; 104,5) 110 (108; 111,5)* 124,5 (122,5; 125,5)«

Гематокрит % 39,3-52,2 22,3 (16,4; 26,8) 38 (35,2;40,7)5 33,4 (32,8; 33,8) 39,9 (38,9; 40,7)* 43,1 (42,2; 43,5)**

Тромбоциты 10®/л 430-1000 1159 (1021,5; 1227) 1254,5 (1157; 1302,5) 1089,5 (903,5; 1176,5) 907 (825,5; 920,5)*» 876 (791; 953)*»

Примечание: * - р=0,04 при сравнении 1 суток с остальными. # - р=0,03 при сравнении 5 суток с 10, 15 и 21. & - р=0,002 при сравнении 10 суток с 15 и 21. @ - р=0,049 при сравнении 15 суток с 21

На пятые сутки лечения наблюдалось незначительное отделяемое из раны светло-желтого цвета, сохранялся отек окружающих тканей, визуально грануляции отсутствовали. На 10 сутки раневой дефект был покрыт струпом, отек окружающих тканей не отмечался, отделяемого из ран не наблюдалось. На 15 сутки лечения у всех животных отмечалось формирование эпителиального вала по краям раневого дефекта, центр раны покрыт струпом. На 21 сутки лечения раневой дефект имел площадь около 3 мм2, покрыт эпителием, по периферии происходил процесс моделирования рубца.

Данные планиметрического исследования пред-

ставлены в табл. 1. Было отмечено, что к 21 суткам эксперимента площадь раны сократилась на 98,8 (98,4; 99,2)%. Максимальная скорость заживления приходилась на отрезках 5-10 и 10-15 сутки и составляла 7 (4,8; 8,2) и 8 (6,3; 10,2)%/сутки соответственно.

Исследуемые биохимические показатели крови (креатинин, мочевина, АЛТ и АСТ) находились в пределах референтных значений, что свидетельствовало об отсутствии пагубного воздействия исследуемого раневого покрытия на печень и почки, об этом же свидетельствовали данные морфологического исследования: в паренхиме исследуемых внутренних органов патологических изменений не обнаружено, структура почечных телец и отделов нефронов сохранна, балочная структура паренхимы печени не изменена.

В табл. 2 представлены данные гематологического исследования. Была отмечена следующая ответная реакция на протекающий гнойно-некротический процесс: на протяжении 10-ти суток у экспериментальных животных нарастал лейкоцитоз (на данные сутки также отмечался пик уровня лимфоцитов), начиная с 15 суток происходило снижение с достижением референтных значений на 21 сутки. При этом с 5 по 21 сутки была зафиксирована гранулоцитопения в центральном кровотоке.

Со стороны «красной» крови наблюдался эрит-Таблица 2 роцитоз на фоне гемоглобинопатии, которая нивелировалась к 21 суткам наблюдения. При этом отмечался подъем уровня гематокрита с нормализацией показателя на 15 сутки. Уровень тромбоцитов был выше уровня референтных значений на 1-10 сутки, однако на 15 и 21 сутки отмечалась нормализация данного показателя. Данные изменения можно трактовать как ответную реакцию на воспалительный процесс и стресс в связи с моделированием раны и проводимым экспериментом.

Обсемененность ран на 1 сутки составила 3,2 (2,9; 3,4)х 107 КОЕ/г, с течением времени происходило снижение показателя более чем в 65 раз до 4,9 (3,0; 5,7)*105 КОЕ/г на 21 сутки эксперимента (различия статистически значимы), что также говорит о положительном влиянии исследуемого раневого покрытия на процесс заживления моделируемой раны.

При описании микропрепаратов раневых срезов на 1 сутки эксперимента было отмечено, что у всех животных поверхность раны была покрыта фибринозным струпом. Струп инфильтрирован лейкоцитами (нейтрофильными гранулоцитами) с выраженной послойной организацией инфильтрата в струпе. Кратер раны выражен, боковые стенки кратера покрыты

эпидермисом, подворачивающимся под край раны и постепенно истончающимся до 2-1 слоя. Объем раневого кратера заполнен резко отечной грануляционной тканью, на всю толщину которой отмечается расширение плазматических капилляров.

Слой вертикальных сосудистых петель был слабо выражен, основной вид клеток здесь - лейкоциты. Поверх него лежал поверхностный слой грануляций, который представлял собой разрыхленные молодые коллагеновые волокна, находящиеся в фиб-риноидном экссудате, в котором отмечались ней-трофильные гранулоциты в относительно небольшом количестве. По мере приближения к струпу плотность нейтрофильного инфильтрата резко возрастает. В сосудах фасциального сплетения также отмечалось венозное полнокровие с выраженным феноменом «краевого пула» лейкоцитов.

Таким образом, происходит нарастание выраженности признаков экссудативной фазе воспаления. Грануляционная ткань не зрелая, так как отсутствует или слабо выражена её послойная организация.

К 5 суткам эксперимента у 4 животных из 10 было отмечено распространение инфильтрата вдоль соединительнотканных прослоек далеко в стороны под сохранные участки дермы. Кратер раны заполнен грануляционной тканью с признаками незрелости: отсутствием выраженной послойной организации, выраженным отеком глубоких слоев грануляционной ткани. Регенерирующий эпидермис покрывал стенки края раневого кратера и имел расщепленый / дефор-мированый край. Основной объем грануляций занят незрелыми коллагеновыми волокнами, пространственная ориентация которых соответствовала организации слоя горизонтальных фибробластов.

Глубокий слой грануляций представлял собой популяцию приблизительно параллельно ориентированных юных форм фибробластов, отличающихся от зрелых форм наличием мелкого базофильного ядра, что указывало на их высокий пролиферацион-ный потенциал.

Таким образом, происходило становление процессов, соответствующих разворачивающейся фазы экссудации.

На 10 сутки эксперимента у животных весь объем раневого кратера был полностью заполнен волокнистой соединительной тканью. При окраске гематоксилин-эозином этот объем волокнистой ткани интенсивно базофилен, а при окраске по Ван-Гизон у 3 животных из 10 даже обнаруживались крупные очаги незрелого коллагена. Эти очаги не имели четких границ и расположены практически во всех слоях грануляционной ткани. Во всех случаях регенерирующая волокнистая соединительная ткань заходила достаточно глубоко под края раневого кратера.

В центральных отделах раневого кратера у всех животных дифференцировались слои горизонтальных фибробластов, вертикальных сосудов и поверхностный слой. По всей толщине грануляций в центре раневого кратера отмечались расширенные плазматические капилляры и венулы.

Поверхностный слой грануляций в центре раны был покрыт несколькими слоями фибринозного от-

деляемого с различной степенью инфильтрации лейкоцитами, преимущественно нейтрофилами.

Большая часть поверхности грануляций не была покрыта эпидермисом. Там, где он был (края раны) и при условии сформированности базальной мембраны отмечалось резкое ускорение созревания волокнистой стромы и реорганизации соединительной ткани, здесь выявлялись тонкие, зрелые (при окраске по Ван-Гизон) коллагеновые волокна, формирующие волокнистый каркас рыхлой волокнистой соединительной ткани сосочкового слоя дермы. Здесь же выше степень зрелости фибробластов.

Таким образом, фаза экссудации прошла пик и типичная для неё морфологическая картина сохранялась только в поверхностных слоях грануляций в центре раны. Активность пролиферационных процессов нарастала от центра раны к её периферии и от поверхности грануляций - в глубину.

У животных к 15 суткам эксперимента раневой дефект был полностью выполнен волокнистой соединительной тканью. При окраске по Ван-Гизон отчетливо видно, что степень зрелости коллагеновых волокон практически равномерна как по толщине, так и направлению от края к центру. У всех животных имело место «наползание» краевого эпителиального вала на регенерирующую ткань. Площадь, оставшаяся непокрытой эпидермисом занята струпом.

К 15 суткам фаза экссудации завершена полностью. Имел место разгар пролиферативной фазы воспаления.

На 21 сутки эксперимента у всех животных раневой дефект полностью выполнен плотной волокнистой оформленной соединительной тканью, состоящей из молодых коллагеновых волокон, ориентированных параллельно поверхности раны и по сравнению с интактной плотной волокнистой соединительной тканью (ПВСТ) окрашенной слабо базо-фильно как у краев раны, так и по её центру. При селективной окраске на зрелый коллаген отчетливо виден градиент зрелости коллагеновых волокон от края раны к центру и из глубины к поверхности. Снаружи ПВСТ покрыта полнослойным эпидермисом, лежащим на базальной мембране и формирующим почки роста, из которых восстанавливались производные эпидермиса.

В поверхностных слоях грануляционной ткани фибробласты ориентированы вдоль волокон, а в более глубоких - они разнонаправлены, что следует оценивать как проявление ремоделирования ПВСТ.

Таким образом, происходило завершение фазы пролиферации и начало процессов ремоделирования ПВСТ с последующим изменением пространственной конфигурации волокнистого каркаса.

По данным морфометрического исследования было выявлено, что на первые сутки в тканях ран преобладали лимфоциты и гранулоциты (более 80%), к 10 суткам происходило увеличение количества макрофагов до 55 (46; 73)%, число гранулоцитов и лимфоцитов снижалось до 14 (7; 14)% и 23 (11; 38)% соответственно. В течение 15 и 21 суток происходило увеличение количества фибробластов с 39 (38; 56)% до 78 (74; 80)%, и уменьшение числа макрофа-

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2019 - V. 26, № 3 - P. 23-28

гов и лимфоцитов до 5(4; 7)% и 16 (15; 23)% соответственно, количество гранулоцитов составляло 0%.

При определении концентрации гидроксипро-лина (табл. 3) было отмечено постепенное увеличение данного показателя с 1 по 21 суки в 2,5 раза, что свидетельствовало об активном синтеза коллагена.

Таблица 3

Концентрация гидроксипролина (мкг/мг), Me (25 ;75)

Показатель 1 сутки (и=10) 5 сутки (и=10) 10 сутки (и=6) 15 сутки (п=5) 21 сутки (п=5)

Гидроксипролин 7,9 (7,2; 9,2) 12,9 (11,7; 13,5) 15,9 (15,4; 16,б)5 18,3 (17,6; 18,7)* 20,1 (19,8; 20,9)5»

Примечание: * - р=0,004 при сравнении 1 суток с остальными. # - р=0,04 при сравнении 5 суток с 10, 15 и 21

Заключение. В результате применения исследуемого нами раневого покрытия в виде хитозан-коллагенового комплекса с нано-частицами серебра и химотрипсином происходило заживление гнойно-некротической раны, что обеспечивалось за счет пролонгированного выделения в раневую среду действующих веществ [3,5,9].

Следует отметить, что, при контакте с отделяемым из раны, комплекс переходил в гелеобразное состояние, в свою очередь это обеспечивало оптимальные условия заживления раны во влажной слабокислой среде, кроме того создавалась защита от вторичного инфицирования раны. В подобных условиях хитозан стимулирует пролиферацию клеток и гистоар-хитекгурную организацию тканей, стимулирует фиб-робласты и эпителиальные клетки в синтезе фактора роста эндотелия сосудов и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, сохраняя уровень активности естественных факторов роста [1,4]. В свою очередь, коллаген стимулирует образование грануляций и способствует быстрому и эффективному росту новой полноценной ткани на месте дефекта, выступая в качестве матрицы для ее роста [2].

Эффективность исследуемого нами раневого покрытия была доказана на основании планиметрического, бактериологического, гематологического, гид-роксипролинового, гистологического и морфометри-ческого методов исследования. Содержащийся в составе комплекса химотрипсин способствовал скорейшему лизису некротизированных тканей. Без сомнения его действие давно изучено, однако в нашем исследовании впервые была показана его эффективность при иммобилизации в хитозан-коллагеновом комплексе с нано-частицами серебра. Отсутствие токсического воздействия на печень и почки при ежедневном местном применении раневого покрытия в течение 20 суток было доказано на основании биохимического и гистологического методов исследования, которые не выявили каких-либо отклонений от нормы.

Таким образом, применение хитозан-коллагенового комплекса с нано-частицами серебра и химотрипсином при местном воздействии на гнойно-некротическую рану стимулирует процесс заживления, не оказывает пагубного влияния на печень и почки, и может быть рекомендован для даль-

нейшего исследования на доклиническом уровне.

Литература / References

1. Антонов С.Ф. Материалы для лечения ран и ожогов на основе хитозана. М.: Центр "Биоинженерия", 2013.

394 с. / Antonov SF. Materialy dlja lechenija ran i ozhogov na osnove hitozana [Materials for the treatment of wounds and burns on the basis of chi-tosan]. Moscow: Centr "Bioinzhenerija"; 2013. Russian.

2. Бегма A.H., Бегма И.В., Хомякова E.K. Опыт применения коллагеновых повязок и губок Метуракол в хирургической практике // Русский медицинский журнал. 2014. Т. 17, №22. С. 1248-1252 / Begma AN, Begma IV, Khomyakova EK. Opyt primenenija kollagenovyh povjazok i gubok Meturakol v hirurgicheskoj praktike [Experience of using collagen dressings and sponge Meturakol in surgical practice]. Russkij meditsinskij zhurnal. 2014; 17(22): 1248-52. Russian.

3. Гладких П.Г. Эффект наночастиц серебра в отношении биопленок микроорганизмов (литературный обзор) // Вестник новых медицинских технологий. Электронное издание. 2015. №1. Публикация 3-4. URL: http://www.medtsu.tula.ru/VNMT/Bulletin/E2015-l/5108.pdf (дата обращения 25.02.2015). DOI: 10.12737/811 / Gladkikh PG. Effekt nanochastits serebra v otnoshenii bioplenok mikroorganizmov (literaturnyy obzor) [Effect of silver nanoparticles on microbial biofilms (literature review)]. Vestnik novykh meditsinskikh tekhnologiy. Elektronnoe izdanie [internet], 2015 [cited 2015 Feb 25];l[about 5 p.], Russian. Available from: http://www.medtsu.tula.ru/VNMT/ Bulle-tin/E2015-1/5108.pdf. DOI: 10.12737/811.

4. Зудина И.В., Ведяева А.П., Булкина H.B., Иванов П.В., Альзубаиди А.Ф. Изучение воздействия хтозана на процесс заживления костного дефекта в экспериментах INVIVO и INVITRO // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия: Химия. Биология. Экология. 2016. Т 2, №16. С. 171-179. DOI.org/lO. 18500/1816-9775-2016-16-2171-179 / Zudina IV, Vedyaeva АР, Bulkina NV, Ivanov PV, Alzubaidi AF. Izuchenie vozdejstvija htozana na process zazhivlenija kostnogo defekta v jeksperimentah INVIVO i INVITRO [Study of the effects of chtosan on the healing process of a bone defect in the INVIVO and INVITRO experiments]. Izvestiya Saratovskogo universiteta. Novaya seriya. Seriya: Khimiya. Biologiya. Ekologiya. 2016;2(16):171-9. DOI.org/10.18500/1816-9775-2016-16-2-171-179 Russian.

5. Савин Е.И., Субботина Т.И., Хадарцев A.A., Хренов П.А., Честнова Т.В., Бузулуков Ю.П., Анциферова А.Н. Экспериментальное исследование антибактериальной активности наночастиц серебра на модели перитонита и менинго-энцефалита in vivo // Вестник новых медицинских технологий. Электронное издание. 2014. №1. Публикация 2-21. URL: http://medtsu.tula.ru/VNMT/Bulletin/E2014- l/4793.pdf (дата обращения 30.04.2014). DOI: 10.12737/3865 / Savin EI, Subbotina TI, Khadartsev AA, Khrenov PA, Chestnova TV, Buzulukov YuP, Antsiferova AN. Eksperimental'noe issledovanie antibakterial'noy aktivnosti nanochastits serebra na modeli peritonita i meningoentsefalita in vivo [Experimental study of antibacterial activity of silver nanoparticles on the model of peritonitis and meningoencephalitis in vivo]. Vestnik novykh meditsinskikh tekhnologiy. Elektronnoe izdanie [internet]. 2014[cited 2014 Apr 30];l[about 6 p.]. Russian. Available from: http ://medtsu.tula.ru/VNMT/Bulletin/E2014- l/4793.pdf.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

DOI: 10.12737/3865.

6. Смотрин C.M., Ославский А.И., Меламед В.Д., Гра-кович П.Н. Сорбционно-дренажные устройства в комплексном лечении гнойных ран и абсцессов мягких тканей

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2019 - V. 26, № 3 - P. 23-28

// Новости хирургии. 2016. Т. 24, №5. С. 457-464. DOI: 10.18484/2305-0047.2016.5.457 / Smotryn SM, AslauskiAI, Melamed VD, Grakovich PV Sorbcionno-drenazhnye ustrojstva v kompleksnom lechenii gnojnyh ran i abscessov mjagkih tkanej [Sorption-drainage Devices in Complex Treatment of Purulent Wounds and Abscesses of Soft Tissues], Novosti Khirurgii. 2016;24(5):457-64. DOI: 10.18484/2305-0047.2016.5.457 Russian.

7. Сонис А.Г., Грачев Б.Д., Столяров E.A., Ишутов И.В. Профилактика и лечение инфекционных раневых осложнений при протезирующих грыжесечениях // Раны и раневые инфекции. Журнал имени проф. Б.М. Костюченка. 2014. Т. 1, №2. С. 16-23. D01.org/10.17650/2408-9613-2014-1-2-16-23 / Sonis AG, Grachev BD, Stolyarov EA, Ishutov TV. Profilaktika i lechenie infekcionnyh ranevyh oslozhnenij pri protezirujushhih gryzhesechenijah [Prevention and treatment of infectious wound complications in prosthetic hernia repair]. Rany i ranevye infekcii. Zhurnal imeni prof. B.M. Kostjuchenka. 2014;l(2):16-23. DOI.org/lO.l 7650/2408-9613-2014-1-2-16-23 Russian.

8. Третьяков A.A., Петров C.B., Неверов A.H., Щетинин А.Ф. Лечение гнойных ран // Новости хирургии. 2015. Т. 23, №6. С. 680-687. DOI: 10.18484/2305-0047.2015.6.680 / Tretyakov АА, Petrov SV, Neverov AN, Shchetinin AF. Lechenie gnojnyh ran [Treatment of Purulent Wounds]. Novosti Khirurgii. 2015;23(6):680-7. DOI: 10.18484/23050047.2015.6.680. Russian.

9. Честнова T.B., Зилов В.Г., Гладких П.Г., Хадар-цев А.А. Сочетанное действие наночастиц серебра, цефтри-аксона и метилурацила при гнойном перитоните в эксперименте // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2018. Т. 165, № 6. С. 737-741 / Chestnova TV, ZilovVG, Gladkikh PG, Khadartsev AA, Korotkova AS, Buzulukov YP. Sochetannoe deystvie nanochastits serebra, tseftriaksona i metiluratsila pri gnoynom peritonite v eksperimente [Combined Effect of Silver Nanoparticles, Ceftriaxone, and Methyluracil during Experimental Purulent Peritonitis]. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2018;165(6):777-80. Russian.

10. Archana D., Singh B.K., Dutta J., Dutta P.K. In vivo evaluation of chitosan-PVP-titanium dioxide nanocomposite as wound dressing material // Carbohydr Polym. 2013. Vol. 95(1). P. 530-539. DOI: 10.1016/j.carbpol.2013.03.034 / Archana D, Singh BK, Dutta J, Dutta PK. In vivo evaluation of chitosan-PVP-titanium dioxide nanocomposite as wound dressing material. Carbohydr Polym. 2013;95(l):530-9. DOI: 10.1016/j.carbpol.2013.03.034.

11. Dosadina E.E., Savelyeva E.E., Belov A.A. The effect of immobilization, drying and storage on the activity of proteinases immobilized on modified cellulose and chitosan // Process Biochemistry. 2018. Vol. 64(1). P. 213-220. DOI.org/lO. 1016/j.procbio.2017.10.002 / Dosadina EE, Savelyeva EE, Belov AA. The effect of immobilization, drying and storage on the activity of proteinases immobilized on modified cellulose and chitosan. Process Biochemistry. 2018;64(1):213-20. DOI.org/lO. 1016/j.procbio.2017.10.002.

12. Glass G.E., Sheil F., Ruston J.C., Butler P.E. Necrotis-

ing soft tissue infection in a UK metropolitan population // Ann R Coll Surg Engl. 2015. Vol. 97(1). P. 46-51. DOI: 10.1308/003588414X14055925058553 / Glass GE, Sheil F, Ruston JC, Butler PE. Necrotising soft tissue infection in a UK metropolitan population. Ann R Coll Surg Engl. 2015;97(1):46-51. DOI: 10.1308/003588414X14055925058553.

13. Jayakumar R., Prabaharan M., Sudheesh Kumar P.T., Nair S.V., Tamura H. Biomaterials based on chitin and chitosan in wound dressing applications // Biotechnol Adv. 2011. Vol. 29(3). P. 322-337. DOI: 10.1016/j.biotechadv.2011.01.005 / Jayakumar R, Prabaharan M, Sudheesh Kumar PT, Nair SV, Tamura H. Biomaterials based on chitin and chitosan in wound dressing applications. Biotechnol Adv. 2011;29(3):322-7. DOI: 10.1016/j.biotechadv.2011.01.005.

14. Proud D., Holden D., Capstick R., Raiola F.B., Paul E., Khoo A. Are we getting necrotizing soft tissue infections right? A 10 - year review//ANZ J Surg. 2014. Vol. 84(6). P. 468-472. DOI: 10.1111/ans.12412 / Proud D, Holden D, Capstick R, Raiola FB, Paul E, Khoo A. Are we getting necrotizing soft tissue infections right? A 10 - year review. ANZ J Surg. 2014;84(6):468-72. DOI: 10.1111/ans.l2412.

15. Pulgar S., Mehra M., Ouintana A. The epidemiology of hospitalized cases of skin and soft tissue infection in Europe. 18th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 2008 April 19-22. Barcelona, Spain. ECCMID; 2008 Jun. 821 p. / Pulgar S, Mehra M, Ouintana A. The epidemiology of hospitalized cases of skin and soft tissue infection in Europe. 18th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 2008 April 19-22. Barcelona, Spain. ECCMID; 2008.

16. Shameli K., Ahmad M.B., Yunis W.Z., Rustaiyan A., Ibrahim N.A., Mohsen Z., Abdollahi Y. Green synthesis of sil-ver/montmorillonite/chitosan bionanocomposites using the UV irradiation method and evaluation of antibacterial activity // J Nanomedicine. 2010. Vol. 5. P. 877-887. DOI: http://dx.doi.org/10.2147/IJN.S13632 / Shameli K, Ahmad MB, Yunis WZ, Rustaiyan A, Ibrahim NA, Mohsen Z, Abdollahi Y. Green synthesis of silver/montmorillonite /chitosan bionanocomposites using the UV irradiation method and evaluation of antibacterial activity. J Nanomedicine. 2010;5:877-87. DOI: http://dx.doi.org/10.2147/IJN.S13632.

17. Walter C.J., Dumville J.C., Sharp C.A., Page T. Systematic review and meta-analysis of wound dressings in the prevention of surgical-site infections in surgical wounds healing by primary intention // Br J Surg. 2012. Vol. 99(9). P. 11851194. DOI: 10.1002/bjs.8812 / Walter CJ, Dumville JC, Sharp CA, Page T. Systematic review and meta-analysis of wound dressings in the prevention of surgical-site infections in surgical wounds healing by primary intention. Br J Surg. 2012;99(9): 1185-94. DOI: 10.1002/bjs.8812.

18. Wang J.M., Lim H.K. Necrotizing fasciitis: eight-year experience and literature review // Braz J Infect Dis. 2013. Vol. 18(2). P. 137-143. DOI: 10.1016/j.bjid.2013.08.003 / Wang JM, Lim HK. Necrotizing fasciitis: eight-year experience and literature review. Braz J Infect Dis. 2013;18(2):137-43. DOI: 10.1016/j.bj id. 2013.08.003.

Библиографическая ссылка:

Бежин А.И., Липатов В.А., Фрончек Э.В., Григорьян А.Ю., Наимзада М.Д.З. Применение хитозан-коллагенового комплекса с нано-частицами серебра и химотрипсином в лечении гнойно-некротических ран // Вестник новых медицинских технологий. 2019. №3. С. 23-28. DOI: 10.24411/1609-2163-2019-16419.

Bibliographic reference:

Bezhin AI, Lipatov VA, Fronchek EV, Grigoryan AYu, Naimzada MDZ. Primenenie khitozan-kollagenovogo kompleksa s nano-chastitsami serebra i khimotripsinom v lechenii gnoyno-nekroticheskikh ran [Application chitosan-collagen complex nano-particles of silver and chymotrypsin in the treatment of purulent necrotic wounds]. Journal of New Medical Technologies. 2019;3:23-28. DOI: 10.24411/1609-2163-2019-16419. Russian.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.