CC BY
93
УДК [615.98:579.84]-06:612.017\-085.322:582.272.46
Т.А. Кузнецова1, Л.М. Сомова1, Н.Г. Плехова1, Т.Н. Звягинцева2
1 НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (690087 г. Владивосток, ул. Сельская, 1), 2 Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН (690022 г. Владивосток, пр-т 100 лет Владивостоку, 159)
ПРИМЕНЕНИЕ ФУКОИДАНА ИЗ БУРОЙ ВОДОРОСЛИ FUCUS EVANESCENSДЛЯ КОРРЕКЦИИ ИММУННЫХ НАРУШЕНИЙ ПРИ ЭНДОТОКСИНЕМИИ
Ключевые слова: фукоидан, эндотоксинемия, липополисахарид, иммунитет.
Изучена возможность применения фукоидана из бурой водоросли Fucus evanescens для коррекции нарушений гуморального и клеточного иммунитета при экспериментальной эндотоксинемии, индуцированной введением липополи-сахарида. Выявлено ингибирование повышенного уровня провоспалительных цитокинов, частичное восстановление показателей адгезивной и бактерицидной активности нейтрофильных лейкоцитов на фоне индуцированной липополисахаридом иммунодепрессии, а также снижение степени микроциркуляторных нарушений в паренхиматозных органах, что способствует повышению резистентности животных к эндотоксину.
Актуальной проблемой лечения больных с эндоток-синемией является поиск препаратов для снижения негативного влияния эндотоксина и повышения резистентности организма к токсическому воздействию. Проникая в системный кровоток, липополисахарид (ЛПС), ответственный за все биологические эффекты эндотоксина, взаимодействует с гуморальными и клеточными факторами иммунитета и инициирует комплекс патологических процессов, включающих нарушения со стороны различных органов и систем макроорганизма. Развиваются кардиопульмональная и сосудистая дисфункции, синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания, острая почечная и печеночная недостаточность и другие нарушения. Эти процессы являются результатом как прямого, так и опосредованного действия эндотоксина [2, 3, 9, 11].
Сульфатированный полисахарид из бурой водоросли Fucus evanescens — фукоидан, обладающий иммуномодулирующей, антикоагулянтной, противоопухолевой, антивирусной и другими видами активности [1, 4, 5], является одним из перспективных препаратов для коррекции иммунных нарушений при эндотоксинемии. Изучение данного вопроса поставлено целью настоящей работы.
Материал и методы. Фукоидан (сульфатированный полисахарид) выделяли методом горячей экстракции из бурой водоросли F. evanescens [7]. Эндо-токсинемию индуцировали введением мышам ЛПС из Yersinia pseudotuberculosis в дозе 6,25±0,5 мг/кг, составляющей LD100.
В экспериментах использовали неинбредных мышей и мышей линии BALB/c весом 20—22 г, которых распределили на следующие группы (по 10—15 особей):
1-я группа — животные, получившие ЛПС;
Кузнецова Татьяна Алексеевна — д-р мед. наук, в.н.с. лаборатории иммунологии НИИЭМ СО РАМН; тел.: 8 (4232) 44-24-46; е-mail: niiem_vl@mail.ru.
2-я группа — животные, получившие фукоидан однократно внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг и через сутки — ЛПС;
3-я группа — животные, получившие фукоидан по профилактической схеме десятикратно, а затем — ЛПС;
4-я группа — животные, получившие фукоидан однократно внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг (положительный контроль);
5-я группа — животные, получившие однократно внутрибрюшинно 0,5 мл 0,85% раствора NaCl (ин-тактный контроль).
Мыши поступали из питомника «Столбовая» и содержались с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г.). Экспериментальные исследования проведены с разрешения Комитета по биомедицинской этике НИИЭМ СО РАМН.
Защитный эффект фукоидана при разных схемах введения оценивали по проценту выживаемости и средней продолжительности жизни неинбредных мышей, получивших ЛПС. Функциональную активность нейтрофильных лейкоцитов перитонеальной полости оценивали по показателям адгезивности и теста с нитросиним тетразолием (НСТ-тест) [10]. Уровень фактора некроза опухоли-а (TNFa) и интерлейкинов (IL) 1a и 6 в сыворотке крови мышей BАLB/c определяли с помощью иммуноферментно-го анализа с использованием наборов BD Biosciences (BD OptEIA Set Mouse TNF(mono), США).
Животных выводили из опыта с использованием эфирного наркоза через 4, 7, 17 и 24 часа после введения ЛПС. Фрагменты миокарда, печени, почек и легких фиксировали в 10% нейтральном растворе забуференного формалина. Проводку материала и заливку в парафин осуществляли по стандартной методике. Из каждого образца готовили 3—5 срезов, которые окрашивали гематоксилином и эозином, для выявления отложений фибрина производили окраску по Шуенинову.
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета программ «Биостат» и Excel, достоверность различий оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Средние величины и их ошибки вычисляли на основе 5—6 тестов, в каждом из которых кровь или экссудат перитонеальной полости собирали от пула из 10—15 животных.
Результаты исследования. Все животные 1-й группы, которым вводили ЛПС, погибали в течение суток (средняя продолжительность жизни — 27,1±2,2 часа). Однократное парентеральное введение фукоидана (2-я группа) не отражалось на показателях выживаемости (все мыши также погибали). При десятикратном введении фукоидана (3-я группа) выживаемость составила 18,9±1,2%, средняя продолжительность жизни — 52,8±4,3 часа.
Исследование функциональной активности ней-трофилов у мышей 1-й группы через 3 часа после введения летальной дозы ЛПС свидетельствовало о значительном (3—4-кратном) угнетении показателей адгезии и НСТ-теста по сравнению с таковыми в группе интактного контроля. Под влиянием однократного введения фукоидана у животных 2-й группы показатели адгезивной активности и бактерицидности ней-трофилов на фоне депрессии, вызванной введением ЛПС, статистически значимо возрастали, но оставались ниже таковых в группе интактного контроля. При десятикратном введении фукоидана (3-я группа) эти показатели восстанавливались в большей степени. У животных 4-й группы (положительный контроль), под влиянием фукоидана наблюдалось увеличение показателей адгезивной (в 1,8 раза) и бактерицидной (в 1,6 раза) активности нейтрофилов по сравнению с интактным контролем (табл.).
Влияние фукоидана на уровень цитокинов оценивали в динамике в течение 24 часов после введения ЛПС. Через 2 часа в 1-й группе выявлено значительное повышение концентрации TNFa и ^-1а в сыворотке крови. По истечении 4 часов концентрация этих цитокинов снижалась и к 24 часам приближалась к показателям контрольной группы. При введении фукоидана (3-я группа) концентрация TNFa и ^-1а на протяжении всего периода исследования была ниже, чем в 1-й группе (рис. 1, а). Динамика 6 имела иную закономерность, принимая максимальные значения через 8 часов с последующим снижением. Его концентрация также значительно превышала показатели интактных животных. Под действием фукоидана выявлены более низкие значения ^-б по сравнению с таковыми в 1-й группе (рис. 1, б).
Патоморфологическое исследование выявило отсутствие патологических изменений в органах мышей 4-й группы (рис. 2, а). Их легкие, почки, сердце имели нормальное строение, как и у животных контрольной (5-й) группы.
Данные патоморфологического исследования органов-мишеней мышей, которым вводили ЛПС (1-я группа), свидетельствовали о гемоциркулятор-ных расстройствах с наличием сладжа эритроцитов и тромбов в сосудах микроциркуляторного русла, повышенной проницаемости сосудов и деструкции эндотелия, а также дистрофически-некробиотичес-ких изменений клеток паренхиматозных органов (рис. 2, б). Через 7 часов в печени обнаружено выраженное повреждение стенок сосудов с их плазмати-
Таблица
Влияние фукоидана на функциональную активность нейтрофилов перитонеальной полости мышей при экспериментальной эндотоксинемии
Группа Адгезивная активность Показатели НСТ-теста
кол-во клеток ИС1 ODx10-3 ИС1
1-я 365100±292002 0,40 23,5±4,22 0,30
2-я 596700± 5 3 2 002, 3 0,65 43,5±5,12, 3 0,56
3-я 704300±445002, 3 0,77 47,8±4,22, 3 0,61
4-я 1678000±1268002 1,83 123,4±15,42 1,58
5-я 914600±75600 78,3±6,7
1 Индекс стимуляции, рассчитанный как отношение показателей в опытной группе к таковым в контрольной (5-й группе).
2 Разница с контролем (5-я группа) статистически значима.
3 Разница с 1-й группой статистически значима.
700-
к
д' 5004
а-а
Iі
I 300 ч
100 —
П
I п
8
Экспериментальная
эндотоксемия
24 Время, часы чэн
и введение фукоидана
|| Экспериментальная эндотоксемия
300—1
* 200-
аг
I
100 —
£■
б
п
о
24 Время, часы
Рис. 1. Динамика уровней ТЫБа (а) и 1Ь-б (б) в сыворотке крови мышей ВАЬВ/с («звездочкой» обозначена статистическая достоверность различий между группами).
ческим пропитыванием, фибриноидным набуханием и некрозом. В прилежащей паренхиме формировались очажки дегенеративно-воспалительных изменений. По истечении 17 часов после введения ЛПС в печени отмечено мозаичное поражение паренхимы с наличием больших полей дистрофически измененных и некротизированных гепатоцитов. Размеры ге-патоцитов в этих участках варьировали. Встречались единичные двуядерные клетки. К концу срока наблюдения (24 часа) на фоне сосудистых изменений регистрировались типичные для псевдотуберкулеза некротические очажки с мелкозернистым детритом, многочисленные мелкие гранулемы без кариорекси-са центральной зоны (рис. 2, в).
а
Рис. 2. Патогистология печени экспериментальных животных. а — получавших только фукоидан; б, в — через 4 часа после введения ЛПС; г — получавших фукоидан в течение 2 недель до введения ЛПС. Окраска гематоксилином и эозином; а, в, г — х200, б — х100.
Исследование в динамике органов животных, которые получали профилактический курс инъекций фукоидана (3-я группа), показало, что в печени, почках и легких в основном сохранилась целостность эндотелиальной выстилки сосудов, в их просвете не обнаруживалось значительных отложений фибрина. В печени через 4 часа наблюдалось умеренное полнокровие внутридольковых и междоль-ковых сосудов без деструктивных изменений эндотелия и гепатоцитов. Вместе с тем имелись очаговые изменения паренхимы в виде зернистой дистрофии и вариабельности размеров печеночных клеток, связанной, скорее всего, с их пикнозом (рис. 2, г). Через 24 часа обнаружена мозаичность рисунка печени за счет дистрофических и некробиотических изменений больших участков паренхимы. Здесь регистрировались зернистая дистрофия и некроз гепато-цитов, было нарушено строение печеночных балок. Изредка выявлялись двуядерные клетки (1—2 в поле зрения). О замедлении регенераторно-репаратив-ных процессов свидетельствовало отсутствие реакции со стороны клеток Купфера. Встречались сосуды с фибриноидным набуханием стенок и повреждением эндотелия, но реже, чем у животных 1-й группы.
В целом степень нарушений микроциркуляции и дистрофически-некротических изменений органов животных, получивших фукоидан, по сравнению с 1-й группой была менее выражена.
Обсуждение полученных данных. Инициирующим звеном патогенеза сепсиса и эндотоксинового шока является поступление в системный кровоток эндотоксина. Это дает начало сложному каскаду патологических процессов: развитию системной воспалительной реакции, полиорганной недостаточности, диссеминированному внутрисосудистому свертыванию крови, формированию вторичного иммунодефицита и другим осложнениям [2, 3, 8, 11, 13].
Наибольший клинический интерес вызывает влияние эндотоксина на основные защитные системы организма, в том числе на факторы врожденного и приобретенного иммунитета. В числе основных задач иммунокорригирующей терапии сепсиса стоит модуляция активности иммунокомпетентных клеток, продукции про- и противовоспалительных цитокинов, коррекция системной воспалительной реакции для предотвращения полиорганной недостаточности [б].
Нейтрофилы, являясь основной эндотоксинсвя-зывающей популяцией клеток крови, участвуют в процессах иммобилизации, транспорта и выведения ЛПС из организма [12, 14]. ЛПС, взаимодействуя с макрофагами, нейтрофилами и клетками эндотелия, стимулирует избыточную продукцию провоспали-тельных цитокинов, оказывающих повреждающее действие на ткани и органы, индуцируя эндотокси-новый шок [2, 8, 9, 12, 15].
В условиях нашего эксперимента под влиянием ЛПС установлено угнетение функциональной
активности нейтрофилов, гиперпродукция провос-палительных цитокинов (TNFa, ^-1а, IL-б), патологические изменения паренхиматозных органов-мишеней. При введении животным фукоидана из F. evanescens выявлена стимуляция функциональной активности нейтрофилов, в результате чего наблюдалось ослабление депрессивного влияния ЛПС на эти клетки. Под влиянием фукоидана также снижались повышенные уровни TNFa, IL-1a и ^-6. Последнее особенно важно для понимания механизмов действия фукоидана, поскольку терапевтическая стратегия при лечении сепсиса и эндотоксинового шока направлена против элементов гипервоспалительного каскада, в частности, против этих цитокинов.
Результаты исследований показали, что клинико-морфологические проявления бактериальной эндотоксинемии, вызванной ЛПС, менее выражены у животных, получивших фукоидан. Введение этого полисахарида способствует снижению степени микроциркуляторных нарушений и вторичных дистрофически-деструктивных изменений в печени, почках, легких. По-видимому, основное патогенетическое значение фукоидана связано с ослаблением повреждающего действия токсина на эндотелий кровеносных сосудов. Это препятствует развитию выраженных системных нарушений микроциркуляции и связанных с ними дистрофических и некротических изменений клеток паренхиматозных органов, приводящих к развитию полиорган-ной недостаточности.
Реализуя отмеченные выше механизмы, фукоидан способствует сглаживанию клинических проявлений эндотоксикоза, а в итоге повышает резистентность мышей к токсическому действию ЛПС: мы наблюдали повышение процента выживаемости (до 19%) и средней продолжительности жизни (в 2 раза) при 100% смертности животных, получивших летальную дозу эндотоксина.
Таким образом, фукоидан из бурой водоросли F. evanescens можно отнести к числу перспективных полисахаридов природного происхождения, повышающих резистентность организма к эндотоксинам. Применение фукоидана в комплексе лечения эндо-токсинемии патогенетически обосновано и позволяет реализовать основные принципы коррекции нарушений гуморального и клеточного иммунитета. Литература
1. Алексеенко Т.В., Жанаева С.Я., Венедиктова А.А. и др. Противоопухолевая и антиметастатическая активность сульфатированного полисахарида фукоидана, выделенного из бурой водоросли Охотского моря Еиеш вуапвзевт//Бюл. эксперим. биол. и мед. 2007. Т. 143, № 6. С. 675—677.
2. Еськов А.П., Каюмов Р.И., Соколов А.Е. Механизм повреждающего действия бактериального эндотоксина // Энтеросорбция как метод предотвращения эндотоксино-вой агрессии: сб. статей. М., 2004. С. 19—23.
3. Игонин А.А., Кукес В.Г., Пальцев М.А. Сепсис: молекулярные механизмы системного воспаления в качестве модели для изучения перспективных терапевтических мишеней // Молекулярная медицина. 2004. № 2. С.3—12.
4. Кузнецова Т.А., Запорожец Т.С., Беседнова Н.Н. и др. Иммуностимулирующая и антикоагулянтная активность фукоидана из бурой водоросли Охотского моря Fucus evanescens // Антибиотики и химиотерапия. 2003. Т. 48, № 4. С. 11-13.
5. Макаренкова И.Д., Компанец Г.Г., Беседнова Н.Н. и др. Скрининг биополимеров из морских гидробионтов, влияющих на адсорбцию вируса Хантаан // Вопр. вирусол. 2007. № 2. С. 29-32.
6. Нехаев И.В., Свиридова С.П., Мазурина О.Г. и др. Иммунокорригирующая терапия сепсиса // Сепсис в начале XXI века: практическое руководство / под ред. В.С. Савельева, Б.Р. Гельфанда. М.: Литтерра, 2006. С. 113-123.
7. Патент № 2135518 (РФ). Способ получения водорастворимых полисахаридов бурых водорослей / Т.Н. Звягинцева, Н.М. Шевченко, И.Б. Попивнич и др. // Бюл. 1999. № 24. 3 с.
8. Рябиченко Е.В., Бондаренко В.М., Веткова Л.Г. Молекулярные аспекты повреждающего действия бактериальных липополисахаридов // Журн. микробиол., эпидемиол и иммунобиол. 2004. № 3. С. 98-105.
9. Таболин В.А., Яковлев М.Ю., Ильина А.Я. и др. Патогенетические механизмы и клинические аспекты действия термостабильного эндотоксина кишечной микрофлоры // Русский мед. журн. 2003. Т. 11, № 3. С. 55-60.
10. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. М.: ВНИРО, 1995. 220 с.
11. Яковлев М.Ю. «Эндотоксиновая агрессия» как предболезнь или универсальный фактор патогенеза заболеваний человека и животных // Успехи совр. биол. 2003. Т. 123, № 1. С. 31-40.
12. Abraham E, Carmody A., Shenkar R., Arcaroli J. Neutrophils as early immunologic effectors in hemorrhage- or endotoxemia-induced acute lung injury // Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 2000. Vol. 279. P. 1137-1145.
13. Ayala A., Song G.Y., Chung C.S. et al. Immune depression in polymicrobial sepsis: the role of necrotic (injured) tissue and endotoxin // СгН. Care Med. 2000. Vol. 28, No. 8. P. 2949-2955.
14. Bouchon A., Dietrich J., Colonna M. Cutting edge: inflammatory responses can be triggered by TREM-1, a novel receptor expressed on neutrophils and monocytes // J. Immunol. 2000. Vol. 164, No. 10. P. 4991-4995.
15. Edwin S., Theo J. C., Johan K. Receptors, Mediators, and Mechanisms Involved in Bacterial Sepsis and Septic Shock // Clin. Microbiology Reviews. 2003. Vol. 16, No. 3. Р. 379-414.
Поступила в редакцию 07.04.2009.
APPLICATION OF BROWN ALGAE FUCUS EVANESCENS-DERIVED FUCOIDAN TO CORRECT IMMUNE DYSFUNCTIONS UNDER ENDOTOXINEMIA T.A. Kuznetsova1, L.M. Somova1, N.G. Plekhova1,
T.N. Zvyagintseva2
1 Research Centre of Epidemiology and Microbiology of the RAMS, Siberian Branch (1 Selskaya St. Vladivostok 690087 Russia), 2 Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS (159 100-Anniversary Av. Vladivostok 690022 Russia)
Summary — The paper discusses possibility of applying fucoidan derived from the brown algae Fucus evanescens to correct humoral and cell-mediated immunity in cases of experimental en-dotoxinemia caused by lipopolysaccharide. The authors revealed inhibition of higher level of proinflammatory cytokines, partial restoration of adhesive and bactericidal activities of neutrophilic leukocytes with parallel lipopolysaccharide-induced immunosuppression and reducing level of microcirculation disorders found in parenchymal organs very likely to increase animal’s resistance to endotoxin.
Key words: fucoidan, endotoxinemia, lipopolysaccharide, immunity.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 72—75.
