CC BY
537
ответствует международному стандарту ISO 10993-5, применяемому к медицинским изделиям, и может в дальнейшем применяться в клинической практике для лечения ран.
Список литературы
1. ГОСТ Р ИСО 10993-5-2009. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследования на циготоксичность: методы ш vitro. - М.: Стандартинформ. 2010. 17 с.
2. Патент (RU) № 2397781 от 27.08.2010 г. «Нетканый материал медицинского назначения, обладающий
ранозаживляющей, антибактериальной и противовирусной активностью и перевязочное средство на его основе» I Дыгай А.М., Лернер М.И., Новицкий В.В., Огородова Л.М., Псахье С.Г., Чурин АА.
3. ISO 10993-5. Biological evaluation of medical devices, Part 5: Tests for cytotoxicity, in vitro methods. International Standardization Organisation, Geneva. 1992.
4. Mosmann ТЛ. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays II J. Immnol. Methods. 1983. N 5. P. 55-63.
Assessment of toxicity in vitro of a new bandaging material
A.A. Churin, G.M. Danilets, A.M. Dygai
Article presents results of the study of new bandaging material's direct contact and indirect cytotoxicity assays in comparison with cotton gauze. It have been found that in direct contact of nonwoven polymeric fibrous bandaging material (BM) with cells for 24 hours of cultivation no changes in cell morphology take place, nor does the amount of dead cells increase. These conclusions have been made by means of both a visual examination and an MTT assay. The BM extract did not have any cytotoxic effect on the tested cells either. The obtained results allow us to make a conclusion that the BM complies with the international standard ISO 10993-5, which is applied to medical goods, and can be applied in the treatment of infected wounds in clinical practice.
Key words: cytotoxicity, bandaging materials, development of biocompatible biomaterials.
Биомедицина • № З,2012, С. 91-97
Применение биологической модели для оценки кишечной проницаемости in vitro - монослоя эпителиальных клеток Сасо-2
И.Е. Шохин1,2, Ю.И. Кулинич1,2, Г.В. Раменская1,2,3, В.Г. Кукес1,2,3
1 - ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова, Минздравсоцразвития РФ, Москва
2 - ФГБУ «НЦ ЭСМП», Минздравсоцразвития РФ, Москва
3 - Филиал «Клиническая Фармакология» НЦБМТ РАМН, Москва
Контактная информация: Кукес Владимир Григорьевич elmed@yandex.ru
Статья посвящена применению монокультуры клеток аденокарциномы толстого кишечника - Сасо-2 для оценки проницаемости лекарственных веществ (JIB) in vitro. Описаны основные преимущества использования данной биологической модели. Приведены общие принципы, подходы и методология определения проницаемости на культуре клеток Сасо-2. Показана корреляция между значениями кишечной проницаемостью, определенной в условиях in vivo и кажущимися коэффициентами кишечной проницаемости in vitro.
Ключевые слова: клетки Сасо-2, проницаемость, абсорбция.
Введение
Одной из ключевых задач современной фармации и биомедицины является понимание процесса доставки лекарственного вещества (ЛВ) до органа или клеток-мишеней. Для этого необходимо объективно оценить поведение лекарственной формы в желудочно-ки-шечном тракте (ЖКТ). Для того чтобы действующее вещество достигло системного кровотока, оно должно пройти через следующие стадии: высвобождение из лекарственной формы, растворение в физиологических средах ЖКТ, абсорбция через кишечную (или желудочную) мембрану [1]. Степень проницаемости ЛВ через стенку кишечника можно достоверно определить в исследованиях in vivo: например, определением абсолютной биодоступности, анализом массового баланса, исследованиями методом кишечной перфузии [2]. Подобные дан-
ные являются наиболее достоверными, однако такие исследования достаточно трудоемкие и дорогостоящими, а также вовлекают в испытание здоровых добровольцев, что вызывает дополнительные этические сложности. Поэтому на протяжении последних 15 лет для исследователей в области биомедицины и биофармации стояла задача разработать метод, позволяющий косвенно, но с достаточной степенью достоверности, надежности и воспроизводимости оценить кишечную проницаемость [3-5].
Методы оценки кишечной проницаемости
Среди методов, позволяющих косвенно оценить степень абсорбции субстанций, можно выделить 3 основные группы: исследования ш situ (например, на тонком кишечнике крыс) [4], исследования на моделях ш vitro (например, на монокультурах различных линий клеток) [5],
а также исследования на моделях in silico (например, путем расчета коэффициентов распределения log Р или С log Р) [3]. Также была выявлена корреляция между интенсивностью метаболизма и проницаемостью ЛВ, однако она все еще находится в стадии обсуждения [6]. Данные, полученные in situ, обладают высокой достоверностью (для всех 20 изученных модельных субстанций данные in situ, полученные на кишечнике крыс, и данные in vivo качественно совпали), однако эти испытания являются достаточно дорогостоящими, что не позволяет использовать их для рутинных или скрининговых исследований [4]. Математическая оценка проницаемости является наиболее простым способом, но ее надежность недостаточно высока, поскольку не учитывает многие реальные физиологические факторы (например, роль белков-транс-портеров). Например, только для 19 модельных ЛВ из 29 качественно совпали данные по проницаемости in vivo, определенной методом кишечной перфузии, и косвенно на основании показателей log Р и С log Р (то есть достоверность составила около 70%) [3].
Начиная с 90-х гг., когда впервые была установлена возможность оценить проницаемость, используя клеточные модели in vitro, данное направление стало активно развиваться. При анализе активности публикаций в данном направлении было выявлено, что их общее количество в ведущих рецензируемых журналах выросло до 120-140 в год [7]. Среди клеточных моделей (Сасо-2, MDCK, НТ29-МТХ, ТС-7) наиболее широко применяемой для данной цели стала культура клеток аденокарциномы толстого кишечника - Сасо-2 [8].
Общие характеристики культуры клеток Сасо-2
Данная культура клеток была получена из аденокарциномы толстого кишечника человека. При культивировании клетки Сасо-2 начинают дифференцироваться в поляризованные клетки кишечного эпителия с покрытой микроворсинками апикальной частью мембраной на базолатеральной части и плотными межклеточными контактами [8]. Несмотря на то, что клетки Сасо-2 имеют происхождение из толстого кишечника, они проявляют большинство морфологических и функциональных характеристик энте-роцигов тонкого кишечника, в том числе выработку ферментов I и II фазы, а также мембранных транспортеров, включая гликопротеин Р и белок MRP. В то же время данная культура клеток имеет и ряд отличий от клеток эпителия тонкого кишечника. Клетки Сасо-2 обладают более высоким значением трансэпигели-ального электрического сопротивления по сравнению с энтероцитами (обычно от
3 до 30 раз), они неспособны вырабатывать слизь (которая в тонком кишечнике вырабатывается бокаловидными клетками), у них различается содержание ионов кальция в межклеточном пространстве. Кроме того, уровень экспрессии гликопротеина Р у клеток Сасо-2 превышает таковой в толстом кишечнике приблизительно на порядок. Все вышеуказанные факторы не могут не вносить свой вклад в проницаемость ЛВ через монослой клеток Сасо-2 [7-9].
Моделирование транспорта ЛВ через монослой клеток Сасо-2
Транспорт ЛВ через мембрану тонкого кишечника может протекать одним или несколькими из четырех механизмов: пассивная диффузия, пассивный параклеточный транспорт (через плотные контакты), активный транспорт с участием переносчиков и трансцитоз.
Исследования проницаемости на культуре клеток Сасо-2 проводились для ЛВ со всеми механизмами транспорта [9].
Lennernas с соавт. провели исследование проницаемости ряда ЛВ, всасывающихся пассивной диффузией и паракле-точным транспортом на монослое клеток Сасо-2, и сравнили полученные данные с известными коэффициентами кишечной проницаемости, полученными методом кишечной перфузии. Было установлено, что для ЛВ, механизмом транспорта которых является простая диффузия, значение коэффициента кишечной проницаемости (Р „ ) и кажущегося ко-
’ 4 err иг vivo/ J 1
эффициента проницаемости (apparent permeability, Р ) на клетках Сасо-2
Г J 7 арр т vitro/
различаются не более чем в 2-4 раза, в то время как для субстанций с параклеточ-ным транспортом проницаемость через монослой клеток была в 20-80 раз ниже. Данное явление имеет два основных объяснения: разным количеством пор в плотных контактах и разной площадью абсорбирующей поверхности у клеток Сасо-2 и энтероцитов. Кроме того, такие отличия могут быть связаны с отсутствием центральной иннервации клеток Сасо-2 и отсутствием в них системного кровотока [10].
В то же время было показано, что подобные различия носят только количественный, но не качественный характер. В исследовании проницаемости полиэти-ленгликолей (гидрофильное вещество с параклеточным траспотртом) было показано, что она возрастает с молекулярной массой также как и кишечная проницаемость in vivo, несмотря на различия коэффициентов Р „ и Р более чем
1 1 r err т vivo арр т vitro
в 100 раз. Таким образом, моделирование параклеточного транспорта ЛВ на культуре клеток Сасо-2 может быть оценено качественно [7, 9].
Субстанции, абсорбирующиеся через стенку кишечника активным транспортом, также имеют более низкие значения кажущейся кишечной проницаемости, что связано с более низкой степенью экспрессии у клеток Сасо-2 ряда транспортеров, в том числе ионных и пептидных транспортеров. В то же время гликопротеин Р вырабатывается у них в меньшей степени, чем у энтероцитов, что приводит к занижению результатов [9].
Корреляция результатов определения проницаемости in vivo и in vitro
Несмотря на значительные различия (до двух порядков) степени проницаемости in vivo и in vitro, исследователями неоднократно делались попытки выявить корреляцию между абсорбцией в тонком кишечнике и на культуре клеток Сасо-2. Такая корреляция была впервые установлена Artursson с соавт. на 20 модельных субстанциях, кроме того, ими были рекомендованы качественные критерии проницаемости на монослое клеток Сасо-2: для ЛВ, которые полностью абсорбируются в ЖКТ, Papp in vitro принимает значения свыше 1x106 см/с; для ЛВ, степень абсорбции которых лежит в интервале от 1% до 100% Papp in vitro принимает значения от 1x107 см/с до 1x106 см/с; для ЛВ, абсорбирующихся менее чем на 1%, Рарр in vitro принимает значения ниже 1x107 см/с [11]. Было проведено большое количество исследований проницаемости на культуре клеток Сасо-2, при этом данные по хорошей корреляции с кишечной абсорбцией были установлены неоднократно. В то же время данные, полученные в разных лабораториях, имели значительные (в несколько раз) количественные различия при их близком качественном сходстве [9]. Например, рекомендуемые разными исследователями критерии «высокой» (т.е. более 90%) проницаемости,
установленной на клеточном монослое, находятся в интервале от 1x106 см/с до 1x105 см/с [12]. Низкая лабораторная воспроизводимость в первую очередь связана с гетерогенностью культуры клеток Сасо-
2. Кроме того, свойства монослоя зависят от времени культивирования, числа пассажей, питательной среды [7-9]. Однако поскольку основной областью применения культуры клеток Сасо-2 служит именно качественная оценка кишечной проницаемости, решением проблемы воспроизводимости является использование внутренних стандартов. В качестве внутренних стандартов рекомендуется использовать модельные маркеры проницаемости из перечня, предложенного FDA [13]. В перечне приведены стандарты «низкой» (менее 90%) и «высокой» (90% и более) кишечной проницаемости, а также стандарт для оценки проницаемости ЛВ, транспортируемых гликопротеином Р, и маркер нулевой проницаемости (табл. 1).
В качественно спланированные исследования проницаемости обычно включают несколько (до 10) внутренних стандартов. Такие исследования могут даже позволить количественно оценить проницаемость ЛВ при обработке данных с помощью моделирующих компьютерных программ, например, GastroPlus™ (Simulation Plus Inc) [14].
Именно большое количество данных по надежной корреляции результатов, полученных в хорошо валидированных исследованиях по изучению проницаемости ш vitro на значительном количестве ЛВ с различными свойствами и механизмами транспорта, позволили рекомендовать монослой эпителиальных клеток Сасо-2 в качестве «золотого стандарта» для моделирования кишечной абсорбции, оценке биодоступности и биоэквивалентности [14].
Методика определения проницаемости in vitro на культуре клеток Сасо-2
Процедура определения проницаемости на культуре клеток Сасо-2 состоит из следующих этапов [8]:
1. Культивирование клеток.
2. Инкубирование клеток на микропористом фильтре.
3. Тест пригодности системы (измерение трансэпителтиального электрического сопротивления или тест с маркерами проницаемости).
4. Определение проницаемости ис-
Таблица 1
Модельный перечень субстанций для оценки проницаемости
Субстанция Проницаемость
антипирин «высокая»1
кофеин «высокая»
карбамазепин «высокая»
флувастатин «высокая»
кетопрофен «высокая»
метопролол «высокая»1
напроксен «высокая»
пропранолол «высокая»
теофиллин «высокая»
верапамил «высокая»2
амоксицилин «низкая»
атенолол «низкая»
фуросемид «низкая»
гидрохлоротиазид «низкая»
маннитол «низкая»1
а-метилдопа «низкая»
ПЭГ-400 «низкая»
ПЭГ-1000 «низкая»
ПЭГ-4000 «низкая»3
ранитидин «низкая»
Примечание: 1 - рекомендуемые внутренние стандарты;2 - стандарт для оценки проницаемости ЛВ, транспортируемых гликопротеином Р;
3 - маркер нулевой проницаемости.
пытуемой субстанции (с внутренним стандартом).
5. Количественное определение.
Культивирование клеток проводят на питательной среде (например, ДМЕМ), в состав которой входят заменимые аминокислоты (1%), глюкоза (25 мМ), глутамин (2 мМ) с прибавлением сыворотки крови эмбриональной телячьей (15-20%) и антибиотика (например, 100 мкг/мл гентамицина). Клетки культивируют в инкубаторе при 37°С в атмосфере с содержанием 5-10% СО, и 90-95% О, и относительной влажности 95%, среду заменяют каждые 2-3 дня. Для проведения исследований проницаемости используют клетки после 25-100 пассажей [8, 9, 14].
Клетки Сасо-2 переносят на микропористые фильтры в количестве приблизительно от 25 000 до 40 000 клеток/см2 (рис.) и инкубируют в течение около 20 дней при вышеуказанных условиях с заменой питательной среды каждые 2-3 дня [8, 9, 14].
Определение проницаемости на культуре клеток Сасо-2 недопустимо проводить до тех пор, пока не будет установ-
лена целостность и функциональность монослоя. Для определения пригодности системы проводят одно из нижеописанных испытаний: определение транс-
эпителиального электрического сопротивления или тест с маркерами низкой проницаемости (например, люциферо-вым желтым, родамином, манниголом или ПЭГ-400). Монослой клеток Сасо-2 считается пригодным для определения проницаемости, если значение транс-эпителиального электрического сопротивления выходит на плато и принимает значения от 260 Ом/см2 до 400 Ом/см2, либо степень проницаемости маркеров не превышает предельного допустимого значения. Рекомендуется проводить оба испытания, однако одного из них будет достаточно [7, 8, 9].
Проницаемость ЛВ изучают в двух направлениях: от апикальной стороны к базолатеральной, и наоборот. Значение рн в донорном (апикальном) и акцепторном (базолатеральном) отсеке обычно составляет 7,4. После внесения пробы и внутренних стандартов в донорный отсек их отбирают спустя установленные интервалы времени из акцепторного от-
Рис. Схематическое изображение монослоя клеток Сасо-2 на микропористом фильтре.
1 - апикальная сторона;
2 - клеточный монослой;
3 - базолатеральная сторона;
4 - микропористый фильтр.
сека и проводят количественное определение методом ВЭЖХ с УФ или МС-детектором. Коэффициент кажущейся кишечной проницаемости рассчитывают по следующей формуле [8]:
dC V
г арр in vitro = X ------ ’ где
dT АхСо
Р - кажущийся коэффициент
арр т vitro J r 1 1 r
кишс'июн проницаемости, см/с;
V - объем пробы, мл;
А - площадь поверхности клеточного монослоя, см2;
Со - исходная концентрация исследуемого ЛВ в донорном отсеке, М;
dC/dT - скорость изменения концентрации исследуемого ЛВ в акцепторном отсеке, М/с.
Заключение
Несмотря на некоторые недостатки, которые присущи каждым биологическим моделям, культура клеток Сасо-2 была признана надежным и относительно несложным инструментом для прогнозирования кишечной проницаемости ЛВ (табл. 2). Данная модель в настоящее время широко применяется для скрининговых целей при изучении транспорта и абсорбции ЛВ, влияния вспомогательных веществ и лекарственного взаимодействия на процессы всасывания, а также при оценке взаимозаменяемости воспроизведенных JIB in vitro (процедура «биовейвер») [9, 12]. В связи с вышеуказанным, следует начать развивать данное направление и в России.
Таблица 2
Основные достоинства и недостатки моделирования кишечной проницаемости на культуре клеток Сасо-2
Достоинства Недостатки
Высокий уровень корреляции с данными ¡n vivo, полученный в значительном количестве исследований Не учитываются некоторые физиологические факторы (слизь, желчные кислоты, площадь поверхности всасывания)
Быстрый и относительно несложный метод Клетки имеют опухолевое происхождение
Моделирование проводится на клетках человека Применим преимущественно для качественной оценки проницаемости, поскольку метод обладает невысокой межлабораторной воспроизводимостью
Список литературы
1. Amidon GL,., Lennerlas H., Shah V.P., Crison JR. A theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification: The correlation of in vitro drag product dissolution and in vivo bioavailability II Pharmaceutical Recearch. 1995. № 12. P. 413-420.
2. Proposal to waive in vivo bioequivalence requirements for WHO Model List of Essential Medicines immediate-release, solid oral dosage forms. Technical Report Series, No 937, 40th Report, Annex 8 of WHO Expert Committee
on Specifications for Pharmaceutical Preparations. World Health Organization (WHO). 2006.
3. Kasim NA., Whitehouse M., Ramachandran C., Bermejo M., Lennernds H., Hussain A.S., Junginger H.IL, Stavchansky SA., Midha K.K., Shah V.P., Amidon G.L. Molecular properties of WHO essential drugs and provisional biopharmaceutical classification II Molecular Pharmaceutics. 2004. Vol. 1. № 1. P. 85-96.
4. Kim J.-S., Mitchell S., Kijek P., Tsume Y., Hilflnger J., Amidon G.L. The
suitability of an in situ perfusion model for permeability determinations: utility for BCS Class I biowaiver requests II Molecular Pharmaceutics. 2004. Vol. 1. № 1. P. 85-96.
5. Yee S. In vitro permeability across Caco-2 cells (colonic) can predict in vivo (small intestinal) absorption in man - Fact or myth II Pharmaceutical Research. 1997. Vol. 14. № 6. P. 763-766.
6. Wu C.-Y., Benet L. Predicting
Drug Disposition via Application of BCS: Transport I Absorption I
Elimination Interplay and Development of a Biopharmaceutics Drug Disposition Classification System II Pharmaceutical Research. 2005. Vol. 22. № 1. P. 11-23.
7. Artursson P., Palm K., Luthman K. Caco-2 monolayers in experimental and theoretical predictions of drug transport II Advanced Drug Delivery Reviews. 2001. Vol. 46. P. 27-43.
8. Le Ferrec E., Chesne C., Artursson P. et al. In Vitro Models of the Intestinal Barrier. The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 46 II ATLA. 2001. Vol 29. P. 649-668.
9. Shah P., Jogani V., Bagchi T., Misra A. Role of Caco-2 Cell Monolayers in Prediction of Intestinal Drug Absorption II Biotechnology Progress. 2006. Vol. 22. № 1. P. 186-198.
10. Lennernas H., Palm K., Fagerholm V., Artursson P. Comparison between
active and passive drug transport in human intestinal epithelial (Caco-2) cells: In vitro and human jejunum in vivo II International Journal of Pharmaceutics. 1996. Vol. 127. № 1. P. 103-107.
11. Artursson P.,KarlssonJ. Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial (Caco-2) cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 1991. Vol 175. №3. P. 880-885.
12. Dahan A.,Miller JM.,Amidon G.L.
Prediction of Solubility and Permeability Class Membership: Provisional BCS
Classification of the World’s Top Oral Drugs 11 AAPS J. 2009. Vol. 11. № 6. P. 740-746.
13. Guidance for industiy: Waiver of in vivo bioavailability and bioequivalence studies for immediate-release solid oral dosage forms based on a Biopharmaceutics Classification System. U.S., Department of Health and Human Seivices, Food and Drug Administration (HHS-FDA), Center for Drug Evaluation and Research (CDER), 2000.
14. Соловьев AM., Резников А.Г., Тарасенко Л.В., Маргитич B.M. Первый в Украине успешный опыт применения биовейвера для экспертной оценки лекарственного средства (Летромара)
II Журнал АМН Украины. 2006. т. 12. №4. С. 781-794.
Application of biological model for assessment of intestinal permeability of in vitro - a monolayer of epitelialny Caco-2 cells
I.E. Shohin, J.I. Kulinich, G.V. Ramenskaya, V.G. Kukes
Paper is devoted to the application of epithelial monolayer of human colon adenocarcinoma cells - Caco-2 for in vitro permeability evaluation of drugs. Main advantages of this biological model are described. General principles, approaches and methodology of Caco-2 permeability assay are defined. Correlation between human intestinal permeability in vitro and apparent permeability coefficient in vitro is indicated.
Key words: Caco-2 cells, permeability, absorbtion.
