CC BY
61
5. Alekseenko V.A., Buzmakov M.S., Panin M.S. Geohimiya okruzhayushchej sredy: ucheb. posobie dlya vuzov / Perm. gos. nac. issled. un-t. - Perm', 2013. - 359 s.
6. Borisova T.G. Eti zagadochnye helatnye udobreniya // AiF na dache. - 2012. - №11. - S.2.
7. Alyohin S.N., Sidorova N.V. Optimal'noe soderzhanie podvizhnyh form NPK v pitatel'noj smesi // Tekhnicheskie kul'tury. - 1993. -№ 1. - S. 20-22.
8. YAkovlev E.B. HAKAFOS. URL: - http://compo-expert-cis.com/Product/Hakaphos (data obrashcheniya: 15.02.2019).
УДК 631.87: 633.52 DOI 10.24411/2078-1318-2019-12038
Канд. биол. наук Р.С. ГАМЗАЕВА (ФГБОУ ВО СПбГАУ, [email protected])
ПРИМЕНЕНИЕ БИОДЕСТРУКТОРА БАК-ВЕРАД НА ДЕРНОВО-ПОДЗОЛИСТОЙ ПОЧВЕ, ЗАГРЯЗНЕННОЙ НЕФТЕПРОДУКТАМИ
В настоящее время нефть и нефтепродукты представляют один из наиболее широко распространенных и токсичных классов загрязнителей окружающей среды. Поступая в почву, они в первую очередь влияют на ее биологические свойства. Несмотря на большое количество работ, посвященных этой теме, до сих пор остаются нерешенными вопросы, связанные с оценкой воздействия нефтяного загрязнения на микрофлору почвы, на биологические и морфологические особенности развития растений. В настоящее время успешно развиваются технологии биоремедиации нефтезагрязненных территорий. Решение проблемы достигается за счет стимуляции микробных ценозов путем внесения удобрений, микроорганизмов, которые способны наиболее эффективно утилизировать данный загрязнитель или путем внесения различных биопрепаратов. Наиболее перспективным направлением биоремедиации нефтезагрязненных объектов является применение биологического метода, основанного на использовании биохимического потенциала микроорганизмов, позволяющих ускорить разложение нефти и нефтепродуктов, не нанося дополнительного ущерба нарушенной экосистеме [2].
Даже незначительное загрязнение нефтью вызывает снижение количества микроорганизмов, угнетает процессы азотфиксации, нитрификации, разложения целлюлозы и приводит к накоплению трудно окисляемых продуктов в почве.
Поскольку основным элементом, входящим в состав нефти, является углерод, массовое содержание которого колеблется в пределах 83-87%, то содержание органического вещества в расчете на общий углерод и гумус в загрязненных почвах возрастает за счет углерода нефти [2].
Одновременно с ростом содержания привнесенного углерода происходит увеличение отношения C:N. При этом изменения содержания общего азота незначительны. Как известно, чем меньше отношение C:N, тем выше подверженность органического вещества к минерализации. Наиболее благоприятны для микробного гидролиза соединения с величиной C:N от 10 до 20. В нефтезагрязненной почве отношение C:N колеблется от 50 до 400-420 в зависимости от количества привнесенного углерода и типа почвы, что приводит к ухудшению азотного режима почв и нарушению корневого питания растений [1,2].
В нефтезагрязненных почвах, наряду с ухудшением азотного режима, происходит уменьшение содержания подвижных форм фосфора и калия, что снижает численность микроорганизмов, способных утилизировать загрязнитель. Поэтому один из важных факторов при биоремедиации - это стимулирование роста природных микроорганизмов, способных к деструкции углеводородов, внесением биогенных элементов.
Цель исследований - изучение особенностей применения биодеструктора Бак-Верад на дерново-подзолистой почве, загрязненной нефтепродуктами.
Материалы, методы и объекты исследования. Исследования по изучению влияния биопрепарата Бак-Верад на степень деструкции углеводородов нефти при выращивании растений ячменя и салата проводили в 2017-2018 гг. Для этого использовали сосуды Кирсанова (емкость 5 кг). В отдельной емкости почву загрязняли нефтью, перемешивали и добавляли суспензию биопрепарата Бак-Верад (5 мл на сосуд). В качестве биогенных источников азота, фосфора и калия использовали минеральные удобрения (по Кнопу) из расчета на сосуд: калий хлористый (KCl) - 1 г и суперфосфат двойной (Са(ШРО4)2 х Н2О) - 1,2 г, аммиачная селитра (NH4NO3) - 1,2 г/сосуд. Все операции при закладке опыта проводили в начале августа 2017 года. Сосуды были оставлены в вегетационном домике. В конце мая 2018 года был произведен посев с предварительным внесением биопрепарата (за 10 дней). Общее количество микроорганизмов определяли на 25 день после посева методом количественных разведений (по Коху), общую биологическую активность определяли методом аппликаций (по интенсивности разложения полотна) [5]. Количество хлорофиллов определяли спектрофотометрическим методом при длине волн 665, 649,445 нм. Для расчета концентрации хлорофиллов использовали формулу Винтерманса де Мотса [8].
Объектами исследований явились ячмень (сорт Потра) и салат (сорт Азарт). Остаточное количество нефтепродуктов определяли на приборе ИКН-025 (ПНДФ 16.1; 2.2.22-98) [7].
Опыт закладывали по следующей схеме:
1.Контроль;
2.№К-фон;
3.Фон+2000 мг/кг нефтепродукта;
4.Фон+6000 мг/кг нефтепродукта;
5.Фон+10000 мг/кг нефтепродукта;
6.Фон+2000 мг/кг + деструктор;
7.Фон+6000 мг/кг + деструктор;
8.Фон+10000 мг/кг + деструктор.
Характеристика бактериального препарата Бак-Верад.
Бактериальный препарат Бак-Верад состоит из консорциума штаммов бактерий родов Bacillus, Atherobacter, Rhodococcus и Pseudomonas. Бак-Верад предназначен для ускорения биологической деструкции в окружающей среде углеводородных ксенобиотиков. Препарат выпускается в жидкой и сухой формах.
Характеристика микроорганизмов, составляющих препарат Бак-Верад:
Род Bacillus относится к семейству Bacillaceae, классу Firmibacteria, отделу Firmicutes. Грамположительные. Аэробы. Образуют споры. Сапротрофы.
Род Atherobacter (коринеформные бактерии) относится к классу Tallobacteria, отделу Firmicutes. Грамположительные. Спор не образуют. Строгие аэробы. Хемоорганотрофы. Сапротрофы.
Род Rhodococcus относится к семейству Actinomycetes, классу Tallobacteria, отделу Firmiccutes. Грамположительные. Хемоорганотрофы. Аэробы. В цикле развития имеют мицелиальную стадию [3].
Род Pseudomonas относится к семейству Pseudomonadaceae, классу Scotobacteria, отделу Gracilicutes. Грамотрицательные. Неспоровые бактерии. Хемоорганотрофы. Строгие аэробы.
Результаты исследования. Целлюлоза является самым распространённым органическим соединением в природе. В ее состав входит более 50% всего органического углерода. Разложение целлюлозы играет первенствующую роль в круговороте углерода, так как именно этот процесс обеспечивает возврат основной массы СО2 в атмосферу. С разложением целлюлозы в почве связано образование гумусовых веществ и формирование почвенной микрофлоры.
Биологическую активность почвы определяли методом аппликаций. Известно, что этот метод свидетельствует о разрушении клетчатки и об активности целлюлозоразлагающих микроорганизмов [5].
Поскольку их активность в значительной степени определяется присутствием в почве доступных питательных веществ и в первую очередь азотных, то можно предположить, что этот метод отображает напряженность хода микробиологических процессов в целом.
л 60
р
0
§ 50
с
з:
1 40
§ * 5 зо
о.
20 10 о
111
^ ^
^ ^ У ^ ^
^ ^ ^
дч-4 ^ ^ ^
/ / / / / /
^ ^ ^
Варианты опыта
Рис. 1. Влияние биодеструктора Бак-Верад на общую биологическую активность почвы
при выращивании ячменя
л 40
1 35 о
с 30
= 25
ш
о * 20
я 15 а.
I 10
£ 5 и
0
.111
„о* ^ ^ Л
у </ / У / / /
/ / / х/ / /
^
/ / / / / / Варианты опыта
Рис. 2. Влияние биодеструктора Бак-Верад на общую биологическую активность почвы
при выращивании салата
Результаты наших исследований показали, что при применении биодеструктора общая биологическая активность возрастала во всех вариантах (рис.1,2). Причем максимальная биологическая активность отмечена при выращивании ячменя (рис.1).
Известно, что чем выше в почве содержание подвижного азота и других элементов питания, тем активнее идет окисление целлюлозы. Также известно, что на активность разложения целлюлозы влияют и бактериальные препараты [3]. Целлюлозоразрушающие микроорганизмы, разлагая клетчатку, синтезируют и частично выделяют в среду аминокислоты [5]. Вероятно, это и способствовало увеличению общего количества микроорганизмов в 1 грамме почвы(табл.1).
Таблица 1. Влияние биодеструктора Бак-Верад на содержание количества микроорганизмов
в 1 г сырой почвы
Варианты опыта Культура Количество микроорганизмов в 1 г почвы
Контроль Ячмень 1430000
ОТК-фон 2990000
Фон+2000 мг/кг (10 мл нефти) 980000
Фон+6000 мг/кг (30 мл нефти) 560000
Фон+10000 мг/кг (50 мл нефти) 290000
Фон+2000 мг/кг + деструктор 1930000
Фон+6000 мг/кг + деструктор 2130000
Фон+10000 мг/кг + деструктор 1990000
НСР05 20500
Контроль Салат 1350000
ОТК-фон 2690000
Фон+2000 мг/кг (10 мл нефти) 780000
Фон+6000 мг/кг (30 мл нефти) 660000
Фон+10000 мг/кг (50 мл нефти) 590000
Фон+2000 мг/кг + деструктор 1850000
Фон+6000 мг/кг + деструктор 2020000
Фон+10000 мг/кг + деструктор 1890000
НСР05 144706
Из данных табл. 1 видно, что общее количество микроорганизмов в вариантах с применением биодеструктора возрастала. Причём наибольшее количество КОЕ также отмечена при выращивании ячменя. При анализе выросших колоний на МПА было выявлено, что в вариантах с биодеструктором наблюдалось значительное количество колоний таких микроорганизмовв как- Bacillus mycoides, Bacillus mesentericus, Bacillus subtilis, а также ветвящихся бактерий - Actinomycetales, что доказывает аммонифицирующую и целлюлозоразлагающую активность почвы. Микробиологическая диагностика загрязненной дерново-подзолистой почвы показала, что в численности микромицетов преобладали грибы родов Penicillium и Aspergillus. Наиболее устойчивым к нефтяному загрязнению оказался вид Aspergillus niger, который присутствовал как в контроле, так и во всех вариантах нефтезагрязненной почвы.
Известно, что на количественное содержание фотосинтетических пигментов влияют фиторегуляторы роста [6], бактериальные препараты [4], но недостаточно данных о влиянии нефтепродуктов.
Неблагоприятные условия среды, такие как засуха, высокие и низкие температуры, засоление, нефтезагрязнение и другие, оказывают влияние на фотосинтетический аппарат и, как следствие, на пигменты фотосинтеза. Два важных процесса в растении - фотосинтез и
дыхание - обеспечивают материально-энергетическую основу жизнедеятельности растений. Эти процессы обеспечивают растительные организмы метаболитами и энергетическими источниками такими как АТФ и НАДФ. Высокие концентрации нефти отрицательно сказываются на структуру хлоропластов, процессы циклического и нециклического фотофосфоролирования [11].
Все без исключения стрессоры в определенной интенсивности нарушают протекание процесса фотосинтеза, дыхания и других физиологических процессов, что приводит к появлению активных форм кислорода, крайне отрицательно влияющих на клеточный метаболизм. Для снижения уровня этих агрессивных радикалов также используются одни и те же системы защиты в разных растениях и при разных стрессовых условиях [10,11].
Таблица 2. Влияние биодестуктора Бак-Верад на содержание фотосинтетических пигментов
в листьях ячменя и салата мг/г сырой почвы
Варианты опыта Хлорофилл а Хлорофилл б Каротиноиды
Ячмень
Контроль 6,92 2,74 2,13
NPK-фон 7,73 2,85 1,56
Фон+2000 мг/кг нефтепродукта 4,1 2,72 1,98
Фон+6000 мг/кг нефтепродукта 4,0 2,45 1,92
Фон+10000 мг/кг нефтепродукта 3,7 2,10 1,52
Фон+2000 мг/кг + деструктор 5,14 2,70 1,98
Фон+6000 мг/кг + деструктор 5,0 2,47 1,94
Фон+10000 мг/кг + деструктор 4,85 2,41 1,76
НСР0,5 0,31 0,33 0,21
Салат
Контроль 2,42 0,61 0,89
NPK-фон 2,67 0,72 0,95
Фон+2000 мг/кг нефтепродукта 1,52 0,4 0,79
Фон+6000 мг/кг нефтепродукта 1,55 0,37 0,81
Фон+10000 мг/кг нефтепродукта 1,59 0,36 0,72
Фон+2000 мг/кг + деструктор 1,95 0,48 0,82
Фон+6000 мг/кг + деструктор 1,99 0,48 0,82
Фон+10000 мг/кг + деструктор 2,0 0,46 0,84
НСР05 0,17 0,09 0,04
Важную роль в стрессе растений играют каротиноиды. Известно, что они защищают клетки растений от повреждений. Они присутствуют в мембранах у всех фотосинтезирующих организмов, где они выполняют ряд важнейших функций в процессе фотосинтеза: антенную (дополнительные пигменты в процессе поглощения солнечной энергии), защитную (тушители триплетного хлорофилла и синглетного кислорода) и
фотопротекторную (предохраняют реакционный центр от мощных потоков энергии при высоких интенсивностях света и стабилизируют липидную фазу тилакоидных мембран, защищая ее от переокисления [10,11].
Результаты определения содержания зеленых пигментов свидетельствуют о том, что количество хлорофиллов а и б значительно снижалось в вариантах с нефтепродуктами по сравнению с контрольными вариантами (табл.2). Возможно, это связано с нарушением процесса биосинтеза хлорофиллов в условиях стресса. Установлено, что содержание каротиноидов в вариантах с нефтепродуктами незначительно отличалось от контрольных вариантов у обоих изученных растений (табл.2). Вероятно, этот факт имеет адаптивное значение, так как каротиноидам принадлежит протекторная роль. Они являются компонентами антиоксидантной системы, в функции которой входит защита мембран от повреждающего действия свободных радикалов [10,11].
Нефть оказывает отрицательное влияние на рост, метаболизм и развитие растений, подавляет рост надземных и подземных частей растений, в значительной степени задерживает начало цветения и колошения. Загрязненные нефтью цветки редко образуют семена [12].
Результаты опытов показали, что биологическая продуктивность изученных растений в вариантах с обработкой биодеструктором была выше по сравнению с вариантами без обработки почти 2 раза.
Таблица 3. Влияние биопрепарата Бак-Верад на биомассу наземных органов растений
ячменя и салата
Варианты опыта Биомасса наземных органов г/сосуд
ячмень салат
Контроль 42,7 83,9
ОТК-фон 67,6 98,4
Фон+2000 мг/кг нефтепродукта 21,7 38,6
Фон+6000 мг/кг нефтепродукта 19,4 29,9
Фон+10000 мг/кг нефтепродукта 14,4 17,3
Фон+2000 мг/кг + деструктор 36,6 67,8
Фон+6000 мг/кг + деструктор 34,3 61,6
Фон+10000 мг/кг + деструктор 30,8 44,7
НСР0,5 1,1 4,2
Известно, что при применении консорциума микроорганизмов биодеградация нефти происходит более эффективно и за меньшие сроки, чем при использовании индивидуальных бактерий. Этот факт объясняется тем, что микроорганизмы, входящие в состав ассоциаций, обладая разными ферментными системами, способны деградировать углеводороды более эффективно [1].
Результаты наших исследований показали, что внесение биопрепарата Бак-Верад значительно снижает содержание нефтепродуктов в почве (табл.3). Отмечено, что разложение нефтепродуктов в вариантах с внесением деструктора в 3-4 раза выше, чем в вариантах без обработки. В ходе исследований также выявлено, что при выращивании ячменя биодеструкция осуществляется более эффективно, чем при выращивании салата (табл.1). Возможно, это связано с тем, что растения ячменя обладают способностью создавать в прикорневой зоне (ризосфере) микрофлору за счет экзосмоса, которая способствует более интенсивному протеканию микробиологических процессов в почве. В зависимости от многих причин интенсивность экзоосмоса может быть большей или меньшей. Также известно, что ризосферные микроорганизмы способны к деградации различных токсичных веществ, в том числе и углеводородов нефти [12].
Таблица 4. Деструкция углеводородов нефти при применении препарата Бак-Верад
Варианты опыта Ячмень Салат
Содержание нефтепродуктов мг/кг через 12 месяцев Степень деградации в %, через 12 месяцев Содержание нефтепродуктов мг/кг через 12 месяцев Степень деградации в %, через 12 месяцев
Контроль 0 - 0 -
NPK-фон 0 - 0 -
Фон+2000 мг/кг нефтепродукта 1830 8,5 1870 6,5
Фон+6000 мг/кг нефтепродукта 5640 6,0 5480 8,7
Фон+10000 мг/кг нефтепродукта 9170 8,3 9420 5,8
Фон+2000 мг/кг + деструктор 1380 31,0 1560 22
Фон+6000 мг/кг + деструктор 4260 29,0 4380 27,0
Фон+10000 мг/кг + деструктор 7640 23,6 8130 18,7
НСР95 144 - 157 -
Таким образом, на основании наших исследований можно сделать следующие выводы:
1. Результаты наших исследований показали, что применение биодеструктора Бак-Верад увеличивает общую биологическую активность дерново-подзолистой почвы, загрязненной нефтепродуктами.
2. При применении биодеструктора количественное содержание хлорофиллов а и б у растений ячменя и салата возрастает, а на пул каротиноидов нефтепродукты не оказали существенного влияния.
3. При внесении биопрепарата Бак-Верад деструкция нефтепродуктов протекает более эффективно.
4. Культура ячменя менее фитотоксична к нефтяному загрязнению, чем культура
салата.
Литература
1. Ветрова А.А. Биодеградация углеводородов нефти плазмидсодержащими микроорганизмами деструкторами: автореф. дис... канд. биол. наук.- М.: МГУ, 2010. - 10 с.
2. Габбасова И.М., Абдурахманов Р.Ф., Хабиров И.К., Хазиев Ф.Х. Изменение свойств почв и состава грунтовых вод при загрязнении нефтью и нефтепромысловыми сточными водами в Башкортостане // Почвоведение. - 1997. - №11. - С. 1362-1372.
3. Гамзаева Р.С. Влияние биопрепаратов и минеральных удобрений на общую биологическую активность почвы и урожайность ячменя // Известия Санкт-Петербургского государственного аграрного университета. - 2015. - № 42. - С. 86-90.
4. Гамзаева Р.С. Влияние биопрепаратов Флавобактерин и Мизорин на физиолого-биохимические показатели различных сортов ячменя // Известия Санкт-Петербургского государственного аграрного университета. - 2015. - № 40. - С. 38-42.
5. Емцев В.Т., Мишустин Е.Н. Микробиология. - М.: Дрофа,2005. - 328 с.
6. Лаврищева Т.А. Сравнительная оценка сортов салата цикорного Эндивия в весенне-летнем обороте в пленочных теплицах Ленинградской области // Известия Санкт-Петербургского государственного аграрного университета. - 2017. - № 46. - С. 38-42.
7. Методы определения нефтепродуктов в почвах и грунтах. URL: http://nortest.pro/stati/pochva/opredelenie-nefteproductov.html. (дата обращения: 13.04.2019).
8. Гавриленко В.Ф., Жигалова Т.В. Большой практикум по фотосинтезу. - М.: Академия, 2003. - 254 с.
9. Дымова О.В., Головко Т.К. Состояние пигментного аппарата растений живучки ползучей в связи с адаптацией к световым условиям произрастания // Физиология растений. -2007.Т. 54.- № 1.
10.Кузнецов В.В., Дмитриева Г.А. Физиология растений. - М.: Высшая школа, 2005. - 736 с.
11.Чиркова Т.В. Физиологические основы устойчивойсти растений: учеб. пособие. - СПб:
Изд-во СПбГУ, 2002. - С. 58-68.
12.Шамраев А.В., Шорина Т.С. Влияние нефти и нефтепродуктов на различные компоненты окружающей среды // Вестник ОГУ. - 2009. - №6. - С. 642
Literatura
1. Vetrova A.A. Biodegradaciya uglevodorodov nefti plazmidsoderzhashchimi mikroorganizmami destruktorami: avtoref. dis... kand. biol. nauk.- M.: MGU, 2010. - 10 s.
2. Gabbasova I.M., Abdurahmanov R.F., Habirov I.K., Haziev F.H. Izmenenie svojstv pochv i sostava gruntovyh vod pri zagryaznenii neft'yu i nefepromyslovymi stochnymi vodami v Bashkortostane // Pochvovedenie. - 1997. - №11. - S. 1362-1372.
3. Gamzaeva R.S. Vliyanie biopreparatov i mineral'nyh udobrenij na obshchuyu biologicheskuyu aktivnost' pochvy i urozhajnost' yachmenya // Izvestiya Sankt-Peterburgskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. - 2015. - № 42. - S. 86-90.
4. Gamzaeva R.S. Vliyanie biopreparatov Flavobakterin i Mizorin na fiziologo-biohimicheskie pokazateli razlichnyh sortov yachmenya // Izvestiya Sankt-Peterburgskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. - 2015. - № 40. - S. 38-42.
5. Emcev V.T., Mishustin E.N. Mikrobiologiya. - M.: Drofa,2005. - 328 s.
6. Lavrishcheva T.A. Sravnitel'naya ocenka sortov salata cikornogo Endiviya v vesenne-letnem oborote v plenochnyh teplicah Leningradskoj oblasti // Izvestiya Sankt-Peterburgskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. - 2017. - № 46. - S. 38-42.
7. Metody opredeleniya nefteproduktov v pochvah i gruntah. URL: http://nortest.pro/stati/pochva/opredelenie-nefteproductov.html. (data obrashcheniya: 13.04.2019).
8. Gavrilenko V.F., ZHigalova T.V. Bol'shoj praktikum po fotosintezu. - M.: Akademiya, 2003. - 254 s.
9. Dymova O.V., Golovko T.K. Sostoyanie pigmentnogo apparata rastenij zhivuchki polzuchej v svyazi s adaptaciej k svetovym usloviyam proizrastaniya // Fiziologiya rastenij. - 2007. - T. 54.- № 1.
10.Kuznecov V.V., Dmitrieva G.A. Fiziologiya rastenij. - M.: Vysshaya shkola, 2005. - 736 s.
11.CHirkova T.V. Fiziologicheskie osnovy ustojchivojsti rastenij: ucheb. posobie. - SPb: Izd-vo SPbGU, 2002. - S. 58-68.
12.SHamraev A.V., SHorina T.S. Vliyanie nefti i nefteproduktov na razlichnye komponenty okruzhayushchej sredy // Vestnik OGU. - 2009. - №6. - S. 642.
