CC BY
24
НАУЧНЫЕ
ПУБЛИКАЦИИ
ПРИМЕНЕНИЕ АУТОЛОГИЧНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК С ЦЕЛЬЮ СПОНДИЛОДЕЗА
Сергей Макаревич,
заведующий нейрохирургическим отделением №1
РНПЦ травматологии и ортопедии, доктор медицинских наук, доцент; sv.mak@mail.ru
Андрей Мазуренко,
заведующий лабораторией травматических повреждений позвоночника и спинного мозга РНПЦ травматологии и ортопедии, кандидат медицинских наук, доцент; mazurenko@mail.ru
Кирилл Криворот,
старший научный сотрудник лаборатории травматических повреждений позвоночника и спинного мозга
РНПЦ травматологии и ортопедии, кандидат медицинских наук; kirill.doc@mail.ru
Андрей Малашенко,
врач-нейрохирург нейрохирургического отделения №1 РНПЦ травматологии и ортопедии; mallat2012@mail.ru
Михаил Потапнев,
заведующий отделом клеточных биотехнологий РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий, доктор медицинских наук, профессор; potapnev@blood.by
Светлана Космачева,
заведующий лабораторией биологии и генетики стволовых клеток РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий, кандидат медицинских наук, доцент; kosmacheva@blood.by
Наталья Данилкович,
научный сотрудник лаборатории биологии и генетики стволовых клеток РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий; nndanilkovich@gmail.com
Александра Ионова,
младший научный сотрудник лаборатории биологии и генетики стволовых клеток РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий; al_ionova96@mail.ru
УДК 616.419-018.4-089.843:616.711-089.22
Аннотация. Несмотря на успехи в хирургии позвоночника, псевдоартроз остается актуальной проблемой. Оптимизировать лечение этой патологии можно с помощью трансплантата на основе клеточных технологий. В рамках задания «Разработка и внедрение метода спондилодеза с использованием аутологичных мезенхимальных стволовых клеток»(2017-2020 гг.) создан биотрансплантат на основе аутологичных МСК костного мозга; установлена наиболее подходящая доза МСК для биотрансплантата (не менее 300х103 клеток на см2); описано влияние плазмы, обогащенной тромбоцитами (ПОРФТ), на пролиферативную активность МСК на коллагеновой губке (добавление 5% ПОРФТ приводит к увеличению синтеза мРНК фактора транскрипции (Run X), щелочной фосфа-тазы и остеопонтина в 15,4,1,4 и 13,2 раза соответственно); предложен способ получения остеогенного биомедицинского клеточного продукта для формирования биотрансплантата; составлена программа клинических испытаний, на основании которой прооперирован один пациент.
Ключевые слова: спинальнаяхирургия, спондилодез, псевдоартроз, аутоло-гичные мезенхимальные стволовые клетки, биотрансплантат, спондилолистез. Для цитирования: Макаревич С., Мазуренко А., Криворот К., Малашенко А, Потапнев М., Космачева С., Данилкович Н., Ионова А. Применение аутологичных мезенхимальных стволовых клеток с целью спондилодеза //Наука и инновации. 2019. №11. С. 79-84. https://doi.org/10.29235/1818-9857-2019-11-79-84
В хирургии позвоночника широко применяется внутренняя фиксация, что способствует костному сращению и, соответственно, улучшению результата лечения. В поясничном отделе позвоночника в основном используются винтовая транспедикулярная фиксация, закрепление тел позвонков пластинами, а также замещение их костными (ауто-, аллогенными) трансплантатами [1]. Для изготовления имплантатов предпочтительны титан и его сплавы, поскольку они наиболее биосовместимы с человеческими тканями, а также приемлемы по прочности и коррозионной
1 неделя
3 недели
Рис. 1. Компоненты биотрансплантата при культивировании в лунках планшета
устойчивости в физиологической среде [2, 3]. Альтернативой пересадке кости для регенерации незаживающих дефектов являются клеточные технологии, остеогенные факторы роста и бесклеточные подложки или имплантация костных эквивалентов (при комбинации клеток, подложек и факторов роста). Независимо от способа терапии для регенерации кости необходимо наличие следующих условий: остеоиндуктивные сигналы, матрикс с адгезивной поверхностью, который задерживает их, и остеогенные клетки, которые прикрепляются к матриксу и дифференцируются в остеобласты в ответ на сигналы [4].
Поскольку эффективных им-плантов для восстановления дефектов позвоночника до сих пор не предложено, актуально создание трансплантата на основе клеточных технологий.
Нами разработан метод ауто-трансплантации аутологичных мезенхимальных стромальных клеток (МСК) и проведены его клинические испытания. Предварительно были выполнены куль-туральные, морфологические, ги-
стохимические, молекулярно-генетические исследования.
На цитотоксичность (совместимость с культурой клеток) протестированы биокомпозитные материалы (пластины, гранулы, гель) «Коллапан» (Россия), «Остеоматрикс» (Россия) и колла-геновая губка «Лиостипт» (Испания). Их в виде навесок по 10 мг предварительно стерилизовали в течение 30 мин при 120 °С. Затем образцы помещали в 24-луночный планшет, заливали полной питательной средой (ППС) на основе а-МЕМ, содержащей 10% феталь-ной бычьей сыворотки (ФБС), 1% антибиотиков, и выдерживали 24 часа. Оценивали токсичность в отношении МСК как самих биоматериалов (отмытых и неотмы-тых), так и их супернатантов, полученных после 24-часового инкубирования. МСК за 22-24 часа до внесения материалов высевали по 1,0х105 в лунки планшета для прикрепления клеток к ростовой поверхности. После культивирования из лунок удаляли среду, помещали в них приготовленные образцы, добавляли свежую ППС в объеме 200 мкл и культивировали при 37 °С и 5% СО2.
Контролем служили МСК в ППС без материалов в аналогичных посевной концентрации и условиях культивирования. Планшет инкубировали 22-24 ч (сутки) и 168 ч (7 суток). Количество жизнеспособных клеток по окончании эксперимента оценивали с помощью колориметрического теста МТТ.
Из дозы концентрата тромбоцитов по описанной в работе [5] методике получали плазму, обогащенную растворимыми факторами тромбоцитов (ПОРФТ). Ее влияние на направленную остеогенную дифференцировку МСК костного мозга человека в 3Б-конструкции на коллагено-вой губке оценивали по увеличению синтеза мРНК транскрипционного фактора (Run X), щелочной фосфатазы (ALP) и остео-понтина (OSP) методом ОТ-ПЦР в реальном времени.
Для определения соотношения компонентов в биотрансплантате коллагеновую губку «Лиостип» размером 1,5x1 см помещали в 6-луночный планшет. МСК 1-го пассажа, преддиффе-ренцированные в остеогенном направлении в течение 7 дней, высевали на губку в посевной концентрации 600x103 клеток. Также в лунки планшета вносили фрагменты губчатой кости весом около 100 мг (±5-8 мг) и культивировали в полной питательной среде на основе среды альфа-МЕМ с 5% АВ (IV) сыворотки и 5% ПОРФТ от 1 до 3 недель. Смену среды осуществляли дважды в неделю. Морфологию биотрансплантата in vitro оценивали под световым инвертированным микроскопом;количество жизнеспособных клеток считали по исключению три-панового синего после снятия их с помощью 0,025% раствора
Трипсин-ЭДТА; жизнеспособность МСК на коллагеновой губке определяли под флуоресцентным микроскопом при окрашивании красителем Hoest 3334 для прижизненной визуализации МСК в составе биотрансплантата.
Методика получения остеогенного биомедицинского клеточного продукта (БМКП) для формирования биотрансплантата
Лабораторная подготовка. Для создания биотрансплантата использовали аутологичные МСК костного мозга пациента, наращенные в полной питательной среде с применением сыворотки AB (IV) крови человека [5].
Дифференцировку клеток в остеогенном направлении проводили с добавлением в питательную среду 10 мМ/мл ß-глицеро-фосфата, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты, 0,1 цМ/мл дексаметазона и 5% ПОРФТ в течение 6-7 дней со сменой среды через 3 дня. Затем клетки отмывали физиологическим раствором для инъекций, снимали с поверхности флакона 0,25% раствором трипсин-ЭДТА, дважды отмывали физраствором хлорида натрия с 1% аутологич-ной сывороткой, ресуспендиро-вали в объеме 2 мл физраствора с добавлением 5% аутологичной сыворотки пациента.
Для контроля качества полученного БМКП считали количество клеток, определяли их жизнеспособность, подлинность (иммунофенотип по маркерам CD34-, CD45-, CD90+ и CD105+), стерильность.
Тестирование биокомпозитов «Коллапан» (пластины, гранулы, гель), «Остеоматрикс» и коллагеновой губки «Лиостипт»,
Рис. 2. МСК на коллагеновой губке при прижизненном окрашивании
Рис. 3. Рентгеновская компьютерная томография сегмента позвоночника (15-51) пациентки Д. до операции: А - сагиттальный скан, Б - трансверсальный, В - фронтальный
t Г г
1 ^ 1 Б Г1 гп
Рис. 4. Формирование костного канала: А - метчик компьютерной хирургической навигации, Б - изображение на мониторе КХН, В - формирование канала фрезой
ШЖшIm В
Рис. 5. Титановый кейдж установлен под контролем электронно-оптического преобразователя: А - общий план, Б - боковая проекция, В - прямая проекция
использующихся в хирургической практике, на биосовместимость с клетками показало, что эти материалы вызывают гибель менее 30% МСК in vitro; при оценке острой токсичности жизнеспособность клеток варьировала от 87,6 до 89,0% при прямом контакте и от 82,7 до 100% - их супернатантов. Показатели были сопоставимы с контрольным - образца МСК, выращенного в полной питательной среде. При продлении культивирования МСК с биоматериалами до 7 суток клетки адаптируются на поверхности материалов и начинают проли-ферировать. Таким образом, для создания биотрансплантата для регенерации костного дефекта возможно использование гранул «Коллапана» или «Остео-матрикса» как материалов, обладающих остеоиндуктивными и остеокондуктивными свойствами, в комбинации с колла-геновой губкой.
При создании тканеинженер-ных конструкций для поддержания жизнеспособности МСК
Рис. 6. Заполнение титанового кейджа: А - гемостатическая губка, Б - флакон с ПОРФТ и
необходимо присутствие в трансплантате ростовых факторов, малых молекул. В качестве их источника нами выбрана 5% ПОРФТ. Ее добавление в остеогенную диф-ференцировочную среду, в которой МСК находятся на коллаге-новой губке, значительно усиливает синтез мРНК Run X (в 15,4 раза), ALP (в 1,4) и OSP (в 13,2 раза) на 4-й день остеогенной индукции клеток. Через 7 дней экспрессия Run X повышается еще в 1,5 раза, ALP - в 2,3 раза, OSP -в 7,2 раза. То есть оптимальный срок для преддифференцировки МСК - 7 дней. За это время происходит экспрессия остеогенных маркеров, но еще не образуются оссификаты кальция.
Основными компонентами трансплантата являются аутоло-гичные МСК, преддифференци-рованные в остеогенном направлении; аутологичная измельченная кость; коллагеновая губка; ПОРФТ. Для определения оптимального соотношения проведено их совместное культивирование in vitro в течение 3 недель в 3 экспериментах, как описано
пробирка с МСК, В - введение МСК
выше. Через неделю образовался гель. Через 3 недели он стал плотным и покрыл все компоненты биотрансплантата. Между губчатой костью и коллагеновой губкой образовался тяж из клеток (рис. 1).
Абсолютное количество МСК в составе биотрансплантата в конце 1-й и 2-й недель культивирования in vitro уменьшилось незначительно по отношению к начальному объему высеянных остеоген-но дифференцированных МСК (600 тыс.) и составило 557,50±24,75 тыс. и 530,00±49,50 тыс. соответственно. Через 3 недели с коллагеновой губки (матрицы Лиостипт) удалось снять только 380,00±7,07 тыс. клеток. Это объясняется формированием между костью и губкой плотного тяжа клеток и невозможностью извлечь их для подсчета.
При окрашивании флуоресцентным красителем Hoest 3334 среди нитей коллагеновой матрицы наблюдалось равномерное заселение жизнеспособными МСК на всех сроках культивирования (рис. 2).
> , Ч
Рис. 7 РКТ сразу после операции:
А - сагиттальный скан, Б - трансверсальный скан, В - фронтальный скан
I Ч
• / 6
В Л
Рис. 8. РКТ через 3 мес. после операции:
А - сагиттальный скан, Б - трансверсальный скан, В - фронтальный скан
, W
;—^ /
| « OCM/ld lD Б ¡'"I I -::5П Р.
Рис. 9. РКТ через 6 мес. после операции:
А - сагиттальный скан, Б - трансверсальный скан, В - фронтальный скан
Б
Б
Таким образом, в экспериментах in vitro показана возможность использования в качестве матрицы всех изучаемых материалов. На 1 см3 любого из них необходимо наносить от 3 до 10 млн клеток. Добавление 5% ПОРФТ в диффе-ренцировочную среду значительно усиливает синтез специфических остеогенных маркеров МСК.
Коллективом авторов разработан протокол клинического испытания метода аутотрансплан-тации МСК, в котором отражена актуальность, ожидаемый эффект, критерии включения и исключения из исследования, стадии и условия проведения, измеряемые показатели, перечень возможных осложнений или ошибок при выполнении хирургической операции и пути их устранения, методы сбора данных.
Клиническая апробация. По разработанной методике в ноябре 2018 г. на базе РНПЦ травматологии и ортопедии прооперирована пациентка Д. 1993 года рождения (история болезни №7531, нейрохирургическое отделение №1 РНПЦ травматологии и ортопедии) с диагнозом «Спон-дилолистез L5 позвонка II ст., состояние после хирургического лечения в 2011, 2013 и в феврале 2018 г. Псевдоартроз в сегменте L5-S1. Стойкая люмбалгия». В октябре 2018 г. в РНПЦ травматологии и ортопедии она обратилась в связи с усилением болей в спине. В ходе обследования выявлен спондилолистез L5 позвонка II степени, нестабильная форма. В анамнезе: пациентка считает себя больной с 2010 г., когда появились боли в поясничном отделе позвоночника. В 2011 г. на базе РНПЦ травматологии и ортопедии оперирована двухэтапно (1-й этап - задний спондилодез
Ь5-81 с использованием транспе-дикулярного фиксатора, 2-й - передний межтеловой спондилодез Ь5-81 аутотрансплантатом). В 2013 г. в связи с сохраняющимся болевым синдромом и отсутствием сращения в сегменте Ь5-81 пациентке была выполнена «задне-боковая декомпрессия корешков спинного мозга на уровне Ь5-81 позвонков слева, перемонтаж металлоконструкции, задний спон-дилодез Ь5-81 аутотрансплантатом». В феврале 2018 г. в связи
с дискомфортом от выступающих под кожей элементов металлоконструкция была удалена, женщина была выписана.
При повторном обращении: на момент осмотра боль в спине сохраняется. Рентгеновская компьютерная томография (РКТ): в сегменте Ь5-81 костное сращение отсутствует (рис. 3). Пациентка госпитализирована. За три недели до оперативного вмешательства ей выполнена пункция костного мозга, полученный материал
перевезен в РНПЦ трансфузи-ологии и медицинских биотехнологий, где проведено выделение и наращивание МСК, в ноябре 2018 г. женщина была прооперирована: выполнена задняя стабилизация Ь4-81 транспеди-кулярным фиксатором, задний межтеловой спондилодез титановым кейджем под контролем компьютерной хирургической навигации с трансплантацией аутоло-гичных МСК.
Описание операции. Скелетиро-вание заднего опорного комплекса в сегменте Ь4-Ь5-81 и установка транспедикулярных винтов в позвонки Ь4 и Б1 проведены по общепринятой методике. Слева в сегменте Ь5-81 под контролем компьютерной хирургической навигации (КХН) фрезой, острыми ложками, кусачками, кюретками сформирован костный канал, ведущий через Б1 сегмент крестца и Ь5-Б1 межпозвонковый диск к позвонку Ь5 (рис. 4).
В сформированный канал под контролем электронно-оптического преобразователя установлен титановый кейдж, заполненный гемостатической губкой, ПОРФТ и аутологичными МСК, привезенными из РНПЦ трансфузио-логии и медицинских биотехнологий заблаговременно (рис. 5, 6). Спереди и сзади кейджа уложены фрагменты аутокости, полученные на этапе декомпрессии.
Пациентка вертикализирова-на на 2-е сутки после операции. Восстановительный период проходил без осложнений. Отмечался субъективный регресс болевого синдрома. РКТ: стояние элементов металлоконструкции корректное (рис. 7).
Первый осмотр, через 3 месяца после операции. Пациентка оценивает результат операции как
хороший; отмечает незначительный болевой синдром в поясничном отделе позвоночника и в ногах в покое и при движении. РКТ 06.02.2019 г.: формируется костный блок, стояние металлоконструкции корректное (рис. 8). Кли-нико-функциональный результат хирургического лечения оценивается как хороший.
Второй осмотр, через 6 месяцев после операции. Отвечая на вопрос о своем самочувствии, женщина говорит лишь о незначительной болезненности в области стояния металлоконструкции. РКТ 20.05.2019 г.: сформировался костный блок,
стояние металлоконструкции корректное (рис. 9). Клини-ко-функциональный результат лечения - хороший.
Таким образом, в процессе выполнения исследования выбран оптимальный имплантат в качестве носителя биомедицинского клеточного продукта, разработаны условия, способствующие адгезии, пролиферации и диффе-ренцировке клеток на матриксе, определены клинические требования к свойствам трансплантата. Путем проведения клинического испытания доказана эффективность разработанного метода аутотрансплантации МСК.
Статья поступила в редакцию 24.05.2019 г. http://innosfera.by/2019/11/spinal_surgery
■ Summary. Despite advances in spinal surgery, pseudarthrosis remains a pressing issue. In the framework of the task «Develop and implement the method of spinal fusion using autologous mesenchymal stem cells» (2017-2020), the following work was done: an bone marrow mesenchymal stem cell (MSC) autotransplant was developed; the most appropriate dose of MSC for use in biotransplant has been established (the minimum dose of MSC for a graft should be at least 300.0x103 cells per cm2); the effect of platelet rich plasma (PRP) on the proliferative activity of MSCs on the collagen sponge (addition of 5% PORFT leads to an increase in the synthesis of mRNA of the transcription factor, alkaline phosphatase and osteopontin 15.4, 1.4 and 13.2 times respectively); a method for obtaining an osteogenic biomedical cell product for biotransplant formation was developed; a program of clinical trials has been developed, on the basis of which one patient has been operated.
■ Keywords: spinal surgery, spinal fusion, pseudoarthrosis, autologous mesenchymal stem cells, biotransplant, spondylolisthesis.
■ https://doi.org/10.29235/1818-9857-2019-11-79-84
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Болтрукевич С. И. Наш опыт хирургического лечения пациентов с нестабильными травматическими повреждениями грудо-пояснич-ного отдела позвоночника с использованием внутренней транспедикулярной фиксации и деминерализированного костного матрик-са / С. И. Болтрукевич, С. Л. Чешик, В. И. Тупицын // Материалы VIII съезда травматологов-ортопедов Республики Беларусь. - Минск, 2008.С.240-242.
2. Skorb E. V. Surface Nanoarchitecturefor Bio-Applications: Self-Regulating Intelligent Interfaces / E. V. Skorb, D. V. Andreeva // Advanced Functional Materials. 2013. DOI: 10.1002/adfm.201203884.28.
3. Photocatalytic deposition of hydroxyapatite onto titanium dioxide nanotubular layer with fine tuning of layer nanoarchitecture / S. A. Ulasevich [et a l.] // Langmuir. 2016. Vol. 32.Р. 4016-4021.
4. Ripamonti U. Induction of bone formation by recombinant human osteogenic protein-1 and sintered porous hydroxyapatite in adult primate / U. Ripamonti // Plastic. Reconstr. Surg. 2001. Vol. 107. P. 977-988.
5. Плазма крови, обогащенная растворимыми факторами тромбоцитов. Получение, стандартизация, медицинское применение / Потап-нев М. П. [и др.] // Здравоохранение. 2018. №10. С. 38-44.
6. Применениеаутологичных мезенхимальных стволовых клеток для клеточной терапии пациентов с боковымамиотрофическим склерозом в Республике Беларусь / Ю. Н. Рушкевич [и др.] // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2015. №2. С. 130-136.
