CC BY
182017, том 20, №2 УДК: 617.7-007.681-089
ПРИМЕНЕНИЕ 3Б-КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В ЛЕЧЕНИИ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ГЛАЗ
Борзенок С. А.1,2, Хубецова М. Х.1, Сабурина И. Н.3,4, Гаврилова Н. А.2, Комах Ю. А.1, Тонаева Х. Д. 1, Островский Д. С.1, Ланевская Н. И.1,2, Кошелева Н. В.3, Зурина И. М.3
ФГАУ «МНТК «Микрохирургия глаза» имени академика С. Н. Федорова» Минздрава России, 127486, г. Москва, Бескудниковский бульвар, д. 59а
2ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А. И. Евдокимова» Минздрава России, 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20/1
3ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии», 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д. 8 4ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России, 125993, г. Москва, ул. Баррикадная, д.2/1
Для корреспонденции: Хубецова Мадина Хетаговна, врач-офтальмолог, аспирант ФГАУ«МНТК «Микрохирургия глаза» имени академика С. Н. Федорова», е-mail: porporina@inbox.ru
For correspondence: Madina Khubetsova, ophthalmologist, postgraduate student of The S. Fyodorov Eye Microsurgery Complex, е-mail: porporina@inbox.ru
Information about authors:
Borzenok S. A., http://orcid.org/0000-0001-9160-6240 Khubetsova M. K., http://orcid.org/0000-0002-6378-8750 Saburina I. N., http://orcid.org/0000-0003-2014-2535 Gavrilova N. A., http://orcid.org/0000-0003-0368-296X Komakh Y. A., http://orcid.org/0000-0002-6324-6062 Tonaeva K. D., http://orcid.org/0000-0002-9034-0660 Ostrovsky D. S., http://orcid.org/0000-0003-0370-7952 Lanevskaya N. I., http://orcid.org/0000-0002-3830-3985 Kosheleva N. V., http://orcid.org/0000-0002-2665-4972 Zurina I. M., http://orcid.org/0000-0002-3275-0215
РЕЗЮМЕ
Пристальное внимание исследователей направлено на изучение возможности использования 3D-клеточных сфероидов в лечении нейродегенеративных заболеваний глазного яблока. Проведено комплексное исследование 3D-клеточных сфероидов мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток лимба (ММСК). Обнаружена способность 3D-конструкций накапливать компоненты внеклеточного матрикса, а именно коллагена I, V, VI типа. Данные изменения свидетельствуют о воссоздании естественной тканевой ниши стволовых клеток. Также выявлена способность 3D-клеточных культур секретировать фактор роста нервов (ФРН) и нейротрофический фактор головного мозга (НФГМ).
Ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки, ниша стволовых клеток, фактор роста нервов, нейротрофический фактор головного мозга.
3D CELL TECHNOLOGY IN THE TREATMENT OF EYE NEURODEGENERATIVE DISEASES
Borzenok S. A. 12, Khubetsova M. K. 1, Saburina I. N.34, Gavrilova N. A. 2, Komakh Y. A. 1, Tonaeva K. D. 1, Ostrovsky D. S. 1, Lanevskaya N. I. 12, Kosheleva N. V. 3, Zurina I. M. 3
The S. Fyodorov Eye Microsurgery Complex of Health Ministry of Russia Beskudnikovsky blvd, 59a, Moscow, 127486
2The A.I. Evdokimov Moscow State Medical Dental University, Delegatskaya str., 20/1, Moscow, 127473 3Institute of General Pathology and Pathophysiology, Moscow, Russia, Baltic str., 8, Moscow, 125315 4Russian Medical Academy of Postgraduate Education Studies, Barrikadnaya str., 2/1, Moscow, 125993
SUMMARY
Special attention is directed to study the possibility of using 3D cell spheroids in the treatment of eye neurodegenerative diseases. Extensive study of 3D limbal multipotent mesenchymal stromal cells was conducted. The 3D structures was capable to accumulate extracellular matrix, exactly collagen I, V, VI types. These changes indicate the re-establishment of the natural tissue stem cell niche. Also was revealed the ability of 3D cell cultures secreting nerve growth factor (NGF) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF).
Key words: multipotent mesenchymal stem cells, stem cell niche, nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor
По современным представлениям, первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ) относится к нейродегенеративным заболеваниям [1]. Несмотря на большое многообразие современных подходов лечения, ПОУГ является одной из главных причин слепоты и инвалидности по зрению в мире, так, по данным H.A. Quigley [2], число больных глаукомой к 2020 году достигнет 79,6 миллионов.
Проблема лечения нейродегенеративных заболеваний до сих пор является труднопреодолимым препятствием. В научной литературе до сих пор не утратило свою силу предсказание Рамон и Кахаля: «.. .в конце развития родники роста и регенерации аксонов и дендритов высыхают безвозвратно. Посередине взрослости нервные пути - нечто фиксированное, законченное и неизменное. Все может погибнуть, ничто не может регенерировать. Науке будущего предписано изменить, если возможно это суровое правило» [3].
В последнее время большие надежды в лечении нейродегенеративных заболеваний возлагают на клеточную терапию. В многочисленных исследованиях показано, что лечебный эффект клеточной терапии обеспечивается выработкой разнообразных факторов роста, цитокинов, нейромедиаторов и других биологичестки активных веществ, которые осуществляют противовоспалительное и анти-апоптотическое действие [4, 5, 6]. В эксперименте in vivo была показана нейропротектекция гангли-озных клеток сетчатки трансплантированными ММСК [7, 8]. Однако в настоящее время известно, что для сохранения своих уникальных функций и секреторного потенциала стволовые клетки должны находиться в условиях специфического микроокружения. В 1978 году R. Shofield выдвинул концепцию ниши стволовых клеток, согласно которой стволовые клетки при выходе из ниши подвергаются дифференцировке. Чем дольше клетка находится вне ниши, тем больше вероятность дифференцировки в клетки-предшественники [9]. Сформированные сфероиды ММСК сохраняют и поддерживают недифференцированную популяцию функциональных стволовых и прогенератор-ных клеток лимба [10].
Ниша может быть представлена одним или несколькими типами взаимодействующих между собой клеток, а также клетками вместе с внеклеточными структурами, такими как внеклеточный матрикс. Длительное время внеклеточный матрикс рассматривался исключительно с позиции поддержания ткани. Но было показано, что он играет важную роль в процессах передачи сигнала, регуляции роста и дифференцировки клеток, утрата нормального взаимодействия с матриксом, может привести к гибели клетки [11, 12].
Состав компонентов внеклеточного матрикса специфичен для каждой отдельной ткани. Так, из-
вестно, что основным внеклеточным компонентом роговицы является коллаген I, V типа, а также коллаген VI типа [13].
С учетом новых знаний о физиологии стволовых клеток активно разрабатываются подходы к созданию искусственных ниш. Одним из таких методов является 3Б-клеточное культивирование. Так, показано, что при культивировании клеток со-сочкового слоя волосяных фолликулов человека в виде сфероидов они способны заново индуцировать образование волосяных фолликулов в коже человека [14].
Однако имеющиеся в литературе данные основаны на изучении возможного применения 2Б-культуры клеток ММСК в лечение нейродегенеративных заболеваний, это обстоятельство позволило нам сформулировать цель нашего исследования.
Цель. На базе современных знаний в области клеточных технологий изучить возможность использования 30-культуры лимбальных мульти-потентных мезенхимальных стволовых клеток в лечении нейродегенеративных заболеваний глаз.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Экспериментальные исследования на тканях, выделенных из трупных донорских глаз человека, проводились в соответствии с утвержденными процедурами, законодательными и нормативно-правовыми документами, с учетом Лицензии на виды медицинской деятельности Росздравнадзо-ра № ФС-99-01-008251 от 18.02.2013, выданной ФГАУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С. Н. Федорова» Минздрава России.
Для исследования нами взяты 8 донорских глаза от 4 трупов доноров в возрасте от 29 до 65 лет, время от момента констатации биологической смерти до выделения тканевых фрагментов
- от 8,3 до 18 часов. Изолированные фрагменты лимба переносились в 25 см2 культуральные флаконы, инкубирование осуществлялось в среде ОМЕМ/Б12 (1:1) с добавлением Ь-глутамина
- 0,58 г/л, НЕРЕ8 - 10 тМ, пенициллина - 10000 ЕД/мл, стрептомицина - 10000 ЕД/мл, амфотери-цина В - 1,25 мг/мл, инсулина - 0,4 мкМ, дек-саметазона - 10 нМ (ПанЭко, Россия) и 10 об.% фетальной бычьей сыворотки (НуС1опе, США) при стандартных условиях (5% СО2, 37°С), смена среды проводилась через каждые 3 суток. При достижении монослоем клеток 80-90% конфлу-энтности осуществлялось пассирование культуры с использованием растворов Версена и 0,25% трипсина-ЭДТА (ПанЭко, Россия). Подсчет клеток при пассировании культуры проводился с использованием камеры Горяева. В экспериментальных сериях использовались культуры ММСК четвертого пассажа, достигшие 80-90% конфлуэнтности.
2017, том 20, №2
Для определения иммунофенотипа полученной культуры клеток применялся метод проточной цитофлуориметрии со следующими маркерными белками CD105, CD90, CD44, CD14, CD10, CD13, CD73, CD19 (Beckman Coulter, США).
3D-сфероиды создавали с использованием неадгезивных 256-луночных агарозных планшетов (3D Petri Dishes, Microtissue, США): I группа - посевная концентрация 107000 кл/190 мкл; II группа - 256000 клеток / 190 мл.
Полученные культуры ММСК лимба анализировались с помощью инвертированного микроскопа Olympus CKX 41 (Olympus, Япония) в проходящем свете, фазовом контрасте и темном поле.
Для иммуноцитохимического окрашивания подготовленные сфероиды инкубировали с первичными антителами к коллагену I типа, вименти-ну (1:250 Abcam, Великобритания) и коллагену V и VI типа (1:100 Santa Cruz, США), затем со вторичными антителами, конъюгированными с флу-орохромами Alexa Fluor488 и 594 (Abcam, США). Результаты оценивали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Fluo View FV10i (Olympus, Япония).
Исследования содержания нейротрофических факторов ФРН и НФГМ изучали методом ИФА на микропланшетном фотометре «Anthos» (Anthos Labtec Instruments GmbH, Австрия).
Статистическая обработка выполнялась на персональном компьютере с использованием стандартных статистических программ с вычислением средних величин (M), оценкой вероятности расхождений (m), оценкой достоверности изменений с использованием t-критерия Стьюдента. За достоверную принималась разность средних значений при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Выселение клеток из фрагментов лимба происходило через 14 дней культивирования. Первичная культура отличалась выраженной гетерогенностью, однако при пассировании культура становилась более однородной и уже после 2 пассажа была представлена в основном (более 90%) ММСК-подобными клетками.
Полученная культура клеток лимба экспрес-сировала характерные для ММСК костного мозга маркеры: CD 105 (87,77%), CD90 (99,98%), CD73 (100%), CD13 (100%), CD44 (99,86%) практически не экспрессировала маркеры гемопоэтического и лимфоцитарного ряда: CD10 (7,12%), CD14 (1,24%), CD19 (0,04%).
Использование агарозных планшетов позволило получить сфероиды из заданного количества клеток. Процесс сфероидообразования в обоих группах протекал идентично, так, уже в первые часы инкубирования клетки объединялись в
рыхлые конгломераты. По мере культивирования отмечалось постепенное уменьшение видимой площади клеточной массы сфероида, к концу 14 суток наблюдалось формирование конструкций с гладкими контурами, средний размер которых в I группе составил 127,34±15,01 мкм, во II группе -155,45±14,14. Дальнейшее культивирование, до 21 суток, в ЗБ-культуре не привело к каким-либо морфологическим изменениям сфероидов (рис. 1, 2).
Рис.1. 3D-культура ММСК, I группа, посевная концентрация клеток 107000/190 мкл, световая микроскопия, ув. 100х: A - 1 сутки; B - 7 сутки; C -14 сутки, D - 21 сутки культивирования.
Рис.2 3D культура ММСК, II группа, посевная концентрация клеток 256000/190 мкл, световая микроскопия, ув. 100х: A - 1 сутки; B - 7 сутки; C -14 сутки, D - 21 сутки культивирования.
ОБСУЖДЕНИЕ
При исследовании было выявлено, что ЗБ-культура ММСК лимба способна секретировать ФРН и НФГМ. При оценке динамики секреции нейротрофических факторов (табл.1) было установлено постепенное увеличение концентрации ФРН, причем в I группе исследования максимум наблюдался на 9 сутки, а во II группе - на 11 сутки культивирования. В дальнейшем отмечалось умеренное снижение секреции фактора, более выраженное в I группе. Аналогичная динамика секреции НФГМ была отмечена в I группе, тогда как во II
Примечание: * - различия между I и II группой статистически достоверны, р<0,05.
Таблица 1
Динамика секреции нейротрофических факторов ФРН и НФГМ ЭР-культурой ММСК аллогенных фрагментов лимба in vitro.
Период наблюдения, сутки ФРН, пг/мл НФГМ, пг/мл
I группа II группа I группа II группа
5 6500±115,47* 11420±245,2 381,28±22,2* 590,58±22,3
7 7415±127* 11760±132,9 395,34±22,6* 583±20,57
9 7615±139,5* 12190±205,2 410,55±19,08* 559,5±24,5
11 6205±199,2* 12230±201,6 400±17,16* 537,4±31,6
14 5820±363,7* 12060±252,5 390,5±26,5* 500±16,32
17 5400±227,7* 11610±126,5 381,1±19,16* 488,26±27,1
21 5100±166,6* 11230±133,7 371±17,4* 461,59±23,09
группе наблюдалось умеренное снижение секреции указанного фактора к концу периода наблюдения. Средний уровень секреции ФРН в I группе исследования, в среднем составил 6293,57±957,5 пг/ мл, а во II группе - 11785,71±389,4 пг/мл, НФГМ - 389,96±13,33 пг/мл и 531,5±49,5 пг/мл соответственно. Таким образом, секреторный потенциал ФРН и НФГМ во II группе исследования был в 1,9 и 1,3 раза больше по сравнению с I группой, что, по всей видимости, обусловлено большим количеством клеток, формирующих сфероид во II группе исследования.
Анализ данных иммуноцитохимического исследования показал накопление компонентов внеклеточного матрикса (коллагена I, V, VI типа) (рис.3) в ходе культивирования. Таким образом, можно предположить, что 30-культивирование способствует созданию искусственной ниши, обеспечивающей поддержание и сохранение уникальных свойств ММСК лимба.
ВЫВОДЫ
1. 30-культивирование способствует накоплению компонентов внеклеточного матрикса (коллагена I, V, VI типа), что свидетельствует о восстановлении ниши стволовых клеток.
2. 30-клеточная культура ММСК лимба ка-даверных глаз человека способна секретировать ФРН и НФГМ на протяжении длительного времени. Уровень секреции нейротрофических факторов прямо коррелирует с количеством клеток, образующих сфероид, так, во II группе исследования уровень ФРН и НФГМ был в 1,9 и 1,3 раза больше по сравнению с I группой.
3. 30-клеточная культура ММСК может рассматриваться как клеточный продукт, обеспечивающий безопасную и длительную нейропротекцию в лечении нейродегенеративных заболеваний органа зрения.
< ^
ф
Рис.Э. Экспрессия иммуноцитохимических
маркеров в сфероидах ММСК, посевная концентрация клеток 256000/190 мкл, 21 сутки культивирования: A,B - Коллаген VI тип (AlexaFluor 594), Коллаген V тип (AlexaFluor 488). C,D - Коллаген I тип (AlexaFluor 488), Виментин (AlexaFluor 594).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Gupta N., Yucel Y.H. Glaucoma as a neurodegenerative disease. Curr Opin Ophthalmol. 2007; 18(2):110-4. doi:10.1097/ICU.0b013e3280895aea
2. Quigley H.A., Broman A.T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 2006; 90(3):262-7.doi:10.1136/ bjo.2005.081224.
3. Cajal S.R. Degeneration and reneration of the Nervous System. New York: Hafner; 1928.
4. Gnecchi M., He H., Liang O.D., Melo L.G., Morello F., Mu H., Noiseux N., Zhang L., Pratt R.E.,
2017, том 20, №2
Ingwall J.S., Dzau V.J. Paracrine action accounts for marked protectionofischemicheart by Akt-modifiedmesenchymalstemcells. Nat. Med. 2005; 11(4):367-8. doi:10. 1038/nm0405-367.
5.Sanchez-Ramos J., Song S., Cardozo-Pelaez F., Hazzi C., Stedeford T., Willing A., Freeman T.B., Saporta S., Janssen W., Patel N., Cooper D.R., Sanberg P.R. Adult Bone Marrow Stromal Cells Differentiate into Neural Cells in Vitro. Experimental Neurology 2000; 164(2):247-56. doi:10.1006/exnr.2000.7389.
6. Crigler L., Robey R. C., Asawachaicharn A., Gaupp D., Phinney D.G. Human mesenchymal stem cell subpopulations express a variety of neuro-regulatory molecules and promote neuronal cell survival and neuritogenesis. Exp. Neurol. 2006; 198(1):54-64. doi:10.1016/j.expneurol.2005.10.029.
7. Harper M.M., Grozdanic S.D., Blits B., Kuehn M.H., Zamzow D., Buss J.E., Kardon R.H., Sakaguchi D.S. Transplantation of BDNF secreting mesenchymal stemcells provides neuroprotection in chronically hypertensiverat eyes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011; 23;52(7):4506-15. doi:10.1167/iovs.11-7346.
8. Hu Y., Tan H.B., Wang X.M., Rong H., Cui H.P., Cui H.. Bone marrow mesenchymal stem cells protect against retinal ganglion cell loss in aged rats with glaucoma. Clinical Interventions in Aging. 2013; 8: 1467-1470. doi: 10.2147/CIA.S47350.
9. Schofield R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the haemopoietic stem cell. Blood Cells. 1978; 4(1-2):7-25.
10. Кошелева Н.В., Сабурина И.Н., Зурина И.М., Горкун А.А., Борзенок С.А., Никишин Д.А., Колокольцова Т.Д., Устинова Е.Е., Репин В.С. Технология создания мультипотентных сфероидов из мезенхимных стромальных клеток лимба для репарации поврежденных тканей лимба. Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2016; 60(4):160-7.
11.Chiarugi P, Giannoni E. Anoikis: a necessary death program for anchorage-dependent cells. Biochemical pharmacology. 2008; 76(11): 1352—1364. doi:10.1016/j.bcp.2008.07.023.
12. Ishikawa F., Ushida K., Mori K., Shibanuma M. Loss of anchorage primarily induces non-apoptotic cell signaling. Cell Death & Disease. 2015; 6(1): e1619. doi:10.1038/cddis.2014.583.
13. Y. M. Michelacci Collagens and proteoglycans of the corneal extracellular matrix. Brarzilian Journal of Medical and Biological Research. 2003; 36(8):1037-46. doi:10.1590/s0100-879x2003000800009
14. Higgins C.A., Chen J. C., Cerise J. E., Christiano A. M. Microenvironmental reprogramming by three-dimensional culture enables dermal papilla cells to induce de novo human hair-follicle growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2013; 110(49): 19679-88. doi:10.1073/pnas.1309970110
REFERENCES
1. Gupta N., Yücel Y.H. Glaucoma as a neurodegenerative disease. Curr Opin Ophthalmol. 2007; 18(2):110-4. doi:10.1097/ICU.0b013e3280895aea
2. Quigley H.A., Broman A.T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 2006; 90(3):262-7.doi:10.1136/ bjo.2005.081224.
3. Cajal S.R. Degeneration and reneration of the Nervous System. New York: Hafner; 1928.
4. Gnecchi M., He H., Liang O.D., Melo L.G., Morello F., Mu H., Noiseux N., Zhang L., Pratt R.E., Ingwall J.S., Dzau V.J. Paracrine action accounts for marked protectionofischemicheart by Akt-modifiedmesenchymalstemcells. Nat. Med. 2005; 11(4):367-8. doi:10. 1038/nm0405-367.
5. Sanchez-Ramos J., Song S., Cardozo-Pelaez F., Hazzi C., Stedeford T., Willing A., Freeman T.B., Saporta S., Janssen W., Patel N., Cooper D.R., Sanberg P.R. Adult Bone Marrow Stromal Cells Differentiate into Neural Cells in Vitro. Experimental Neurology 2000; 164(2):247-56. doi:10.1006/exnr.2000.7389.
6. Crigler L., Robey R. C., Asawachaicharn A., Gaupp D., Phinney D.G. Human mesenchymal stem cell subpopulations express a variety of neuro-regulatory molecules and promote neuronal cell survival and neuritogenesis. Exp. Neurol. 2006; 198(1):54-64. doi:10.1016/j.expneurol.2005.10.029.
7. Harper M.M., Grozdanic S.D., Blits B., Kuehn M.H., Zamzow D., Buss J.E., Kardon R.H., Sakaguchi D.S. Transplantation of BDNF secreting mesenchymal stemcells provides neuroprotection in chronically hypertensiverat eyes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011; 23;52(7):4506-15. doi:10.1167/iovs.11-7346.
8. Hu Y., Tan H.B., Wang X.M., Rong H., Cui
H.P., Cui H.. Bone marrow mesenchymal stem cells protect against retinal ganglion cell loss in aged rats with glaucoma. Clinical Interventions in Aging. 2013; 8: 1467-1470. doi: 10.2147/CIA.S47350.
9. Schofield R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the haemopoietic stem cell. Blood Cells. 1978; 4(1-2):7-25.
10. Kosheleva N.V., Saburina I.N., Zurina
I.M., Gorcun A.A., Borzenok S.A., Nikishin D.A., Kolokoltsova T.D., Ustinova E.E., Repin V.S. The technology of obtaining multipotent spheroids from limbal mesenchymal stromal cells for reparation of injured eye tissues. Patologicheskaya fiziologiya i eksperimental'naya terapiya. 2016; 60(4):160-7. (In Russian).
11. Chiarugi P, Giannoni E. Anoikis: a necessary death program for anchorage-dependent cells. Biochemical pharmacology. 2008; 76(11): 1352—1364. doi:10.1016/j.bcp.2008.07.023.
12. Ishikawa F., Ushida K., Mori K., Shibanuma M. Loss of anchorage primarily induces non-apoptotic
cell signaling. Cell Death & Disease. 2015; 6(1): e1619. doi:10.1038/cddis.2014.583.
13. Y. M. Michelacci Collagens and proteoglycans of the corneal extracellular matrix. Brarzilian Journal of Medical and Biological Research. 2003; 36(8):1037-46. doi:10.1590/s0100-879x2003000800009
14. Higgins C.A., Chen J. C., Cerise J. E., Christiano A. M. Microenvironmental reprogramming by three-dimensional culture enables dermal papilla cells to induce de novo human hair-follicle growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2013; 110(49): 19679-88. doi:10.1073/pnas.1309970110
