CC BY
42
▲1
5щ
Неврология
V. ДЕМИЕЛИНИЗИРУЮШИЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ И НЕЙРОИНФЕ1ШИИ
УДК: 616.832-004.2:577.2 Код специальности ВАК: 14.01.11; 14.03.09
ПРЕЗЕНТАЦИЯ В-КЛЕТКАМИ АУТОАНТИГЕНОВ ПРИ РАССЕЯННОМ СКЛЕРОЗЕ Н.В. Сурсякова1, Е.М. Куклина2, Т.В. Байдина1,
1ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет им. акад. Е.А. Вагнера»,
2ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук», г. Пермь
Дата поступления 14.06.2017
Сурсякова Надежда Владимировна - e-maii: [email protected]
Исследована способность В-клеток пациентов с рассеянным склерозом при презентации антигенов in vitro вызывать дифференцировку аутологичных CD4+Т-лимфоцитов в Th17 и Treg. По данным, полученным ex vivo, достоверных различий в уровне Th17 и Treg у здоровых доноров и пациентов с рассеянным склерозом не обнаружено. Выявлено, что у здоровых доноров презентация антигенов В-клетками приводит к преимущественному развитию Treg. У пациентов с рассеянным склерозом повышается дифференцировка CD4+Т-лимфоцитов в Th17 при презентации В-клетками аутоантигена. Предложен новый механизм индукции и прогрессии рассеянного склероза.
Ключевые слова: В-клетки, рассеянный склероз, антигенпрезентация, Th17, Treg.
The ability of patients with multiple sclerosis B-cells in the presentation of antigens in vitro to induce differentiation of autologous CD4+T-lymphocytes in Th17 and Treg was studied. According to the ex vivo data, there were no significant differences in the level of Th17 and Treg in healthy donors and patients with multiple sclerosis. It was found that the presentation of antigens by healthy donors' B cells leads to the predominant development of Treg. The differentiation of CD4+T-lymphocytes in Th17 is increased when the autoantigen is presented by B cells of patients with multiple sclerosis. A new mechanism for the induction and progression of multiple sclerosis has been suggested.
Key words: B cells, multiple sclerosis, antigen presentation, Th17, Treg.
Введение
В изучении патогенеза рассеянного склероза важнейшим направлением является поиск терапевтических мишеней, наиболее актуальными из которых являются субпопуляции лимфоцитов [1]. Особенно интересны две Т-клеточные субпопуляции: Т-лимфоциты, продуцирующие интерлейкин 17 (Th17), и регуляторные Т-клетки (Treg), а также В-клетки. Th17 рассматриваются как ключевая Т-клеточная субпопуляция, провоцирующая воспаление Th17 [2] наряду с Th1. Клетки Treg, напротив, подавляют развитие воспаления, а сдвиг баланса Th17/Treg в направлении Th17 приводит к срыву иммунной толерантности, что вызывает развитие аутоиммунных процессов [3, 4]. В-клетки также участвуют в развитии рассеянного склероза [5, 6], но главным образом не за счет продукции антител, а за счет реализации альтернативной функции - презентации антигенов Т-лимфоцитами, инициирующей дифференцировку последних. По одним данным, В-зависимая презентация антигена может вызывать анергию Т-лимфоцитов или преимущественное развитие их в Treg [7], по другим - приводить к дифференцировке наивных Т-лимфоцитов в Th17 [8]. Таким образом, антигенпре-зентирующая активность В-лимфоцитов может быть причиной сдвига баланса Th17/Treg и служить механизмом, участвующим в индукции и прогрессии рассеянного склероза.
Цель исследования: оценить способность В-клеток пациентов с рассеянным склерозом при презентации антигенов in vitro вызывать дифференцировку аутологичных CD4+Т-лимфоцитов в Th17 и Treg.
Материал и методы
При проведении работы использовался дизайн поперечного исследования. В исследовании приняли участие 11 пациентов (6 мужчин и 5 женщин) с рассеянным склерозом и
9 здоровых доноров, сопоставимых по полу и возрасту. Критерии включения для пациентов были следующие: достоверно установленный диагноз рассеянного склероза согласно критериям Макдональда (2010 г.), ремиттирующий рецидивирующий тип течения, степень инвалидизации по шкале EDSS до 6 баллов, отсутствие обострения, воспалительных заболеваний и беременности на момент исследования. Критерии включения для контрольной группы: отсутствие неврологического дефицита, а также воспалительных и аутоиммунных заболеваний на момент исследования. Средний возраст пациентов составил 35,2±5,8 года. Уровень инвалидизации по шкале EDSS составил 3,2±1 балл. Все пациенты принимали глатирамера ацетат (оригинальный Копаксон) не менее 6 месяцев до исследования. Глатирамера ацетат - это иммуномодулирующий препарат, по химическому строению сходный с основным белком миелина. В день проведения клинического обследования у пациентов и здоровых доноров были взяты пробы крови для исследования клеток.
Методом проточной цитометрии ex vivo было оценено содержание в периферической крови Th17 и Treg, а также развитие данных Т-клеточных субпопуляций в ответ на экзо- и аутоантигены, представленные аутологичными В-лимфо-цитами в совместной культуре. Для выделения мононукле-арных клеток гепаринизированную венозную кровь центрифугировали в градиенте плотности фиколла-верографина (1,077 г/см3). Из полученной суспензии далее получали В-лимфоциты ^19+-клетки) - фракционированием на им-муномагнитных частицах, с помощью соответствующих систем для выделения. В-лимфоциты инкубировали далее с экзогенным антигеном, столбнячным анатоксином (Tetanus toxoid, TT, 5 мкг/мл) или с аутоантигеном, ассоциированным
Неврология
NK
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
с рассеянным склерозом, миелин-олигодендроцитарным гликопротеином (Myelin oligodendrocyte glycoprotein, MOG, 5 мкг/мл) в течение 12 ч, после чего отмывали от несвязавше-гося антигена и культивировали совместно с аутологичными мононуклеарными клетками как источниками CD4+T-лимфоцитов в соотношении 1:10 в течение 48 ч. По окончании культивирования оценивали содержание Th17 и Treg - по экспрессии ключевых транскрипционных факторов и маркеров данных субпопуляций, RORyt и FoxP3, соответственно, с помощью моноклональных антител: анти-CD4*PE/Cy5 (eBioscience), анти-RORy^PE (Biolegend), анти^хР3*РЕ (eBioscience), и набора фиксирующего/пермеабилизирую-щего буферов для оценки внутриклеточных молекул (Biolegend)). Аналогично определяли содержание Th17 и Treg в периферической крови, а также процент В-лимфоцитов, экспрессирующих IL-17. Обработка данных проводилась с помощью программы STATISTICA 10 с использованием параметрических методов (вычисление t-критерия).
Результаты и их обсуждение
Оценка уровня Th17 и Treg ex vivo не выявила статистически значимых отличий у пациентов с рассеянным склерозом по сравнению со здоровыми донорами, хотя для Th17 клеток наблюдалась тенденция к повышению. Следует отметить, что данные литературы свидетельствуют о повышении содержания лимфоцитов субпопуляции Th17 при рассеянном склерозе [9]. Отсутствие достоверных отличий в нашем исследовании связано, по-видимому, с тем, что пациенты принимали глатирамера ацетат, сходный по химическому строению с основным белком миелина (Myelin basic protein, MBP): несмотря на то, что теоретически основная роль данного препарата заключается в конкуренции с MBP за связывание с MBP-специфичными лимфоидными клетками. Есть работы, в которых показано, что он способен промотировать дифференцировку Treg и усиливать их супрессивную активность [10] и в то же время снижать уровень и активность Th17 [11].
В эксперименте in vitro при презентации В-лимфоцитами облигатного антигена у здоровых доноров было выявлено достоверное увеличение содержания Treg (процент CD4+Foxp3+-клеток в популяции CD4+Т-лимфоцитов у здоровых доноров: 2,06±0,98 - для столбнячного анатоксина, 2,04±1,31 - для проб без антигена; р=0,03). Эти данные сопоставимы с концепцией, согласно которой В-зависимая презентация облигатного антигена приводит к развитию из наивных Т-лимфоцитов преимущественно в Treg [7]. У пациентов с рассеянным склерозом повышения уровня Treg в ответ на облигатный антиген не выявлено. В то же время, в ответ на аутоантиген MOG наблюдалось статистически значимое усиление дифференцировки ^^-лимфоцитов (процент CD4+RORyt+-клеток в популяции CD4+Т-лимфоцитов у пациентов с рассеянным склерозом: 2,5±1,44 - для MOG, 2,04±1,31 - для проб без антигена; р=0,02). Таким образом, несмотря на потенциальную способность В-клеток в норме при презентации антигена стимулировать преимущественное развитие Treg, в случае рассеянного склероза при презентации аутоантигена этого не происходит, и баланс, напротив, сдвигается в сторону Th17.
Важно отметить, что в эксперименте ex vivo мы показали экспрессию В-лимфоцитами IL-17, повышенную у пациентов с рассеянным склерозом (процент CD19+RORyt+-
клеток в популяции CD4+Т-лимфоцитов: 7,02±1,42 - для больных рассеянным склерозом; 4,23±2,72 - для здоровых доноров, р=0,004). Таким образом, В-лимфоциты могут вносить вклад в повышение уровня IL-17 при рассеянном склерозе двумя путями: за счет индукции дифференцировки Th17 в ответ на аутоантигены и за счет собственной продукции данного цитокина.
Выводы
У пациентов с рассеянным склерозом в стадии ремиссии отмечалась тенденция к повышению содержания клеток Th17 в периферической крови в сравнении со здоровыми донорами. В исследованиях in vitro презентация В-клетками аутоантигена, ассоциированного с рассеянным склерозом, MOG, приводила к преимущественному развитию CD4+Т-лимфоцитов в Th17, в отличие от здоровых доноров, у которых презентация антигенов вызывала развитие наивных Т-лимфоцитов в Treg. Таким образом, В-зависимая презентация аутоантигена может быть одним из факторов патогенеза, участвующих в индукции и прогрессии нейровоспаления при рассеянном склерозе.
ЛИТЕРАТУРА
1. Куклина Е.М., Байдина Т.В., Данченко И.Ю., Некрасова И.В. Семафорин Sema4D в иммунной системе при рассеянном склерозе. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2014. Т. 157. № 2. С. 198-201.
KuklinaE.M., Baidina T.V., DanchenkoI. YU., NekrasovaI.V. SemaforinSema4D vimmunnoyisisteme prirasseyannom sclerose. Byulleten' experemental'noyibi-ologii I mediciny. 2014. T. 154.№ 2. S. 198-201.
2. Jadidi-Niaragh F., Mirshafiey A. Th17 Cell, the New Player of neurolnflammatory Process in Multiple Sclerosis. Scand J Immunol. 2011 T. 74. № 1. P. 1-13.
3. Liu Y., You C., Zhang Z., Zhang J., Yan H. Roles of Treg/Th17 Cell Imbalance and Neuronal Damage in the Visual Dysfunction Observed in Experimental Autoimmune Optic Neuritis Chronologically. Neuromolecular Med. 2015. T. 17. № 4. P. 391-403.
4. Buc M. Role of Regulatory T Cells in Pathogenesis and Biological Therapy of Multiple Sclerosis. Mediators of Inflammation. 2013. PMC Web.
5. Rivera A., Chen C.C., Ron N., Dougherty J.P., Ron Y. Role of B cells as antigen-presenting cells in vivo revisited: antigen-specific B cells are essential for T cell expansion in lymph nodes and for systemic T cell responses to low antigen concentrations. Int Immunol. 2001. T. 13. № 12. P. 1583-1593.
6. Michel L., Touil H., Pikor N.B., Gommerman J.L., Prat A., Bar-Or A. B Cells in the Multiple Sclerosis Central Nervous System: Trafficking and Contribution to CNS-Compartmentalized Inflammation. Frontiers in Immunology. 2015. T. 6. P. 68.
7. Morlacchi S., Soldani C., Viola A., Sarukhan A. Self-antigen presentation by mouse B cells results in regulatory T-cell induction rather than anergy or clonal deletion. Blood. 2011. T. 118. № 4. P. 984-991.
8. Molnarfi N., Schulze-Topphoff U., Weber M.S., Patarroyo J.C., Prod'homme T. et al. MHC class II-dependent B cell APC function is required for induction of CNS autoimmunity independent of myelin-specific antibodies. J Exp Med. 2013. T. 210. № 13. P. 2921-2937.
9. Jones A.P., Kermode A.G., Lucas R.M., Carroll W.M., Nolan D., Hart P.H. Circulating immune cells in multiple sclerosis. Clin Exp Immunol. 2017. T. 187. № 2. P. 193-203.
10. Haas J., Korporal M., Balint B., Fritzsching B., Schwarz A., Wildemann B. Glatiramer acetate improves regulatory T-cell function by expansion of naive CD4(+)CD25(+)FOXP3(+)CD31(+) T-cells in patients with multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 2009. Т. 216. № 1-2. P. 113-117.
11. Begum-Haque S., Sharma A., Kasper I.R., Foureau D.M., Mielcarz D.W., Haque A., Kasper L.H. Downregulation of IL-17 and IL-6 in the central nervous system by glatiramer acetate in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 2008. T. 204. № 1-2. P. 58-65. EJj
