CC BY
9
УДК 619:612.616.31:636.082.451
ПРЕПАРАТ ПОЛОВЫХ ФЕРОМОНОВ БАРАНА ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ У ОВЕЦ
СЕИН ОБ.,
доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВО Курская ГСХА, тел. 53-35-25, ЕРШОВ Р.А.,
кандидат биологических наук, старший преподаватель, ФГБОУ ВО Курская ГСХА, тел. 53-35-25. СУББОТИНА Н.Н.,
аспирант кафедры хирургии и терапии, ФГБОУ ВО Курская ГСХА, тел. 53-35-25.
Реферат. В статье описывается оригинальная технология получения препарата половых феромонов барана, разработанная авторами (патент РФ № 2623085. - 2017 г.), которая включает основные этапы: гомогенизацию семенников, добавление протосубтилина Твин-80, инкубирование при 37-39 С, цетрифугирование при 6000 об/мин до разделения на две фракции, добавление в надосадочную жидкость мочи половозрелого барана, перегонку с водяным паром. Полученный препарат прошел проверку на токсичность с использованием лабораторных животных и овец, которая подтвердила его безвредность. Использование препарата путем аэрозольного распыления в дозе 0,5 мл/гол оказывало стимулирующее влияние на половую функцию овец. По сравнению с контрольными животными у овец опытной группы наступало значительно раньше половое созревание. В крови содержалось больше половых гормонов - эстрадиола17р и прогестерона. Гистологический анализ репродуктивных органов показал, что у овец, подвергавшихся стимуляции, были достоверно выше (р<0,05) показатели толщины слизистой оболочки матки (1,41±0,05 мм), высота эпителия маточных желез (16,0±0,31 мкм), диаметр просвета маточных желез (9,2±0,15 мкм) по сравнению с контрольными животными. В то же время выявленные параметры высоты покровного эпителия яйцепроводов, высоты покровного эпителия рогов матки, количества срезов маточных желез, толщины покровного эпителия влагалища достоверных (р>0,05) различий не имели. Изготовленный препарат половых феромонов рекомендуется к широкому применению в практике овцеводства и ветеринарной медицины.
Ключевые слова: овцы, половые феромоны, стимуляция, эстрадиол-17р, прогестерон, кровь, гистологическая структура, матка, яйцепроводы.
SEIN O.B.,
Doctor of Biological Sciences, Professor, Kursk State Agricultural Academy, tel. 53-35-25, seina.v@yandex.ru.
ERSHOV R.A.,
candidate of biological sciences, senior lecturer, Kursk State Agricultural Academy, tel. 53-35-25. SUBBOTINA N.N.,
Postgraduate student of the Department of Surgery and Therapy, Kursk State Agricultural Academy, tel. 53-35-25.
Essay. The article describes the original technology for obtaining the preparation of sexual phero-mones of sheep developed by the authors (RF patent No. 2623085. - 2017), which includes the main stages: homogenization of seeds, addition of protosubtilin Twin-80, incubation at 37-390 C, cetrifugation at 6000 rpm before separation into two fractions, addition of urine of mature sheep to the supernatant, distillation with water vapor. The resulting drug was tested for toxicity with the use of laboratory animals and sheep, which confirmed its harmlessness. The use of the drug by aerosol spraying at a dose of 0.5 ml / head had a stimulating effect on the sexual function of sheep. Compared with the control animals, the sheep of the experimental group had much earlier puberty. The blood con-
tained more sex hormones-estradiol17p and progesterone. Histological analysis of the reproductive organs showed that the sheep subjected to stimulation had significantly higher (p<0,05) indicators of the thickness of the uterine mucosa (1.41±0.05 mm), the height of the epithelium of the fallopian glands (16.0±0.31 microns), the diameter of the lumen of the fallopian glands (9.2±0.15 microns) compared with the control animals. At the same time, the parameters of the height of the surface epithelium of iceproof, the height of the integumentary epithelium of the uterine horns, the number of slices of the uterine glands, the epithelial thickness of the vaginal epithelium significant (p>0,05) differences were not. The manufactured preparation of sex pheromones is recommended for wide application in the practice of sheep breeding and veterinary medicine.
Keywords: sheep, sex pheromones, stimulation, estradiol-17p, progesterone, blood, histological structure, uterus, oviducts.
Введение. Половые феромоны, являясь ат-трактантами, выделяемыми животными всех видов, в том числе домашними, имеют важное значение не только в химической коммуникации, но и в регуляции половой функции особей противоположного пола. В частности половые феромоны самцов способны привлекать самок, повышать у них половую активность, оплодотворяемость и воспроизводительность [1, 2].
Учитывая биологические свойства половых феромонов учеными разрабатываются способы получения препаратов феромонов как натуральной так и синтетической природы. Например, известен способ получения феромонов из мочи быков [3], однако он сложный, требует специального оборудования, дефицитных химических реактивов и квалифицированного обеспечения. Существуют способы получения половых феромонов хряка из тканей семенников и экскретов половозрелых хряков [4, 5]. В то же время эти способы не могут использоваться для изготовления половых феромонов других видов животных.
Известен способ получения препарата натуральных половых феромонов самцов [6], включающий механическое измельчение семенников, их гомогенизацию, инкубирование, центрифугирование, смешивание с мочой и перегонку с водяным паром. При этом в гомо-генизат вносят фермент протосубтилин, после чего смесь инкубируют при 37-390 С. Полученную массу смешивают с мочой самца и подвергают перегонке с водяным паром, конденсат является феромональным препаратом со слабым специфическим запахом.
Существует способ получения препарата, включающий соединения стероидной природы 2а-метил-5а-андрост-16-ен-3-он, который используют в качестве обонятельного стимулятора воспроизводительной функции свиней и коров [7]. Недостатком этого препарата яв-
ляется то, что он является синтетическим аналогом половых феромонов самцов и не содержит всех компонентов, свойственных натуральным половым феромонам. В этой связи препарат имеет относительно низкую биологическую активность.
Известны препараты «Суидор» (Германия) и СтО-1 (Россия), которые являются синтетическими аналогами половых феромонов хряка и не используются для других видов животных.
Краткий анализ существующих препаратов половых феромонов и способов их получения свидетельствуют о том, что все они имеют определенные недостатки, рассчитаны только для использования на конкретных видах животных, и это ограничивает их применение в практике животноводства и ветеринарной медицины.
Цель исследования. Принимая во внимание вышеизложенное, целью настоящей работы являлась апробация препарата половых феромонов барана, полученного по разработанной нами технологии (патент РФ №2623085.-2017 г.)
Материал и методика исследования. Препарат половых феромонов барана изготавливался в условиях научно-исследовательской лаборатории кафедры хирургии и терапии ФГБОУ ВО Курская ГСХА.
Разработанный способ получения препарата половых феромонов барана отличается от известных способов тем, что при его выполнении в технологический процесс включали полисорбат Твин-80, который является эмульгатором и солюбилизатором жиров и эфирных масел, что способствует более активному переходу феромонов в раствор.
Технологическая схема получения препарата половых феромонов барана представлена на рисунке 1.
Инкубирование при 37-39С в течение 60 мин Центрифугирование смеси при 6000 об/мин до разделения на 2 фракции Смешивание надосадочной жидкости с мочой барана
Перегонка водяным паром Препарат половых феромонов барана Проверка на токсичность и безвредность
Рисунок 1 - Схема технологического процесса получения препарата половых феромонов барана
Для изготовления препарата половых феромонов барана в качестве исходного сырья нами были использованы семенники и моча половозрелых баранов. Материал получали после убоя животных.
Отобранные семенники освобождали от соединительной ткани, подвергали грубому измельчению на мясорубке, а затем в гомоге-незаторе до однородной массы. В полученную массу вносили протосубтилин Г3х23 636-79 в количестве 1,0-1,5% и полисорбат Твин-80 в количестве 0,5-1,0% от общей массы исходного сырья. Смесь помещали в термостат при температуре 37-390 С и инкубировали в течение 50-60 мин. Затем смесь центрифугировали до разделения на две фракции. Отделяли на достаточную жидкость и вносили в нее мочу в соотношении 1,0:3,0-3,5, перемешивали и перегоняли с водяным паром в установке разработанной нами конструкции.
Соотношение используемых нами компонентов подбирали опытным путем. Для этого применяли различные дозировки. Было установлено, что при увеличении количества мочи концентрация препарата уменьшалась на 1015%. При уменьшении количества мочи выход препарата был на 50-55% меньше по сравнению с оптимальным соотношением компонентов. Режим инкубации также подбирали
опытным путем, при температуре ниже 370 С и выше 390 С отмечалось снижение ферментативной активности протосубтилина и действие полисорбата. Это приводило к тому, что процесс гидролиза осуществлялся недостаточно полно, и выход препарата уменьшался. Сокращение инкубаций (менее 50 мин) также сопровождалось снижением выхода препарата на 10-15%, что можно объяснить не полным завершением реакции. В то же время увеличивать время инкубации (более 60 мин) не целесообразно, так как процесс гидролиза к этому времени заканчивается полностью и выход феромонов в раствор прекращается.
Полученный после перегонки с водяным паром препарат половых феромонов барана представлял собой жидкость без оттенков со слабовыраженным запахом. Проверку опытных серий препарата на токсичность и безвредность проводили на кроликах и овцах. Для этого использовали специальные аэрозольные камеры, в которые помещали подопытных животных и распыляли препарат с использованием аэрозольного генератора САГ-2. В ходе проверки было установлено, что полученный препарат половых феромонов даже при многократном превышении оптимальной дозы был безвреден.
Рисунок 2 - Стимуляция овец препаратом половых феромонов барана
Биологическую активность препарата определяли на неполовозрелых овцах, содержащихся в условиях ветеринарной клиники Курской государственной сельскохозяйственной академии имени И.И. Иванова. Было отобрано две группы ярок-аналогов по 7 голов в каждой. Животных 1 опытной группы обрабатывали изготовленным препаратом в дозе 0,5 мл/гол. один раз в день до проявления половой охоты. Распыляли препарат на уровне головы животного с использованием пульверизатора (рисунок 2). Животные 2 группы являлись контрольными, их обрабатывали дистиллированной водой.
Во время проведения эксперимента проводили наблюдение за подопытными животными, учитывали характер поведенческих реакций, общее состояние, аппетит. До начала эксперимента через 7 и 14 дней у животных брали кровь, в которой определяли содержание эстра-диола-17р и прогестерона с использованием иммуноферментного метода. В конце эксперимента был проведен убой подопытных животных, во время которого отбирали половые органы для морфологического анализа. Изготовление гистологических препаратов осуществляли по общепринятой схеме: фиксация материала, обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации, заливка в парафин, приготовление парафиновых срезов на санном микротоме, окрашивание препаратов (Д.С. Саркисов и др., 1996). Для фиксации материала применяли 10% нейтральный формалин. Окрашивали гистосре-зы гематоксилин-эозином. Для измерения структур матки и яичников применяли винтовой окуляр-микрометр. С использованием микроскопа Penta Viev 44348 делали фотоснимки.
Результаты исследования. Проведенные наблюдения показали, что половое созревание у ярок, подвергавшихся стимуляции изготовленным препаратом наступало в период первых 1014 дней после начала обработки феромонами. У контрольных животных наступление половой зрелости значительно задерживалось (30-45 дней).
Исследования половых гормонов в крови подопытных животных показало, что у овец 1 опытной группы их содержание было выше по сравнению с контрольными животными (рисунок 3). При этом изменения эстрадиола-17р имели достоверный характер (р<0,05).
Гистологический анализ репродуктивных органов свидетельствует о том (таблица 1), что у овец, подвергавшихся стимуляции препаратом половых феромонов, они были более развитыми по сравнению с контролем. Так толщина слизистой оболочки (1,41±0,05 мм), высота эпителия маточных желез (16,0±0,31 мкм), диаметр просвета маточных желез (9,2±0,15 мкм) были достоверно (р<0,5) выше по сравнению с контрольными животными (1,22±0,04 мм; 13,3±0,24 мкм; 7,4±0,14 мкм). В то же время выявленные параметры высоты покровного эпителия яйцепрово-дов (17,7±0,30 - 18,4±0,39 мкм), высота покровного эпителия рогов матки (27,4±2,06 -30,0±2,17 мкм), количество срезов маточных желез (72,4±4,0 - 77,5±4,4), толщина мышечной оболочки (0,70±0,09 - 0,74±0,07 мм) и толщина покровного эпителия влагалища (15,7±0,36 -15,8±0,41 мкм) достоверного различия (р>0,05) не имели.
са г-
I
ч §
&
67,4
до стимуляции
на 15 день после стимуляции
70
67,4
о
а и
я о а
<и н о <и и
о
ж
до стимуляции
- 1 опытная группа
- 2 контрольная группа
55,5
51,0 53,4 в ■
на 15 день после стимуляции
0
Рисунок 3 - Содержание эстрадиола-17р и прогестерона в крови овец, подвергавшихся стимуляции препаратом половых феромонов барана
Таблица 1 - Гистологическая структура репродуктивных органов у овец, подвергавшихся стимуляции препаратом половых феромонов барана_
Показатели Группа
1 опытная 2 контрольная Р
Яйцепроводы высота покровного эпителия, мкм 18,4±0,32 17,7±0,30 >0, 05
Рога матки высота покровного эпителия, мкм 30,0±2,17 27,4±2,06 >0, 05
толщина слизистой оболочки, мм 1,41±0,05 1,22±0,04 <0, 05
количество срезов маточных желез, в 1 поле зрения микроскопа 77,5±4,4 72,4±4,0 >0, 05
высота эпителия маточных желез, мкм 16,0±0,31 13,4±0,24 <0, 05
диаметр просвета маточных желез, мкм 9,2±0,15 7,4±0,14 <0, 05
толщина мышечной оболочки, мм 0,74±0,07 0,70±0,09 >0, 05
Влагалище толщина покровного эпителия, мкм 15,7±0,36 15,8±0,41 >0, 05
Выводы. Разработанный способ получения препарата половых феромонов барана не сложный в техническом выполнении, не требует дорогостоящего оборудования и дефицитных реактивов. Способ можно использовать в условиях ветеринарных лабораторий.
Полученный препарат половых феромонов нетоксичный и в 5-7 кратном превышении оптимальной дозировки не оказывает отрицательного влияния на организм лабораторных
животных и овец. Препарат обладает выраженным стимулирующим действием на репродуктивную функцию овец. После его применения у овец повышается гормональная активность яичников, наступает раньше половое созревание, в репродуктивных органах происходят морфологические изменения, свидетельствующие о повышенной их функциональной активности.
Препарат можно рекомендовать к широко- теринарной медицины. му применению в практике овцеводства и ве-
Список используемых источников
1. Соколов В.Е., Зенкевич Э.П., Володин В.А. Влияние искусственного полового феромона хряка на воспроизводство свиней в условиях промышленной технологии // Химическая коммуникация животных. - М.: Наука, 1986. - С.403 - 408.
2. Улиханова Т.Л. Половые феромоны и их значение в воспроизводительной функции свиней // Сб. научных трудов Всероссийского НИИ животноводства. - Дубровицы, 1990. - С. 9193.
3. Кононов В.П., Нурахметов Ж.Ж. Способ получения половых феромонов. Патент РФ на изобретение №1666102. - 1991.
4. Сеин О.Б. и др. Способ получения препарата натуральных половых феромонов хряка. Патент РФ на изобретение №2034521. - 1995.
5. Сеин О.Б. и др. Способ получения препарата натуральных половых феромонов хряка. Патент РФ на изобретение №2655842. - 2016.
6. Фурман Ю.В. Способ получения натуральных половых феромонов самцов. Патент РФ на изобретение №2159597. - 1999.
7. Зинкевич Э.П. Феромоны и механизмы химической коммуникации млекопитающих. Дисс. докт. хим. наук. - М., 2003.
8. Сеин О.Б. и др. Способ получения препарата натуральных половых феромонов самцов домашних животных. Патент РФ на изобретение №2623085. - 2017.
9. Саркисов Д.С., Перов Ю.Л. Микроскопическая техника: руководство для врачей и лаборантов. - М.: Медицина, 1996. - 544 с.
10. Рокитский П.Ф. Биологическая статистика. - Минск: Высшая школа, 1973. - 320 с.
Spisok ispoFzuemy'x istochnikov
1. Sokolov V.E., Zenkevich E.P., Volodin V.A. Vliyanie iskusstvennogo polovogo feromona xryaka na vosproizvodstvo svinej v usloviyax promy'shlennoj texnologii // Ximicheskaya kommunikaciya zhivotny'x. - M.: Nauka, 1986. - S.403 - 408.
2. Ulixanova T.L. Polovy'e feromony' i ix znachenie v vosproizvoditel'noj funkcii svinej // Sb. nauchny'x trudov Vserossijskogo NII zhivotnovodstva. - Dubrovicy, 1990. - S. 91-93.
3. Kononov V.P., Nuraxmetov Zh.Zh. Sposob polucheniya polovy'x feromonov. Patent RF na izobretenie №1666102. - 1991.
4. Sein O.B. i dr. Sposob polucheniya preparata natural'ny'x polovy'x feromonov xryaka. Patent RF na izobretenie №2034521. - 1995.
5. Sein O.B. i dr. Sposob polucheniya preparata natural'ny'x polovy'x feromonov xryaka. Patent RF na izobretenie №2655842. - 2016.
6. Furman Yu.V. Sposob polucheniya natural'ny'x polovy'x feromonov samczov. Patent RF na izobretenie №2159597. - 1999.
7. Zinkevich E'.P. Feromony' i mexanizmy' ximicheskoj kommunikacii mlekopitayushhix. Diss. dokt. xim. nauk. - M., 2003.
8. Sein O.B. i dr. Sposob polucheniya preparata natural'ny'x polovy'x feromonov samczov domashnix zhivotny'x. Patent RF na izobretenie №2623085. - 2017.
9. Sarkisov D.S., Perov Yu.L. Mikroskopicheskaya texnika: rukovodstvo dlya vrachej i laborantov. - M.: Medicina, 1996. - 544 s.
10. Rokitskij P.F. Biologicheskaya statistika. - Minsk: Vy'sshaya shkola, 1973. - 320 s.
