CC BY
11
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 577.151.45
Предпочтительная конформация связывания канонических субстратов бутирилхолинэстеразы непродуктивна для экотиофата
А. С. Злобин12*, А. О. Залевский12,3**, Ю. А. Мокрушина2, О. В. Карцева2, А. В. Головин1,3, И. В. Смирнов245
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет биоинженерии и биоинформатики, 119234, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 73
2Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
3Институт молекулярной медицины, Первый МГМУ им. И.М. Сеченова, 119992, Москва, ул. Трубецкая, 8, стр. 2
4Национальный исследовательский университет «Высшая школа экономики», 101000, Москва, ул. Мясницкая, 20
5Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет,
119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 3
# Эти авторы внесли равный вклад в исследование.
*E-mail: [email protected]
Поступило в редакцию 28.08.2018
Принято к печати 10.12.2018
РЕФЕРАТ Впервые на атомистическом уровне описано взаимодействие фермента бутирилхолинэстеразы с экотиофатом - популярным модельным соединением, аналогом боевых отравляющих веществ VX и VR. При помощи методов молекулярного моделирования обнаружена конкуренция между двумя конформаци-ями экотиофата в активном центре. Первая, близкая к конформации для способа связывания субстратов холинового ряда - бутирилхолина и бутирилтиохолина, - является ингибирующей, так как не способна к реакции с ферментом; вторая, реакционноспособная, обладает существенно худшей оценкой энергии связывания. Таким образом, экотиофат совмещает черты ингибиторов двух типов: конкурентного и суицидального. Данное наблюдение поможет уточнить кинетическую схему реакции для аккуратной оценки кинетических констант, что особенно важно при дизайне новых вариантов бутирилхолинэстеразы, способных к полному циклу гидролиза фосфорорганических соединений.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА бутирилхолинэстераза, КМ/ММ, метадинамика, органофосфаты, экотиофат. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ БуХЭ - бутирилхолинэстераза; ECH - экотиофат; RMSD - среднеквадратичное отклонение; КМ/ММ - гибридное, квантово-механическое/молекулярно-механическое моделирование; PAS - периферийный анионный сайт.
ВВЕДЕНИЕ
Бутирилхолинэстераза (БуХЭ) - фермент, который обладает широкой субстратной специфичностью, благодаря чему представляет значительный интерес в качестве объекта для создания антидотов против ядов на основе фосфорорганических соединений, например газов VX и VR [1, 2]. В то же время для холин-эстераз характерна чрезвычайно сложная кинетическая схема реакции, обусловленная, в том числе, наличием дополнительного периферического анионного сайта связывания лиганда (PAS). Рассмотрение
PAS для характеристического субстрата БуХЭ - бу-тирилтиохолина - увеличивает общее количество состояний до восьми [3]. Если же субстрат способен вызывать необратимую инактивацию фермента из-за образования стабильного фосфорилированного комплекса, то кинетическая схема может усложниться еще больше. Одним из таких субстратов, сочетающих и холиновый фрагмент, и возможность инактивации, является экотиофат - менее токсичный аналог боевых отравляющих веществ V-серии, который используется в качестве модельного фос-
форорганического соединения при изучении реакционной способности бутирилхолинэстеразы и ее модификаций, устойчивых к инактивации. В нашей работе взаимодействие экотиофата с БуХЭ изучено с целью оценки применимости для них кинетических схем, предложенных для бутирилтиохолина.
Мы решили использовать методы молекулярного моделирования, так как они дают атомистическое понимание происходящих событий и ранее доказали свою эффективность для понимания механизмов реакции БуХЭ с некоторыми субстратами [4] и даже для рационального изменения БуХЭ и трансформации ее в кокаингидролизирующий фермент [5].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Моделирование молекулярного докинга было проведено в пакете Autodock Vina [6]. Для докинга была выбрана структура БуХЭ PDB ID 1XLW, ковалентно конъюгированная с продуктом фосфорилирования экотиофатом - диэтилфосфатным остатком (DEP). DEP был удален, а недостающие остатки V377-D378-D379-Q380 и C66 достроены на основе структуры PDB ID 2XMD, так как структуры достаточно похожи (среднеквадратичное отклонение (RMSD), оцененное по всем тяжелым атомам, составило 0.4 Â). Структура экотиофата создана в пакете Avogadro [7]. Подготовку входных файлов и обработку результатов проводили при помощи инструментов пакета AutoDock Tools [8]. Ячейка для докинга была отцентрирована так, чтобы включать весь карман связывания. Размер ячейки составил 20 Â по всем измерениям. Для эффективного сканирования параметр «exhaustiveness» был установлен в значение 64 и проведены 20 независимых повторностей. Во время докинга фермент оставался жестким, в то время как лиганд имел все степени свободы.
Стартовые конфигурации БуХЭ c лигандом были взяты из процедуры докинга. Моделирование ме-тадинамики и обработку результатов проводили как описано ранее [9]. В качестве коллективной переменной использовали расстояние O(Ser198)-P(ECH). Потенциал метадинамики величиной 2 кДж/моль и адаптивной шириной, рассчитанной на основании диффузионного критерия по предшествующим 220 шагам, накладывался каждые 220 шагов моделирования. Для каждого варианта связывания экотиофата сделано по три независимых реплики.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Поиск положения экотиофата в структуре бути-рилхолинэстеразы человека (PBD ID 1XLW) проведен с помощью процедуры докинга. Особый интерес представляли положения экотиофата в активном центре, потенциально способные к прохождению
12
Â
га а
н
I
ф
и и га а.
run11 16
10
run6 2
run2 15
4-v
U
4*
1и
6
H .
: * л . »
4
\Ér
2
3 4 5 6 7 8 9 Расстояние от Ser198, Â
-4.5 -4.6 -4.7 -4.8
с
а
*
-4.9 *
10
-5 -5.1 -5.2 -5.3
а е н
m
Рис. 1. Результаты докинга экотиофата в связывающий карман БуХЭ. Во врезке указаны лучшие результаты из нижнего левого сегмента
реакции (состояние ES в кинетической схеме [3]). Поэтому для анализа мы выбрали две основные метрики: расстояние между кислородом каталитического Ser198 и атомом фосфора экотиофата и расстояние между центром масс оксианионного центра, образованного атомами азота остова остатков G116, G117, A199, и фосфорильным кислородом экотиофата. Вторая метрика выбрана, так как координация кислорода оксианионным центром является важной составляющей связывания и позиционирования в известных механизмах реакции [3]. Фильтрация по таким критериям позволила выделить три лучших кластера положений run6_2, run2_15, run11_16 (рис. 1). Согласно оценочной функции AutoDock Vina, положение run6_2 имеет энергию связывания на ~0.4 ккал/моль лучше, чем два других. Интересно, что такое же расположение холинового фрагмента наблюдается в случае гидролиза ацетилтиохолина [4] и, по-видимому, характерно для лигандов подобной химической природы. В данном случае ключевым является взаимодействие положительного заряда холи-новой группы с ароматической п-системой Trp82 [10]. Остаток Glu197, участвующий в катализе, при этом оказывает меньший эффект [10]. В то же время такое расположение лиганда приводит к тому, что уходящая группа - тиохолин - расположен не на линии нуклеофильной атаки.
В противоположность этому, в положении run11_16 тиохолин находится на одной линии с атакующим OG Ser198 (рис. 2), а расположение
8
Рис. 2. Три варианта стартовых позиций лиганда. Остатки, включенные в квантовую систему, обозначены в шаростержневой модели. Тонкими линиями обозначены остатки, обеспечивающие связывание холинового фрагмента. Атомы углерода экотиофата в варианте связывания гип6_2 показаны серым, гип2_15 голубым
и гип11_16 зеленым. Отображение атомов водорода
опущено
.о
л
о
л а к
* 10 и
и ц
акц 5
е р
ер 0
£ гип6_2 гип2_15 гип11_16 ш Система
Рис. 3. Величины барьеров реакции для разных стартовых положений. Показано среднее значение и его ошибка, определенные по трем независимым измерениям
этильных заместителей похоже на расположение ковалентного интермедиата PDB ID 1XLW в кристаллической структуре [11]. Холиновая группа, в свою очередь, может электростатически взаимодействовать с отрицательно заряженным Asp70 и ароматической п-системой Tyr332, входящих в периферийный анионный сайт (PAS) [10]. Ранее предположили, что именно такое положение наиболее
вероятно для гидролиза экотиофата, а важность контакта c остатком Asp70 подтверждена серией мутантов Asp70Gly и Asp70Lys [12]. При этом связывание второй молекулы субстрата в PAS невозможно. Положение run2_15 является промежуточным - положение фосфата соответствует таковому у run6_2, а холиновый хвост занимает переходное положение между run6_2 и run11_16 (рис. 2).
Для оценки реакционной способности всех трех положений мы применили гибридное квантово-ме-ханическое/молекулярно-механическое (КМ/ММ) моделирование. В совокупности с методом, повышающим эффективность семплирования - метадинами-кой, это позволило оценить энергетические барьеры реакций [9].
Значения, полученные для run6_2, run2_15,
runl 1_16, составляют 15.9 ± 0.7, 15.9 ± 1.9, 5.7 ± 0.4
ккал/моль соответственно (рис. 3). Они находятся в рамках, характерных для ферментативных реакций в целом, и соотносятся со значениями, полученными при изучении данной реакции в БуХЭ с другими субстратами и с помощью других вычислительных методов [5]. Но при этом заметен более низкий барьер реакции в системе, где стартовое положение лиганда таково, что уходящая группа - ти-охолин - находится на одной линии с атакующим кислородом OG Ser198, делает протекание реакции из подобного стартового положения приблизительно в 107 раз более вероятным.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
При помощи методов молекулярного моделирования мы обнаружили существование двух возможных конкурирующих конформаций экотиофата в активном центре бутирилхолинэстеразы. Существование первой, реакционноспособной, предсказано ранее. Вторая - близкая по режиму связывания к субстратам холиновой группы и обладающая лучшей оценкой энергии связывания, является ингибирующей. Учет обоих состояний позволит уточнить кинетическую схему реакции экотиофата с бутирилхолин-эстеразой, что необходимо для корректной оценки кинетических констант при дизайне вариантов бу-тирилхолинэстеразы с фосфатазной активностью.
Исследование поддержано грантом РНФ № 14-50-00131. Все вычисления проводились на ресурсах суперкомпьютерного центра МГУ им. М.В. Ломоносова, поддержанных проектом RFMEFI62117X0011.
ш
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ilyushin D.G., Smirnov I.V., Belogurov A.A., Jr., Dyachenko I.A., Zharmukhamedova T.I., Novozhilova T.I., Bychikhin E.A., Serebryakova M.V., Kharybin O.N., Murashev A.N., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013. V. 110. P. 1243-1248.
2. Terekhov S.S., Smirnov I.V., Shamborant O.G., Bobik T.V., Ilyushin D.G., Murashev A.N., Dyachenko I.A., Palikov V.A., Knorre V.D., Belogurov A.A., et al. // Acta Naturae. 2015. V. 7. P. 136-141.
3. Bevc S., Konc J., Stojan J., Hodoscek M., Penca M., Praprotnik M., Janezic D. // PLoS One. 2011. V. 6. e22265.
4. Chen X., Fang L., Liu J., Zhan C.-G. // Biochemistry. 2012. V. 51. P. 1297-1305.
5. Zheng F., Xue L., Hou S., Liu J., Zhan M., Yang W., Zhan C.-G. // Nature Comm. 2014. V. 5. P. 3457.
6. Trott O., Olson A.J. // J. Comp. Chem. 2010. V. 31. P. 455-461.
7. Hanwell M.D., Curtis D.E., Lonie D.C., Vandermeersch T., Zu-rek E., Hutchison G.R. // J. Cheminform. 2012. V. 4. P. 17.
8. Morris G.M., Huey R., Lindstrom W., Sanner M.F., Belew R.K., Goodsell D.S., Olson A.J. // J. Comp. Chem. 2009. V. 30. P. 2785-2791.
9. Zlobin A., Mokrushina Y., Terekhov S., Zalevsky A., Bobik T., Stepanova A., Aliseychik M., Kartseva O., Panteleev S., Gol-ovin A., et al. // Front. Pharmacol. 2018. V. 9. P. 834.
10. Nachon F., Ehret-Sabatier L., Loew D., Colas C., van Dors-selaer A., Goeldner M. // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 1050710513.
11. Nachon F., Asojo O.A., Borgstahl G.E.O., Masson P., Lock-ridge O. // Biochemistry. 2005. V. 44. P. 1154-1162.
12. Masson P., Froment M.T., Bartels C.F., Lockridge O. // Bio-chem. J. 1997. V. 325 (Pt 1). P. 53-61.
