CC BY
453
И ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ И ОБЗОРЫ
Предиктивная медицина и методы генетического тестирования
Костюк С.А.,
доктор медицинских наук, профессор кафедры эпидемиологии и микробиологии Белорусской медицинской академии последипломного образования, Минск
Kostiuk S.A.
Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk
Predictive medicine and methods of genetic testing
Резюме. Изучение генома человека в отношении идентификации генов предрасположенности к заболеваниям (генов-маркеров) способствует развитию предиктивной медицины как инновационного направления, ставящего своей целью совершенствование дифференциального подхода в профилактике, диагностике и лечении наиболее частых мультифакториальных заболеваний на основании результатов генетического тестирования. Современные методы генодиагностики (ПЦР и секвенирование) позволяют выявлять мутации, генетические полиморфизмы, которые в сочетании с неблагоприятными внешними факторами могут стать причиной формирования патологического процесса. Анализ генов-маркеров и генов их метаболических путей приводит к более детальному пониманию патогенетических механизмов ряда заболеваний. Применение основанного на геномике предсказательного подхода позволяет предупредить развитие болезни (в отличие от диагностики уже развернутой патологии), что способствует снижению заболеваемости, инвалидности, смертности от мультифакториальных заболеваний. Ключевые слова: предиктивная медицина, гены предрасположенности, мультифакториальные заболевания, полиморфизмы генов, секвенирование.
Медицинские новости. — 2016. — №4. — С. 11—14. Summary. The study of the human genome in relation to the identification of predisposing to diseases genes (marker genes) contributes to the development of predictive medicine as an innovative direction that places the goal to improve the differential approach in the prevention, diagnosis and treatment of the most common multifactorial diseases on the basis of genetic testing. Modern methods of gene diagnostics (PCR and sequencing) allow detection of mutations, genetic polymorphisms, which, combined with adverse external factors, can cause the formation of the pathological process. Analysis of marker genes and genes of the metabolic pathways leads to a more detailed understanding of the pathogenic mechanisms of diseases. Application of genomics-based predictive approach can prevent development of the disease instead of the already deployed disease diagnostics, thereby reducing morbidity, disabiiity, mortality from multifactorial diseases.
Keywords: predictive medicine, predisposing genes, multifactorial diseases, genetic polymorphisms, sequencing. Meditsinskie novosti. - 2016. - N4. - P. 11-14.
Каждый человек имеет определенную, строго индивидуализированную наследственную конституцию, которую определяет наличие мутаций и разнообразие полиморфизмов генов. Развитие болезней есть результат взаимодействия наследственной конституции и внешней среды. Молекулярно-генетический анализ основан на исследовании структурной организации генов человека, изменение которых влечет за собой формирование предрасположенности к развитию патологического процесса, реализующегося под воздействием провоцирующих факторов. Основой нового, быстро развивающегося направления - предиктивной медицины - является составление генной сети для каждого мультифакториального заболевания на платформе знаний о его этиологии и патогенезе, идентификация в ней центральных генов и генов-модификаторов, анализ ассоциации их полиморфизмов с конкретным заболеванием и межгенных взаимодействий, разработка на этой базе комплекса профилактических и лечебных мероприятий для каждого пациента [2, 7, 20, 23].
Современные исследования генома человека и идентификация генов, мутации которых приводят к наследственным бо-
лезням или предрасполагают к наиболее частым полигенным (мультифакториаль-ным) заболеваниям, позволяют не только проводить точную молекулярную диагностику, но и определять с большой степенью вероятности предрасположенность человека к тому или иному заболеванию.
В клинической практике это осуществляется с помощью молекулярного тестирования генов, получивших название генов предрасположенности, или генов-кандидатов. Их
можно определить как гены, наследственные варианты (полиморфизмы) которых в относительно небольшой степени влияют на функцию кодируемых белков (ферментов), совместимы с жизнью и эффективным функционированием генома, но в сочетании с неблагоприятными внешними факторами (так называемыми негенетическими или модифицируемыми факторами риска) они могут быть причиной различных мультифак-ториальных заболеваний (онкологических, неврологических и др.)
Проведенные ранее генетические исследования показали, что в эпидемиоло-
гии и развитии ряда инфекционных заболеваний, в том числе социально значимых, таких как ВИЧ-инфекция, парентеральные гепатиты, туберкулез, немаловажную роль играют наследственные факторы [26].
Генетическая подверженность инфекционным заболеваниям может быть реализована тремя способами:
1. Редкие мутации, приводящие к дефектам определенных звеньев противо-инфекционного иммунитета.
2. Варианты генов с относительно сильным эффектом в популяциях и родословных, переживших недавнюю эпидемию инфекционной болезни.
3. Сочетание у индивида «нормальных» аллелей генов, в отдельности имеющих слабый эффект, но совокупность которых приводит к образованию особенностей иммунитета, предрасполагающих к развитию инфекционного заболевания.
Доказана генетическая предрасположенность к туберкулезу, сальмонеллезу, вирусным гепатитам, клещевому энцефалиту, болезни Лайма, ВИЧ и др. [26].
Доказана генетическая предрасположенность к туберкулезу, сальмонеллезу, вирусным гепатитам, клещевому энцефалиту, болезни Лайма, ВИЧ и др.
В разных популяциях мира установлена связь заболевания туберкулезом и лепрой более чем с 20 генами, проведено 8 исследований по анализу сцепления, в том числе 4 полногеномных скрининга, показавших десяток хромосомных регионов, несущих гены подверженности к микобактериальным болезням. Полиморфизм генов SLC11A1, IFNy, VDR, MBL, IL1B, IL1RA, IL12B (p40 субъединица IL12) может определять особенности течения туберкулеза: тяжесть заболевания, рентгенологические показатели (количественные и качественные характеристики поражения легких), цитологические и биохимические параметры крови. Данные гены играют важную роль в противомикробном иммунитете. Для различных мировых популяций наблюдается ассоциация с различными заменами одиночных нуклеотидов (SNP) в этих генах [3, 12, 16, 26].
В подверженности вирусным гепатитам (ВГ) большое значение имеют гены иммунного ответа и воспаления. Изучена ассоциация полиморфизма примерно 20 генов-кандидатов с ВГ. Генотип человека играет существенную роль в формировании осложнений при вГ таких как фиброз печени и гепатоцеллюляр-ная карцинома. C персистированием вирусов гепатита В и С ассоциированы гены TNFa, MBL, VDR и IL6, TGF-1ß соответственно; риск формирования фиброза печени при ВГС инфекции определяют гены IL1RA, MPO (миелопероксидаза), TGF -1ß, SLC11A1 АТ (ангиотензиноген), HFE (протеин наследственного гемахрома-тоза). К генам, которые связаны с ответом на фармакотерапию при ВГ относят гены TNFa, MXA (ген устойчивости к миксовиру-сам), IL10, CCR5 (хемокиновый рецептор 5) [3, 17, 24, 26, 27].
Изучение роли генетических факторов в определении тактики ведения пациентов с той или иной патологией является основой фармакогенетики - науки на стыке медицинской генетики и клинической фармакологии, исследующей значение наследственности в реакции организма на медикаменты. Зная генетический статус конкретного пациента в отношении генов высокой прогностической ценности для данной патологии, врач может заранее оценить вероятный ответ на терапию, взвесить риск и пользу для конкретного пациента. Однонуклеотидные полиморфизмы в том или ином гене, передаваемые из поколения в поколение, могут определять генетический вклад в индивидуальный фармакологический ответ, в частности развитие неблагоприятной побочной реакции, резистентность или вообще отсутствие эффекта при применении лекарственного средства [7].
Формирование клинико-генетического заключения с учетом результатов молекулярно-генетического исследования
Для оценки значимости обнаруживаемых индивидуальных единичных нуклео-тидных полиморфизмов (SNP) в анализируемых генах проводят исследования сравнения частоты их встречаемости между здоровыми лицами и группами пациентов с определенной нозологической формой патологии. Предсказательную информативность обнаруживаемых SNP оценивают по коэффициенту риска (odds ratio, OR), указывающему, во сколько раз чаще данный генетический маркер встречается у пациентов при данном заболевании, чем в популяции населения в целом:
OR = P..
(1-P ) / P (1-Р. ).
a x КЛНТПППк' КПНТПППк * nnnhHhIA'
Установлено более 2400 SNP статистически достоверно ассоциированных с заболеваниями с высокими OR. Так, например, найдено от 20 до 100 различных вариантов комбинаций SNP для каждого из таких заболеваний, как болезнь Крона, сахарный диабет 2-го типа, сердечно-сосудистые заболевания [4].
Как показывает анализ мировой литературы, в настоящее время для клинической интерпретации доступны около 150-200 генов-кандидатов сердечно-сосудистого риска, известны панели генетических тестов для многих наиболее частых мультифакториальных болезней. В качестве генов предрасположенности выступают гены системы главного комплекса гистосовместимости (^А I и II классов), различных рецепторов, системы цитокинов и некоторых сигнальных путей [9, 10, 19].
Тестирование генов предрасположенности позволяет, прежде всего, формировать группы лиц высокого риска развития сердечно-сосудистых заболеваний с целью проведения лечебно-профилактических мероприятий, направленных на снижение степени риска под контролем врача. Таким образом, установить генетическую предрасположенность к какому-либо заболеванию можно задолго до появления клинических симптомов, что позволяет эффективно предупреждать его развитие или отодвигать сроки манифестации. Молекулярно-генети-ческое исследование показывает особенности этиопатогенеза и характера течения наиболее частых сердечно-сосудистых заболеваний у каждого пациента [7, 10].
Информация о наличии генетических дефектов, приводящих к дислипидеми-ям, дисфункции эндотелия, увеличению риска рестенозов коронарных сосудов после кардиоинвазивных вмешательств даст возможность проводить этиопато-генетически обоснованное лечение с применением препаратов, модулирующих метаболические нарушения (в частности, эндотелиальную дисфункцию) или выбрать иную адекватную тактику ведения больного. Например, интракоронарное введение рекомбинантного фактора роста фибро-бластов (FGF2) пациентам с ишемической болезнью сердца уменьшает клинические проявления болезни и улучшает показатели внутрисердечной гемодинамики [10].
Идентификация всех генов человека, открытие новых генных сетей существенно увеличивают возможности генетического тестирования наследственной предрас-
положенности и значение медико-генетического консультирования (рисунок).
Современные методы генодиагностики (пЦр и секвенирование) позволяют исследовать мутации, все формы генетического полиморфизма, включающие качественный и количественный генетический полиморфизм [5, 6, 11, 15].
Количественный генетический полиморфизм включает вариации числа кластеров тандемных повторов ДНК. В зависимости от протяженности повторяющейся единицы и всего кластера различают следующие виды повторов ДНК: микросателлиты (размер повторяющейся единицы -до 5 п.н., размер кластера - до 100 п.н.), мини-сателлиты (размер повторяющейся единицы - до 5-100 п.н., размер кластера -100 -100000 п.н.), макросателлиты (размер повторяющейся единицы - 100-1000 п.н., размер кластера - более 100000 п.н.). В отличие от коротких повторов (STR -short tandem, 1-2 либо 3-4 нуклеотидов на повторяющуюся единицу), повторы ДНК большей протяженности могут быть вариабельны по нуклеотидному составу внутренней структуры (VNTR - variable number tandem repeats).
В 2006 г. открыт новый тип вариаций в геноме человека: CNVs (copy numbers variations) - участки генома, в которых присутствуют значительные по длине (от нескольких тысяч до нескольких миллионов пар нуклеотидов) дупликации (удвоение) и делеции фрагментов ДНК, появились сообщения об их связи с 17 болезнями человека, в том числе системными аутоиммунными и психическими [22].
Для поиска и идентификации полиморфизмов генов разработаны и применяются около сотни различных методов, основу многих из них составляют разновидности полимеразной цепной реакции (ПЦР) [5].
Особую роль играет метод секвениро-вания, поскольку точные молекулярные характеристики полиморфизма или мутации независимо от ее природы (замены нукле-отидов, делеции, дупликации, инсерции и др.) могут быть получены только путем прямого секвенирования. Секвенирова-ние (sequencing) - это общее название методов, которые позволяют установить последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК.
Ни одного метода секвенирования, который работал бы для молекулы ДНК целиком, пока нет. Все они устроены так: сначала готовится большое число небольших участков ДНК (клонируется молекула ДНК многократно и «разрезается» в случайных местах), а потом читается каждый участок по отдельности.
Методы секвенирования: выборочное (таргетное); экзомное (определение всех последовательностей ДНК, несущих информацию о структуре полипептидов); секвенирование всего генома.
Секвенирование всего генома может быть основано на анализе случайных фрагментов ДНК, поиске перекрываний в последовательности нуклеотидов отдельных фрагментов и последующем восстановлении последовательности нуклеотидов всего генома. Например, едва ли не самый первый случай клинического применения полногеномных данных в клинике зафиксирован в 2011 г. При финансовой поддержке National Foundation for Cancer Research Center for Genomic Medicine, USA, был сек-венирован полный геном нормальной ткани и опухоли больного раком поджелудочной железы и в итоге обнаружены мутации, которые дали информацию о выборе наиболее оптимальной терапии. Примечательно, что данные мутации были выявлены только благодаря полногеномному анализу и не могли быть обнаружены иным способом [19].
Полногеномное секвенирование также важно в медицинской генетике и в профилактике многофакторных заболеваний. Этот метод остается дорогим, и, как правило, услуги персонализированной медицины основываются на анализе больших, но ограниченных участков генома человека. Технологические решения одинаковы в обоих случаях, поэтому удешевление и усовершенствование методик секвениро-вания позволит исследовать повсеместно полный геном. При этом уже сейчас можно проводить тестирование супружеских пар на носительство нескольких сотен мутаций, характерных для развития более чем 100 тяжелых наследственных болезней. Такой анализ позволяет оценить риск рождения ребенка с патологией и в случае серьезной угрозы выбрать процедуру экстракорпорального оплодотворения с отбором здорового эмбриона или (в некоторых случаях) подготовиться и своевременно начать терапию, которая позволит вырасти абсолютно здоровому ребенку [9].
Пожалуй, самым распространенным тестом, основанным на геномном секвени-ровании (не обязательно полногеномном) является неинвазивный пренатальный тест на наличие синдрома Дауна у плода. Анализ можно проводить, начиная с 10-й недели беременности, взяв только образец крови матери и не создавая риска
для вынашивания беременности - поэтому он называется неинвазивным. В крови матери находятся фрагменты ДНК плода, которую с помощью секвенирования и математической обработки результатов удается проанализировать и установить наличие лишней хромосомы. Данный тест успешно прошел клинические исследования и выполнен у нескольких десятков тысяч беременных во всем мире. Новые модификации теста позволят определять изменение числа хромосом не только по 21-й паре (синдром Дауна), но и по 13-й и 18-й - наиболее часто встречающимся при аномалиях числа хромосом. Все перечисленные примеры показывают, как уже сейчас геномное секвенирование оптимизирует получение персонализированной медицинской помощи [18, 21].
Современные системы секвенирова-ния демонстрируют высокую диагностическую точность (99,99%), а также возможность детекции минорных вариантов в гетерогенных образцах при высокой производительности - до гигабаз в день.
Последние 20 лет в науке и практике доминирует автоматизированное секвенирование по методу Сэнгера. Этот метод был использован в глобальных проектах по секвенированию генома человека, различных животных, бактерий и вирусов. Однако полногеномное секвенирование остается экономически затратным, что привело к созданию новых технологий. Автоматизированное секвенирование по Сэнгеру считается «методом первого поколения», тогда как современные технологии называются «методами нового, или второго, поколения» (Next-Generation Sequencing, NGS). В их основу заложены различные стратегии - уникальные комбинации приготовления ДНК-матриц, секвенирования, визуализации, а также выравнивания и составления последовательностей (sequences - сиквенсов) ДНК (Metzker M, 2010). Платформы для методов нового поколения позволяют параллельно «читать» несколько участков генома за один прогон работы секвенатора. Например, секвенирование Illumina - путем синтеза с обратимым терменированием. Основным преимуществом секвенирования нового поколения является рентабельность: огромный массив данных за короткое время. Тем не менее «старые» секвена-торы (первого поколения, сэнгеровские) выдают значительно более подходящие
Уже сейчас можно проводить тестирование супружеских пар на носительство нескольких сотен мутаций, характерных для развития более чем 100 тяжелых наследственных болезней
для сборки данные, чем «новые» (второго поколения). Это в основном выражается в длине ридов (reads) тех участков ДНК, которые удается последовательно прочесть и которые, собственно, и нужно собрать в одну большую строчку. Секвенаторы первого поколения выдавали риды длиной более пятисот нуклеотидов, обычно около тысячи, тогда как современные секвенаторы выдают пары ридов, каждый из которых имеет длину около ста нуклеотидов [1, 8].
Технологии параллельного секвени-рования ДНК можно условно разделить на моно- и мультимолекулярные. Муль-тимолекулярные технологии лидируют в лабораторной практике; мономолекулярные, которые имеют дело с отдельными молекулами ДНК, формируют перспективу использования. Примером мономолекулярного параллельного секвенирования может служить секвенирование с помощью нано-пор. Отрицательно заряженная одноцепо-чечная ДНК проходит через нанометровую пору в мембране, наружная поверхность которой несет отрицательный заряд, а внутренняя - положительный. Как только очередной нуклеотид перекрывает внутреннее отверстие в поре, электропроводность мембраны изменяется. Нуклеотиды разного типа, из которых состоит цепочка ДНК, немного различаются по размерам и поэтому закрывают пору в большей или меньшей степени и на разное время, соответственно этому изменяется и электропроводность. Если удастся существенно повысить разрешающую способность метода, то каждый скачок электропроводности будет отвечать прохождению через пору одного нуклеотида, и с получаемой на выходе диаграммы можно будет считывать нуклеотидные последовательности. Секвенирование генома человека займет в этом случае всего 20 часов, поскольку многократной амплификации матрицы не понадобится [13].
На основе методов секвенирования нового поколения для картирования и подсчета транскриптов в биологических образцах создан новый подход РНК-секвенирования (RNA-seq). Для этого из тотальной РНК отбирается целевая фракция РНК, проводится фрагментация (фрагменты длиной 100-300 н.), синтезируется 1-я цепь кДНК, затем синтезируется 2-я цепь кДНК, далее этапы секвенирования проходят так же, как с геномной ДНК.
Секвенирование можно комбинировать с другими методами. Так, технология мини-секвенирования с последующим анализом продуктов на масс-спектрометре дает возможность быстро и эффективно идентифицировать SNP и обладает высо-
кой производительностью. Полногеномное секвенирование, дополненное анализом уровня транскрипции и метилирования ДНК, представляет собой современную стратегию изучения генетических особенностей опухолевого роста [7, 14, 28].
В качестве источника дНк для секвени-рования можно использовать кровь пациента, соскоб буккального эпителия, слюну, волосы и другие биологические субстраты.
Результаты генетического тестирования вместе с фенотипическими маркерами могут уже сегодня быть учтены в персонализированном прогнозе, который всегда будет носить вероятностный характер. При планировании исследования следует больше ориентироваться на поиск «главных» генов-маркеров и генов их метаболических путей и меньше на анализ разрозненных SNP. Важно идентифицировать не только «главные», но и второстепенные гены-маркеры соответствующих метаболических путей. Комплексный анализ позволяет более детально понять патогенетические механизмы мультифакториальных заболеваний. При этом показаниями к исследованию могут быть принадлежность к группе риска, семейный характер заболевания, раннее начало заболевания, толерантность к терапии.
Персонализированная медицина требует применения дополнительных высокотехнологичных тестов, что, казалось бы, увеличивает стоимость медицинских услуг. Однако в итоге она ведет к существенной экономии, поскольку при правильном и своевременно поставленном диагнозе и обоснованной тактике лечения затраты на медицинскую помощь резко сокращаются.
Индивидуальное геномное секвени-рование - это быстро растущая область технологий и медицины. Как ожидается, существенный прогресс последних лет в скором времени может привести к уменьшению стоимости секвенирования до 1000 долларов на индивидуальный геном (Service, 2006). В добавление к персональному полногеномному секвенированию достижения в изучении однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) позволили генотипировать большинство вариаций в индивидуальных геномах. Уже несколько компаний предлагают индивидуальное секвенирование и генотипирование, а также информацию о персональной родословной [9, 25, 29].
В ближайшем будущем пациентам будет доступно получение данных о собственном геноме и врачи смогут оценить риски заболеваний и скорректировать стратегию лечения.
Генетическое тестирование расширяет возможности персонализации клинической практики. Возможное деление нозологических форм на молекулярные
подгруппы по результатам генетических исследований может дополнить и вывести на новый уровень принцип дифференцированного лечения. Основанный на геномике предсказательный подход позволит предупредить развитие болезни (вместо диагностики уже развернутой патологии), что в конечном итоге будет способствовать снижению заболеваемости, инвалидности, смертности от мультифакториальных заболеваний.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Аникаев А.Ю., Ломоносов А.М. // Лабораторная служба. - 2014. - №1. - С.32-36.
2. Баранов В.С. // Экологическая генетика. - 2003. -Т.1. - С.22-29.
3. Гончарова И.А., Фрейдин М.Б., Рудко A.A. и др. // Вестник ВОГиС. - 2006. - Т.10, №3. - С.540-552.
4. Дедов И.И., Тюльпаков А.Н., Чехонин В.П. и др. // Вестник РАМН. - 2012. - №12. - С.4-12.
5. Костюк С.А., Коломиец Н.Д., Руденкова Т.В, Полуян О.С. Теоретические и прикладные вопросы применения методов анализа нуклеиновых кислот. - Минск: БелМАПО, 2014. - 272 с.
6. Костюк С.А. // Мед. новости. - 2012. - №4. -С.16-19.
7. Костюк С.А. Молекулярно-биологические методы в медицине. - Минск: БелМАПО, 2013. - 327 с.
8. Краснов Я.М, Гусева Н.П., Шарапова H.A., Черкасов А.В. // Проблемы особо опасных инфекций. -2014. - Вып.2. - С.73-79.
9. Новиков П.В. // РМЖ. - 2011. - №12. - С.794.
10. Стрекалов Д.Л. Молекулярные основы патогенеза сердечно-сосудистых заболеваний: учеб. пособие. - СПбГПМА, 2004. - 24 с.
11. Шкурат Т.П., Шестопалов A.A., Машкина Е.В. и др. Геномные технологии в медицине: учеб. пособие. - Ростов-на-Дону, 2011. - 57 с.
12. Bellamy R. // Thorax. - 1998. - N53. - P.588-593.
13. Branton D, DeamerD.W., Marziali A. et al. // Nat. Biotechnol. - 2008. - Vol.26, N10. - P.1146-1153.
14. Griffith M, Walker J.R., Spies N.C. et al. // PLoS Comput Biol. - 2015. - Vol.11, N8.
15. Fassunke J., Haller F, Hebele S. et al. // Int. J. Mol. Med. - 2015. - Vol.36, N5. - P.1233-1243.
16. Fernando S, Britton W.J. // Immunology and Cell. Biology. - 2006. - Vol.84. - P.125-137.
17. Frodsham A.J., Hill A.VS. // Human. Molecular. Genetics. - 2004. - Vol.13, N2. - P.187-194.
18. Langlois S, Brock J.A. // J. Obstet. Gynaecol. Can. - 2013. - Vol.35, N2. - P.177-181.
19. Liang W.S., Craig D.W., Carpten J. et al. // PLoS. -2012. - Vol.7, N10.
20. Mihaescu R, Pencina M.J., Alonso A. et al. // Genome Medicine. - 2013. - Article 76 from Vol.5, N8.
21. Palomaki G.E., Deciu C, Kloza E.M. et al. // Genetics in Medicine. - 2012. - Vol.14, N3. -P.296-305.
22. Redon R, Ishikawa Sh, Fitch K.R. et al. // Nature. -2006. - Vol.444. - P.444-454.
23. Schoenbach V.J., Rosamond V.D. // Understanding the Fundamental of Epidemiology. An Evolving Text. -Chapel Hill: University of North Carolina, 2000. -P.381-422.
24. Sibbing B, Nattermann J. // J. Gastrointestin Liver Dis. - 2011. - Vol.20, N4. - P.397-406.
25. Snyder M, Jiang Du // Genes Development. -2010. - Vol.24, N5. - P.423-431.
26. Susceptibility to infectious diseases: the importance of host genetics / ed. R.Bellamy. - Cambridge University Press, 2004. - 398 p.
27. Thursz M, Leland Yee // Seminars in Liver Diseases. - 2011. - Vol.31, N2. - P.115-127.
28. Wang Z, Gerstein M, Snyder M. // Nat. Rev. Genet. - 2009. - Vol.10, N1. - P.57-63.
29. Wheeler D.A., Srinivasan M, Egholm M. et al. // Nature. - 2008. - Vol.452. - P.872-876.
Поступила 04.02.2016г.
