CC BY
32
УДК 635.656:581.19
Повышение качества белка гороха с использованием полиморфизма конвицилина
Т.Н. СЕЛИХОВА, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник С.В. БОБКОВ, кандидат сельскохозяйственных наук, зав. лабораторией
ВНИИ зернобобовых и крупяных культур, ул. Молодежная, 10, корп. 1, пос. Стрелецкий, Орловский район, Орловская область, 302502, Россия E-mail: tat.selihowa@yandex.ru
Для пищевой промышленности необходимы высококачественные растительные белки. Запасной белок гороха конвицилин ухудшает физико-химические свойства белковых изолятов. Поэтому образцы гороха с нетрадиционными изоформами конвици-лина или его полным отсутствием имеют перспективу для использования в селекции на высокое качество запасных белков. Цель исследования состояла в оценке полиморфизма и идентификации уникальных изоформ конвицилина у представителей рода гороха Pisum L. для вовлечения в селекционный процесс. Полиморфизм конви-цилина исследовали в семенах 60 образцов, в том числе 6 сортов и селекционных линий, 20 образцов дикорастущих подвидов P. sativum, 34 образца дикорастущего вида P. fulvum. Для разделения белков использовали SDS-PAGEэлектрофорез в полиакриламид-ном геле. Всего было выявлено 4 изоформы конвицилина. Они находились на 14,15, 16и 17 позицияхэлектрофоретических спектров. Определены различия по частоте изоформ конвицилина между культивируемыми и дикорастущими образцами. Уселекционных линий и сортов гороха Р. sativum обнаружены изоформы 14 и 17. Изоформа 17была представлена с наибольшей частотой (0,83). У образцов дикорастущих подвидов Р. sativum выявлены изоформы 15,16,17с наибольшей частотой (0,6) изоформы 15. У образцов дикорастущего вида Р. fulvum представлены все 4 выявленные изоформы. Наибольшей частотой (0,59) характеризовалась изоформа 15. У ряда образцов дикорастущего вида P. fulvum обнаружены легкие изоформы конвицилина, представляющие интерес для использования в селекции на высокие физико-химические качества белков.
Ключевые слова: горох (Pisum L.), дикий таксон, P. fulvum, вид, подвид, электрофорез, белковый компонент, конвицилин.
Для цитирования: Селихова Т.Н., Бобков С.В. Повышение качества белка гороха с использованием полиморфизма конвицилина //Земледелие. 2015. №2. С. 47-48.
Основное достоинство бобовых культур состоит в высоком содержании запасных белков, в состав которых входит большое количество лизина и треонина, что служит хорошим дополнением к
белкам злаковых культур [1, 2]. В мире и России наиболее распространена соя [3]. Горох возделывают меньше. Известно, что он уступает сое как по содержанию запасных белков (23 и 40% соответственно), так и по их качеству (WHO/FAO индекс PDCAAS 0,69 и 0,92) [4]. Это следует учесть при создании новых сортов гороха.
Запасные белки зерна этой культуры на 80% представлены альбуминами и глобулинами [5]. К числу последних относятся легумин, вицилин и конвицилин. Качество белка зерна гороха во многом зависит от присутствия специфичных изоформ конвицилина, легумина и вицилина [6]. Для пищевой промышленности необходимы высококачественные растительные белки. Легумин и вицилин гороха в различных соотношениях формируют изолированные белки с хорошими физико-химическими характеристиками. Конвицилин ухудшает их качество и ограничивает широкое использование изолированных белков гороха в пищевой промышленности [5].
Конвицилин имеет массу 70 кДа и характеризуется обширной гомологией с вицилином, начиная со 122-166 (в зависимости от изоформы) аминокислотного остатка до С-конца полипептида [5, 6]. N-конец молекулы имеет сильный положительный заряд, что негативно влияет на физико-химические качества белковых изолятов. Поэтому при создании новых сортов гороха актуально вовлечение в селекционный процесс исходного материала с нетрадиционными изоформами или нуль-мутациями конвицилина.
Цель нашего исследования состояла в оценке полиморфизма и идентификации уникальных изоформ конвицилина у образцов сортов, линий и диких подвидов P. sativum, а также дикорастущего вида P fulvum для использования в селекции на высокое качество белков семян.
Изучены электрофоретичекие спектры запасных белков 60 сортов, селекционных линий и дикорастущих образцов. Объектами исследования служили сорта Аист, Стабил и четыре селекционные линии с усатым (af), многократно непарноперистым (aftl), акациевидным (tl) и рассеченнолисточковым морфо-типами [7]; дикорастущие подвиды -elatius (К1851, K2173, К2524, К3115, K3370, К4014), transcaucasicum (К296, К2365, К2376, К3249, К3980), asiaticum (К1923, К1974, К1975, К2645, К5322, К1915), abyssinicum (К2759, I565496),
syriacum (К2521); образцы коллекции ВИР вида Р. fulvum (И609881, И609885, К1878, К2523, К2529, К6070, И592573, И592575, И592577, И592579, И592582, И592583, И592589, И592590, И592595, И592597, И592598, И592599, И592602, И592603, И592604, И592607, И592608, И592609, И592610, И592611, И592612, И592613, И592614, И592618, И592623, И592626, И592882, И592884).
Для выделения и электрофоре-тического разделения белков семян использовали стандартный арбитражный метод ISTA [8]. Экстрагировали и анализировали белки из 50 индивидуальных семян каждого представителя вида и подвида гороха.
Экстракцию белков из муки индивидуальных семян проводили в течение 20 ч при температуре 3-4°С с использованием электродного буфера (Трис, глицин, додецилсульфат натрия), рН=8,3. После центрифугирования 10 мкл экстракта переносили в ячейки планшеток для смешивания с равным объемом буфера нанесения (додецилсульфат натрия, Трис-HCl, глицерин, р-меркаптоэтанол, бромфеноловый синий). Концентрация разделяющего геля - 12,5%, концентрирующего - 5%. Для проведения исследований использовали камеру для вертикального электрофореза белков VE-4 фирмы «Хеликон» и реактивы для SDS-PAGE электрофореза.
Анализ относительной подвижности компонентов образцов гороха осуществляли с использованием спектра сои сорта Ланцетная. В эксперименте использовали маркеры молекулярной массы фирмы SIGMA. Окраску компонентов спектра оценивали по следую-ще шкале: 1 - слабая, 2 - интенсивная и 3 - очень интенсивная.
Для оценки полиморфизма локуса конвицилина использовали индекс уровня гетерозиготности (Hj) [9]. Индекс H для определенного локуса j в популяции показывает число полиморфных пар аллелей в их общем количестве, вычисляют его по формуле:
H =1-Еp2,
j "j '
где Рц - частота /-ой аллели локуса j.
Конвицилин контролируется различными аллелями одного локуса, поэтому в наших исследованиях его изоформы на электрофоретических спектрах рассматривались в качестве аллелей.
Частота изоформ конвицилина в различных таксонах рода Pisum L.
s
(D
М 2 О
сл
-Г Число об-Таксон разцов Изоформа Частота
Р. Sativum:
линии и сорта 6 14 0 17
17 0 83
дикорасту- 20 15 0 60
щие подвиды 16 0 35
17 0 05
Р. fulvum 34 14 0 18
15 0 59
16 0 17
17 0 06
Рисунок. Электрофоретический спектр белков семян образцов дикорастущего вида Р. /иЬит: 1, 2 - И609881; 3- К6070; 4, 5- И599; 6 - И592612; 7, 8, 9- И592583; 10 - И592608; 11,12,13 - И592602; 14,15 - И592595; 16,17 - К2523; 18 - соя сорта Ланцетная.
■л о
СЧ СМ
е и
^
е
и
е
s
е
со
При анализе семян исследованных образцов из коллекции ВИР обнаружено много типов спектров, различных по составу и интенсивности компонентов (см. рисунок).
Изоформы конвицилина, различные по расположению компоненты на элек-трофоретических гелях, были локализованы в области маркера молекулярной массы ~70 кДа [5]. У представителей рода Pisum L. они встречались в 4 позициях электрофоретических спектров -14, 15, 16 и 17 с частотой 0,12; 0,35; 0,21 и 0,32 соответственно.
Принимая во внимание моногенное кодоминантное наследование конвицилина, разумно предположить, что идентифицированные изоформы - продукты 4 аллелей. Область их локализации характеризовалась достаточно сильной консервативностью (преобладание 15-ой позиции) у вида P. fulvum и дикорастущих подвидов Р. sativum: elatius, asiaticum, abyssinicum и transcaucasicum (см. рисунок). Это согласуется с ранее полученными результатами [10].
На спектрах 6 линий и сортов культивируемого гороха были выявлены 2 изоформы - 14 и 17, причем последняя представлена с наибольшей частотой -0,83 (см. табл.). Анализ электрофоретических спектров дикорастущих подвидов гороха Р. sativum (20 образцов) позволил выявить 3 изоформы (15, 16, 17), дикорастущего вида Р. fulvum -4 изоформы (14, 15, 16, 17).
Уровень гетерозиготности локуса конвицилина H=1-Epy2=1 -0,5668=0,43. Такая величина характеризует среднюю степень полиморфизма [9], который можно использовать в селекционной работе на улучшение качества запасных белков гороха. Особое внимание следует уделить образцам дикорастущего вида P. fulvum с легкими изоформами конвицилина(позиция 17): редукция
молекулярной массы может быть связана с делециями в области сильно заряженного N-конца полипептида. Следует отметить, что у образца К2523 дикорастущего вида Р. fulvum на элек-трофоретических спектрах в области локализации конвицилина при более высоком разрешении обнаружены раздвоенные компоненты (см. рисунок), что расширяет возможности для отбора.
Таким образом, уровень гетерозиготности локуса конвицилина составляет 0,43. Изоформы конвицилина у представителей рода Pisum L. локализованы в 4 позициях (14, 15, 16 и 17) электрофоретических спектров. У ряда образцов дикорастущего вида P. fulvum выявлены легкие изоформы конвици-лина, представляющие интерес для использования в селекции на высокие физико-химические качества белков.
Литература.
1. Jansman A.J.M. Bioavailability of proteins in legume seeds // Grain legumes. 1996. № 11. p. 19.
2. Бобков С.В., Уварова О.В. Перспектива использования гороха для производства изо-лятов запасных белков // Земледелие. 2012. № 8. С. 47-48.
3. FAOSTAT. Электронный ресурс. URL: http://fa0stat3.fa0.0rg/d0wnl0ad/Q/QC/E (дата обращения 23.01.2015).
4. S0y Protein Products, Characteristics, Nutriti0nal Aspects, and Utilizati0n. Champaign, Illin0is: AOCS Press and the S0y Protein C0uncil. J0seph G. Endres (Ed.). 2001. 53 pp.
5. Tzitzikas E.N., Vincken J.P., Gr00t J. et al. Genetic variati0n in pea seed c0mp0siti0n // J0urnal 0f Agricultural and f00d chemistry. 2006. № 54. pp. 425-433.
6. O'Kane F.E., Happe R.P., Vereijken J.N., Gruppen H., van B0ekel M.A.J.S. Characterizati0n 0f pea vicilin: 1. Den0ting c0nvicilin as the a-subunit 0f the Pisum vicilin family // Agricultural and f00d chemistry. 2004. V. 52. pp. 3141-3148.
7.Паспорта доноров и источники селекционно-ценных признаков сельскохозяйственных культур. Горох (Pisum sativum L.). Формы с измененной архитектоникой листа /
A.Н. Зеленов, B.Ю. Щетинин, ИБ. Кондыков,
B.H. Уваров, A.M. Задорин, Г.А. Борзенкова, Е.Ф. Азарова, Т.С. Hаумкина, СБ. Бобков, O.B. Уварова // Паспорта доноров и источники селекционно ценных признаков сельскохозяйственных культур. Bb^^ 9. Орел. 2011. 25 с.
8. Идентификация сортов и регистрация генофонда культурных растений по белкам семян / под ред. B.r. Конарева. СПб: BИР, 2000. 186 с.
9. Hildebrand C.E., Torney D.C., Wagner R.P. Informativeness of polymorphic DNA markers // Los Alamos Science. 1992. V. 20. pp. 100-102.
10. Селихова TH., Бобков СБ. Полиморфизм запасных белков у образцов диких таксонов гороха // Доклады РАСХК 2013. № 5. С. 20-22.
Improving of protein quality in pea with use of convicilin polymorphism
T.N. Selikhova, S.V. Bobkov
All-Russia Research Institute of Legumes and Groat Crops, Molodezhnaya str., 10, set. Streletskiy, Orel destrikt, Orel region, 302502, Russia
Summary. Plant proteins of high quality is used in food industry. Pea convicilin impairs physico-chemical properties of protein isolates. Pea accessions without convicilin or with its unusual isoforms could be used in pea breeding on high quality of seed proteins. The objective of research was evaluation of polymorphism and identification of unique convicilin isoforms in representatives of genus Pisum L. for breeding on high protein quality. Polymorphism of convicilin was studied with use of 60 accessions of genus Pisum L. including 6 varieties and breeding lines, 20 wild subspecies and 34 accessions of P. fulvum. Standard SDS-PAGE electrophoresis was used for separation of storage proteins. In total, four convicilin isoforms were revealed. They were located on positions 14, 15, 16 and 17 of electrophoretic spectra. Differences between cultivated and wild pea accessions on frequency of convicilin isoforms were determined. Only two (14 and 17) isoforms were revealed among breeding lines and varieties of R sativum. Isoform 17 was represented with the highest frequency (0.83). In wild subspecies of R. sativum only three (15,16,17) isoforms were found. Isoform 15 had the highest frequency (0.6). In accessions of wild species R. fulvum all four convicilin isoforms were represented. Isoform 15 was found preferably (0.59). In accessions of R. fulvum light isoforms of convicilin were revealed. They could be used in pea breeding on high physico-chemical properties of seed proteins.
Key words: pea, Pisum L., P. fulvum, species, subspecies, electrophoresis, protein band, convicilin.
Author details: T.N. Selikhova, Cand. Sc. (Biol.), Senior Researcher (e-mail: tat. selihowa@yandex.ru), S.V. Bobkov, Cand. Sc. (Agr.), Head of Laboratory.
For citation: Selikhova T.N., Bobkov S.V. Improving of protein quality in pea with use of convicilin polymorphism // Zemledelie. 2015. No 2. pp. 47-48 (in Russ.)
