CC BY
20
Original Articles
https://doi.org/10.31631/2073-3046-2021-20-6-12-19
Повышение иммуногенной и протективной активности вакцинного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ в условиях культивирования с азоксимером бромида (полиоксидонием)
Т. Н. Щуковская*, А. Ю. Гончарова, С. А. Бугоркова, О. М. Кудрявцева, Н. Е. Щербакова, А. С. Абдрашитова
ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора, г. Саратов
Резюме
Актуальность. Для профилактики чумы в России используют вакцину чумную живую на основе вакцинного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ, вызывающую развитие иммунитета длительностью до 1 года, что обусловливает необходимость проведения ежегодной ревакцинации прививаемого контингента. Разработка новых способов усиления иммуногенности вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ является актуальной задачей. Цель - изучение влияния иммуноадъюванта азоксимера бромида (полиоксидония, ПО) на иммунобиологические свойства Y. pestis EV НИИЭГ в условиях культивирования. Материалы и методы. Y. pestis EV НИИЭГ выращивали при 28 °С в течение 48 ч на LB агаре рН 7,2 (Sigma-Aldrich, USA) как с ПО, так и без. Снятие масс-спектров экстрактов клеток Y. pestis EV НИИЭГ проводили на масс-спектрометре MicroflexTM LT (Bruker Daltonics, Германия). Протективные свойства оценивали в условиях моделирования чумной инфекции по интегральному показателю ImD50 на морских свинках и мышах BALB\c при заражении вирулентными штаммами основного подвида Y. pestis 231, Y. pestis Р-13268 Вьетнам. Иммуногенность - по уровню антител к F1 чумного микроба методом ТИФА. Результаты и обсуждение. Внесение ПО в среду культивирования вызывает достоверное повышение иммуногенности вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, сопровождающееся ростом продукции антител к капсульному антигену F1 чумного микроба и выраженным усилением защитного действия вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ при моделировании бубонной формы чумы на двух видах экспериментальных животных- мышах линии BALB\c и морских свинках. Зарегистрировано значимое (р < 0,05) уменьшение величины ImD50 для культур вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ, выращенных на среде с добавлением ПО, по сравнению с ImD50 для Y. pestis EV НИИЭГ в стандартных условиях культивирования. Выводы. Выявлены изменения количественных и качественных характеристик на масс-спектрах Y. pestis EV НИИЭГ, выращенного на среде с ПО, сопровождавшиеся повышением его иммуногенной и протективной активности. Морфологические исследования подтверждают отсутствие влияния ПО на безвредность вакцинного штамма.
Ключевые слова: азоксимера бромид (полиоксидоний), Y. pestis EV НИИЭГ, иммуногенность, протективность Конфликт интересов не заявлен.
Для цитирования: Щуковская Т. Н., Гончарова А. Ю., Бугоркова С. А. и др. Повышение иммуногенной и протективной активности вакцинного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ в условиях культивирования с азоксимером бромида (полиоксидонием). Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2021;20(6): 12-19. https://doi:10.31631/2073-3046-2021-20-6-12-19.
Enhancement of the Yersinia pestis EV NIIEG Vaccine Srain Immunogenic and Protective Activity under Cultivation with Azoxymer Bromide (Polyoxidonium)
TN Shchukovskaya**, AY Goncharova, SA Bugorkova, OM Kudryavtseva, NE Shcherbakova, AS Abdrashitova
Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe" Rospotrebnadzor, Saratov, Russia
Abstract
Background. The live-attenuated vaccine based on the Yersinia pestis strain EV line NIIEG is still used in Russia, providing protective efficacy against plague. Nevertheless, there is an urgent need for developing new ways to increase the immunogenicity of the Y. pestis EV NIIEG vaccine strain. In this study, the ability of direct action of immunoadjuvant azoximer bromide (polyoxidonium, PO) on the immunobiological properties of vaccine strain Y. pestis EV NIIEG during cultivation on a dense nutrient medium was
*Для переписки: Щуковская Татьяна Николаевна, д. м. н., профессор, главный научный сотрудник отдела иммунологии, ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"» Роспотребнадзора, 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46. +7 (845-2) 26-21-31, Факс: +7 (845-2) 51-52-12. rusrapi@microbe.ru. tatyanaschuk@mail.ru. ©Щуковская Т. Н. и др.
**For correspondence: Shchukovskaya Tatiana N., Dr. Sci. (Med.), Professor, Head Researcher, Department of Immunology, Federal Government Health Institution "Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", 46, Universitetskaya str., Saratov, 410005, Russia. +7 (845-2) 26-21-31, fax: +7 (845-2) 51-52-12. rusrapi@microbe.ru. tatyanaschuk@mail.ru. ©Shchukovskaya TN etal.
Original Articles
evaluated. Materials & Methods. Y.pestis EV NIIEG, cultivated at 28 °C for 48 h on LB agar, Miller pH 7.2 ± 0.1 (Sigma-Aldrich, USA) with the addition of PO and without. MALDI-TOF mass-spectrometry was deployed for the obtainment of mass-spectra of ribosomal proteins from Y. pestis EV NIIEG cells on the MicroflexTM LT mass spectrometer (Bruker Daltonics, Germany). Protective efficacy was evaluated under subcutaneously challenge guinea pigs and mice BALB's with 400 LD50 doses of the Y. pestis 231, Y. pestis P-13268 Vietnam (MLD=5 CFU). Antibody titers to F1 in serum were determined using an ELISA. Results. The addition of the therapeutic concentration of PO in the cultivation medium induced a significant increase in the immunogenicity of Y. pestis EV NIIEG that resulted in enhancement of serum antibody levels against Y. pestis F1 antigen and several times the growth of protective efficacy in the bubonic plague model on two types of experimental animals. ImD50 of the vaccine strain Y. pestis EV NIIEG, cultivated with PO, was significantly (p < 0,05) lower in comparison to ImD50 for Y. pestis EV NIIEG in standard cultivation conditions. One year of storage at a temperature of 4 °C did not alter the protective properties of the vaccine strain Y. pestis EV NIIEG, cultivated with PO. Conclusions. Morphological studies confirmed the absence of influence PO introduction into the cultivation environment on the safety of the vaccine strain. MALDI-TOF MS profile of the Y. pestis EV NIIEG, cultivated with PO, had peaks characteristic features. The mass peak at m/z 3,061 was significantly down-regulated and new mass peaks at m/z 2,759, m/z 3,533 were determined. These changes are accompanied by the increase of Y. pestis EV NIIEG immunogenicity.
Keywords: azoximer bromide (polyoxidonium), cultivation Y. pestis EV NIIEG, immunogenic and protective properties No conflict of interest to declare.
For citation: Shchukovskaya TN, Goncharova AY, Bugorkova SA, et al. Enhancement of the Yersinia pestis EV NIIEG vaccine strain immunogenic and protective activity under cultivation with azoxymer bromide (polyoxidonium). Epidemiology and Vaccinal Prevention. 2021;20(6): 12-19 (In Russ.). https://doi: 10.31631/2073-3046-2021-20-6-12-19.
Введение
Чума - особо опасная инфекционная болезнь с природной очаговостью, возбудитель которой Yersinia pestis относится к микроорганизмам I группы патогенности. На территории Российской Федерации действуют 11 природных очагов чумы, в 7 из которых циркулируют высоковирулентные и эпидемически значимые штаммы. Ситуация также осложняется ежегодным выявлением новых случаев чумы среди населения сопредельных с Россией государств (Казахстан, Монголия, Китай) [1-3]. Для профилактики чумы предусмотрено проведение комплекса многоплановых профилактических мероприятий, включая вакцинацию, которая внесена в Календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям [4]. За рубежом отсутствуют лицензированные вакцины для специфической профилактики чумы [5,6]. В России для этого используют вакцину чумную живую (ВЧЖ), которая формирует напряженный иммунитет продолжительностью 6-12 месяцев, что обусловливает необходимость проведения ежегодной ревакцинации прививаемого контингента [4]. Обострение эпидемической ситуации в 2015-2016 гг. в ГорноАлтайском высокогорном природном очаге чумы, вызванное единичными случаями бубонной формы чумы среди людей, в том числе и у вакцинированных [7], заставляет интенсифицировать поиск возможных путей повышения иммуногенных и про-тективных свойств ВЧЖ.
Действие вакцины основано на приживлении и размножении в макроорганизме клеток вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ, сопровождающемся формированием иммунного ответа на целый ряд антигенов чумного микроба и развитием специфической резистентности к чуме. В этой связи разработка новых способов усиления имму-ногенности вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ,
включая прямое воздействие иммуноадъювантов на его биологические свойства, является актуальной задачей.
В России синтезирован и внедрен в практику не имеющий аналогов за рубежом адъ-ювант-иммуноактиватор азоксимера бромид (полиоксидоний) с молекулярной массой 80 kD. Данный препарат представляет собой водорастворимое ^оксидированное производное поли-этиленпиперазина с наличием на поверхности молекулы большого количества различных активных групп, которые могут взаимодействовать с белками поверхностных структур бактериальных клеток [8]. Известно, что полиоксидоний (ПО) обладает выраженным иммуномодулирующим и ан-тигенусиливающим эффектом [9]. Введение ПО в схему вакцинации против чумы усиливало защитное действие вакцинного штамма У. pestis БУ НИИЭГ в условиях моделирования бубонной и легочной форм чумы штаммами У. pestis основного и неосновного подвидов из различных природных очагов [10]. В настоящее время отсутствуют сведения о прямом действии адъювантов с им-муноактивирующим действием на биологические свойства возбудителей особо опасных заболеваний бактериальной этиологии и на вакцинные штаммы.
Цель работы - изучение влияния азоксимера бромида (полиоксидония) на иммуногенные и про-тективные свойства вакцинного штамма чумного микроба У. pestis БУ НИИЭГ в условиях культивирования на плотной питательной среде.
Материалы и методы
Работа проводилась в соответствии с СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами 1-11 групп патогенности (опасности)» [11]. Вакцинный штамм У. pestis БУ линии НИИЭГ ^т-,
Original Articles
pYT+, pYV+, pYP+) и вирулентные штаммы основного подвида Y. pestis 231 (Pgm+, pYT+, pYV+, pYP+), LD50 при подкожном введении для белых мышей 5 м. кл., LD50 для морских свинок 10 м. кл.; Y. pestis Р -13268 (Pgm+, pYT+, pYV+, pYP+) Вьетнам, LD50 для белых мышей 5 м. кл, получены из Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб». В экспериментах использовали мышей линии BALB/c массой (18 ± 2) г и морских свинок массой (300 ± 50) г, полученных из отдела экспериментальных животных с виварием РосНИПЧИ «Микроб» (г. Саратов). Манипуляции с животными, а также выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей [12]. Протокол исследований одобрен Комиссией по биоэтике при ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».
Y. pestis EV НИИЭГ выращивали при 28 °С в течение 48 ч на питательной среде LB agar, Miller рН 7,2 ± 0,1 (Sigma-Aldrich, USA) как с добавлением ПО в конечной концентрации 60 мкг/мл, что соответствует его терапевтической концентрации при разовом введении человеку, так и без внесения в среду ПО.
Иммуногенность Y. pestis EV НИИЭГ в условиях культивирования с ПО и без оценивали по уровню антител (АТ) к капсульному антигену F1 чумного микроба в сыворотке крови на 21-е сутки после иммунизации подкожно мышей BALB\c дозой 2,5х104 колониеобразующих единиц (КОЕ), морских свинок дозами 103 и 5х103 КОЕ. Определение АТ проводили методом ТИФА с применением тест-системы «ИФА-АТ-Ф1 YERSINIA PESTIS» рег. уд. № ФСР 2012/13946 -101012 (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб»). Учет оптической плотности осуществляли на микропланшетном фотометре Stat Fax-3200 (USA) при длине волны 405 нм.
Защитное действие вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ при культивировании с ПО и без определяли в условиях моделирования чумной инфекции по интегральному показателю ImD50 на морских свинках и мышах линии BALB\c при заражении вирулентными штаммами основного
подвида Y. pestis 231, Y. pestis Р-13268 Вьетнам. Y. pestis EV НИИЭГ вводили подкожно соответствующим группам мышей BALB\c в дозах 2х102, 103, 5х103 и 2,5х104 КОЕ, морским свинкам - 4х101, 2х102, 103, 5х103 КОЕ. Заражение осуществляли подкожно дозой 400 LD50 на 21-е сутки после вакцинации [13]. За инфицированными животными наблюдали в течение 20 суток. Величину ImD50 -количество живых микробных клеток, выраженное в колониеобразующих единицах и способных защитить через 21 сутки 50% взятых в опыт животных от заражения вирулентными штаммами Y. pestis дозой 400 LD50, рассчитывали по методу Кербера в модификации И. П. Ашмарина [14].
Для гистологического исследования морфологический материал фиксировали в 10% водном нейтральном растворе формалина («НеваРеагент», Россия) с дальнейшей обработкой по стандартной схеме [15]. Препараты, окрашенные гематоксилином и эозином (Merck, Германия), анализировали на микроскопе OLYMPUS CX 41 (Olympus, Япония) при увеличении Х 100-400 и цифровой камере VZ-C31S (VideoZavr, Россия) в программе VideoZavr (версия 1.5).
Снятие масс-спектров экстрактов клеток Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных на среде с ПО и без, проводили в автоматическом режиме на масс-спектрометре МюпэАехТМ LT (Bruker Daltonics, Германия). Экстракцию белков осуществляли в соответствии с МР 4.2.0089-14 [16]. В качестве матрицы применяли насыщенный раствор а-циано-4-гидроксикоричной кислоты. Анализируемый диапазон масса/заряд (m/z) составлял 2000-20000 Да. Для получения одиночного масс-спектра использовали 40 импульсов азотного лазера (частота 60 Гц). Сравнение пиков белковых масс-спектров проводили в программе общего доступа mMass [http://www.mmass.org]. Идентификацию пептидов по значению m/z осуществляли с использованием международной базы белков UniProt [http://www.uniprot.org/].
Статистическую обработку данных проводили с использованием стандартного пакета программ
Таблица 1. Титры антител к капсульному антигену F1 чумного микроба в сыворотке крови мышей BALB\c, вакцинированных штаммом Y. pestis EV линии НИИЭГ, культивированном с добавлением азоксимера бромида и без него
Table 1. Antybody titers to F1 Y. pestis capsule antigen in serum BALB\c mice vaccinated with Y. pestis EV NIIEG cultured with and without addition of azoximer bromide
Иммунизирующий штамм, доза (КОЕ) Immunized strain, dose (CFU) Количество животных Number of animals Реципрокные значения среднегеометрического титра Geometric mean reciprocal titers
M ± m
Y. pestis EV НИИЭГ
(LB agar) 10 76 ± 35,43
2,5 x 104
Y. pestis EV НИИЭГ 10 136 ± 36,6 *
( LB agar+ PO)
2,5 x 104
0,9% раствор натрия хлорида PBS 10 < 40
Примечание:*р < 0,05 по отношению к группе сравнения, иммунизированной Y. pestis EV НИИЭГ. Note:*p < 0.05 in comparison with vaccinated mice Y. pestis EV NIIEG without PO
Original Articles
Таблица 2. Влияние азоксимера бромида в условиях культивирования на защитное действие вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV НИИЭГ
Table 2. The influence of azoximer bromide under cultivation on the protective efficacy of vaccine strain Y. pestis EV line NIIEG
Иммунизирующий штамм Immunizing strain
Заражающий штамм. Y. pestis EV НИИЭГ ( LB agar, Miller рН 7,2) Y. pestis EV НИИЭГ ( LB agar, Miller рН 7,2 + PO)
Доза Challenge strain. Dose Иммунизирующая доза (КОЕ) Immunizing dose (CFU) Число животных (выжившие/ общее кол-во) Number of animals (survived/ inoculated ImD50 КОЕ (CFU) Иммунизирующая доза (КОЕ) Immunizing dose (CFU) Число ж-х (выжив-шие/ общее кол-во) Number of animals (survived/ inoculated ImD50 КОЕ (CFU)
Y. pestis 231 400 LD50 2x102 1x103 5x103 2,5x104 0/10 0/10 1/10 3/10 2,9 х 104 (29000 КОЕ) 2x102 1x103 5x103 2,5x104 4/10 4/10 2/10 10/10 0,22 х104* (2231 КОЕ)
Y. pestis 13268 (Вьетнам) 400 LD5O 2x102 1x103 5x103 2,5x104 0/10 0/10 2/10 4/10 2,1 х 104 (21000 КОЕ) 2x102 1x103 5x103 2,5x104 6/10 8/10 4/10 10/10 0,06 х104* (616 КОЕ)
Примечание:*р < 0,05 при сравнении с вакцинированными Y. pestis EV НИИЭГ, выращенным на LB agar, Miller рН 7,2 ± 0,1 без ПО; Note:*p < 0.05 in comparison with vaccinated mice Y. pestis EV NIIEG without PO
Таблица 3. Протективные свойства вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, выращенного с добавлением азоксимера бромида, после 1 года хранения при 4 °С
Table 3. The protective properties of the vaccine strain Y. pestis EV line NIIEG, grown with the addition of azoximer bromide after 1 year of storage (4 °С)
Иммунизирующий Заражающий штамм Без хранения No storage 1 год при 4 °С After 1 year of storage (4 °С)
штамм, доза (КОЕ) Immunizing strain, dose (CFU) Y. pestis 231, доза Challenge strain Y. pestis 231, dose Число животных (павшие/ общее кол-во) Number of animals (Dead/ inoculated % выживших Survival (%) Число животных (павшие/ общее кол-во) Number of animals (Dead/ inoculated % выживших Survival (%)
Y. pestis EV НИИЭГ ( LB agar + PO) 1x105 КОЕ (CFU) 400 LD50 0/8 100 % 0/8 100 %
0,9% раствор натрия хлорида PBS 400 LD50 10/10 0 — —
0,9% раствор натрия хлорида PBS 10 LD50 10/10 0 - -
Microsoft Office Excel 2016. Взаимосвязь между переменными определяли с помощью рангового корреляционного анализа по Спирмену. Данные представляли в виде М ± m, где М - среднее значение, m - средняя квадратическая ошибка средней арифметической. Значимость различий между группами оценивали с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия между группами наблюдения считали статистически значимыми при p < 0,05.
Результаты и обсуждение
Как известно, ПО характеризуется быстрым всасыванием и высокой скоростью распределения
по всем органам и тканям организма, проникает через гематоэнцефалический и гематоофталь-мический барьеры. Биодоступность препарата составляет более 90% при парентеральном введении, а максимальная концентрация в крови достигается через 40 минут. Период полувыведения ПО для разного возраста - от 36 до 65 часов [17]. Также ПО способен блокировать растворимые токсические вещества и микрочастицы, выводить из организма токсины, соли тяжелых металлов, ингибировать перекисное окисление липидов как за счет перехвата свободных радикалов, так и посредством элиминации каталитически активных ионов Fe2+ [18].
Original Articles
Рисунок 1. Мыши BALB\c на 7 сутки после вакцинации штаммом Y. pestis EV НИИЭГ, выращенным с добавлением азоксимера бромида, в дозе 2,5x104 КОЕ. А - лимфатический узел, активация паракортикальной зоны; В -селезенка, гиперплазия Т-зон. Окр. Гематоксилин-Эозин. Ув. х100
Figure 1. Mice BALB\c on 7 day after vaccination with 2,5 x 104 CFU of Y. pestis EVNIIEG, cultivated on LB agar with the addition of azoximer bromide (PO). A - lymph node, activation of the paracortic zone. B - spleen, T-zone hyperplasia. Stained with hematoxylin and eosin. Original magnification, x100 (main images). Data are representative of three experiments
Одновременное внутривенное введение ВЧЖ и ПО кроликам и морским свинкам индуцировало выявление антител к капсульному антигену чумного микроба FI в более ранние сроки и повышало протективную активность данной вакцины [19]. Эффективность сочетанного применения ПО и ВЧЖ может быть обусловлена не только его иммуностимулирующим действием, но и непосредственным воздействием на размножающиеся в вакцинированном организме клетки вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ.
В настоящем исследовании проведено изучение возможности прямого действия ПО на биологические свойства Y. pestis EV НИИЭГ в условиях культивирования на плотной питательной среде. Выбор питательной среды LB agar, Miller рН 7,2 ± 0,1 обусловлен сравнительно близким по данным транскриптомного анализа характером роста чумного микроба в плазме крови человека [20], что позволяет более адекватно экстраполировать результаты исследований на процессы иммунопато-генеза в организме людей при чуме.
Характеристики антигенной активности культур Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных на LB агаре с ПО и без, при вакцинации мышей BALB\c представлены в таблице 1. Установлено, что уровень антител к капсульному антигену чумного микроба F1 в 1,7 раза выше в группе животных, иммунизированных
вакцинным штаммом Y. pestis EV НИИЭГ, выращенным на питательной среде с ПО. Аналогичные по вектору достоверные изменения титров антител к F1 чумного микроба наблюдались у другого вида биомодельных животных - морских свинок. Зарегистрировано 4-кратное повышение титров антител к F1 чумного микроба в группе животных, иммунизированных Y. pestis EV НИИЭГ, выращенным на среде с ПО, по сравнению с уровнем антител, детектируемым у морских свинок, иммунизированных вакцинным штаммом Y. pestis EV НИИЭГ, выращенным в стандартных условиях. Реципрокные значения среднегеометрического титров антител к F1 чумного микроба в сыворотке крови морских свинок, вакцинированных 1000 КОЕ и 5000 КОЕ Y. pestis EV НИИЭГ, выращенным на LB agar с добавлением ПО и без составили 266,6 ± 75,4; 640 ± 0,1 и 66,7 ± 18,8; 133,3 ± 37,1 соответственно при p < 0,05. Выявлена высокая степень прямой связи между наличием ПО в среде культивирования и уровнем АТ к капсульному антигену чумного микроба F1 (r = 1,0, р < 0,05).
Нами проведена оценка влияния азоксимера бромида на протективные свойства вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ по интегральному показателю ImD50 при моделировании бубонной формы чумы на двух видах экспериментальных животных - мышах линии BALB\c и морских свинках.
Original Articles
Рисунок 2. MALDI-TOF MS профили белковых экстрактов Y. pestis EV НИИЭГ, полученных с добавлением азоксимера бромида
Figure 2. MALDI-TOF MS profiles of protein extracts Y. pestis EV NIIEG obtained with the addition of azoximer bromide
Original Articles
Установлено, что введение ПО в состав среды культивирования приводило к достоверному повышению защитного действия вакцинного штамма Y. pestis БУ НИИЭГ у мышей BALB\c (табл. 2). Регистрировалось значимое (р < 0,05) уменьшение величины 1тЮ50 для культур вакцинного штамма У. pestis БУ НИИЭГ, выращенных на среде с добавлением ПО, по сравнению с 1тЮ50 для У. pestis БУ НИИЭГ в стандартных условиях культивирования. Отмечалось снижение 1тЮ50 в 13 раз при заражения высоковирулентным штаммом У. pestis 231, применяющимся в качестве заражающего тест-штамма при контроле вакцины чумной живой, и в 30 раз при инфицировании штаммом основного подвида У. pestis Р -13268 (Вьетнам). Введение ПО в состав среды культивирования приводило также к достоверному повышению защитного действия У. pestis БУ НИИЭГ при моделировании бубонной формы чумы у морских свинках. Наблюдалось значимое (р < 0,05) уменьшение величины 1тЮ50 для вакцинного штамма У. pestis БУ НИИЭГ, выращенного на среде с добавлением ПО, по сравнению с 1тЮ50 для У. pestis БУ НИИЭГ в стандартных условиях культивирования (151 КОЕ и 448 КОЕ соответственно). Длительное хранение (1 год) при температуре 4 °С не влияло на протек-тивные свойства вакцинного штамма У. pestis БУ НИИЭГ, выращенного на среде с добавлением ПО (табл. 3).
Морфологические исследования органов мышей BALB\c, иммунизированных У. pestis БУ НИИЭГ, выращенным на среде с добавлением ПО и без, в дозах 5х103 и 2,5х104 КОЕ, не выявили грубых изменений. При гистологическом исследовании на фоне отсутствия признаков повреждения тканей регистрировали гиперпластические процессы в лимфоидных органах, причем у животных, иммунизированных У. pestis БУ НИИЭГ, выращенном на среде с ПО, выраженная активация лимфатических структур начиналась уже с 7-х суток. Отмечалась более выраженная активация паракортикальных зон в лимфатических узлах и раннее формирование активных Т-зон в селезенке (рис. 1).
Сравнительный анализ масс-спектрометричес-ких профилей У. pestis БУ НИИЭГ, выращенных на среде с ПО и без, показал, что основное количество зафиксированных пиков локализовано в интервале значений масс 2400-12000 Да (рис. 2). На всех масс-спектрах встречались гомологичные
сигналы, отличающиеся по абсолютной интенсивности (m/z ± 5 Да): 2459, 2823, 3592, 3691, 4347, 4829, 5424, 5475, 6042, 6238, 6411. Введение ПО в среду культивирования приводило к резкому снижению интенсивности пика (m/z 3061), характерного для штаммов Y. pestis основного подвида, имеющих плазмиду pYP (pPst) [21,22], исчезновению отдельных сигналов (m/z 3760, 6585) и появлению новых (m/z 2759, 3533). Пик со значением m/z 2759 соответствует пептиду, состоящему из 23 аминокислотных остатков, который идентифицируется в базе данных UniProtKB как фрагмент гипотетической цинк-связывающей дегидрогена-зы, сигнал m/z 3533 - как не охарактеризованный белок, состоящий из 34 аминокислотных остатков, показанный для Y. pestis biovar Orientalis str. PEXU2. Изменения количественных и качественных характеристик на масс-спектрах Y. pestis EV НИИЭГ, выращенного на среде с ПО, сопровождались повышением его иммуногенной и протектив-ной активности.
Таким образом, в данной работе экспериментально обоснована возможность использования азоксимера бромида для повышения иммуногенной и протективной активности вакцинного штамма чумного микроба. Показано, что внесение ПО в среду культивирования вызывает значимое повышение иммуногенности вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, характеризующееся ростом продукции антител к капсульному антигену F1 чумного микроба и выраженным усилением защитного действия вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ при моделировании бубонной формы чумы на двух видах экспериментальных животных -мышах линии BALB\c и морских свинках при отсутствии негативного влияния на безвредность вакцинного штамма. Разработанный подход позволяет получить культуру вакцинного штамма чумного микроба, обладающего высокой иммуногенностью, без использования живого организма (анимализации), клеточных культур. Вопрос о молекулярных механизмах этого воздействия является предметом дальнейших исследований.
Исследование выполнено при поддержке бюджетного финансирования в рамках темы НИР № АААА-А16-118011590103-А.
The research was carried out with the support of budgetary funding within the framework of research project No. АААА-А16-118011590103-А.
Литература
О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2019 году: Государственный доклад. М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2020. 299 с.
Shi L., Yang G., Zhang Z, et al. Reemergence of human plague in Yunnan, China in 2016// PLoS ONE. 2018. Vol. 13, N 6:e0198067. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0198067 Kehrmann J., Popp W., Delgermaa B., et al. Two fatal cases of plague after consumption of raw marmot organs. Emerg Microbes Infect. 2020. Vol. 9, N 1. P. 1878-1880. Doi 10.1080/22221751.2020.1807412
Профилактика чумы. Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.7.3465-17. Бюллетень нормативных и методических документов Госсанэпиднадзора. 2017. № 4. С. 3-21.
WHO Workshop Meeting Report«Efficacy trials of Plague Vaccines: endpoints, trial design, site selection». 2018, INSERM, Paris, 12 p. https://www.who.int/blueprint/what/norms-stan-dards/PlagueVxeval_FinalMeetingReport.pdf?ua=1.
Demeure C.E., Dussurget O., Fiol G.M., et al. Yersinia pestis and plague: an updated view on evolution, virulence determinants, immune subversion, vaccination, and diagnostics// Genes and Immunity. 2019. Vol. 20. P. 357-370. https://doi.org/10.1038/s41435-019-0065-0
Балахонов С. В., Попова А. Ю., Мищенко А. И. и др. Случай заболевания человека чумой в Кош-Агачском районе Республике Алтай в 2015 г. Сообщение 1. Клинико-
эпидемиологические и эпизоотологические аспекты. Проблемы особо опасных инфекций. 2016. № 1. С. 55-60. DO110.21055/0370-1069-2016-1-55-60
Петров Р. В., Хаитов Р. М., Некрасов А. В. и др. Полиоксидоний: Механизм действия и клиническое применение. Медицинская иммунология. 2000. Т. 2, № 3. С. 271-278.
4
5
6
7
8
Original Articles
9. Омельченко Н. Д., Иванова И. А., Беспалова И. А., Филиппенко А. В. Иммуномодуляторы и специфическая профилактика инфекционных болезней. Проблемы особо опасных инфекций. 2017. № 3. С. 21-26. DO110.21055/0370-1069-2017-3-21-2.
10. Щуковская Т. Н., Курылина А. Ф., Шавина Н. Ю., Бугоркова С. А. Влияние полиоксидония, Poly(I:C), даларгина на защитное действие вакцинного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ при экспериментальной чуме. Российский иммунологический журнал. 2020. Т. 23, № 1. С. 41-50. https://doi.org/10.46235/1028-7221-005-IOP.
11. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности): Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.3118-13. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. 2014. https://www.garant.ru/products/ipo/prime/doc/70563038/
12. World Health Organization. Vaccine Supply and Quality Unit. Manual of laboratory methods for testing of vaccines used in the WHO Expanded Programme on Immunization. World Health Organization. U1997.221 p. https://apps.who.int/iris/handle/10665/63576
13. МУ 3.3.1.1113-02. Основные требования к вакцинным штаммам чумного микроба: Методические указания. М.: Минздрав России. 2002.. DOI: 10.13140/RG.2.1.1468.6246
14. Ашмарин И. П., Воробьев А. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз; 1962. https://search.rsl.ru/ru/record/01005954123.
15. Коржевский Д. Э., Гиляров А. В. Основы гистологической техники. СПб:СпецЛИТ; 2010.
16. Использование метода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-ToF MS) для индикации и идентификации возбудителей I-II групп патогенности: Методические рекомендации. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. 2015. https://www.rospotrebnadzor.ra/documents/details.php?ELEMENT_ID=4693
17. Некрасов А. В., Пучкова Н. Г. Полиоксидоний: основы синтеза и свойства // Иммунология. 2002. Т. 23, № 6. С. 329-333.
18. Пинегин Б. В., Некрасов А. В., Хаитов Р. М. Иммуномодулятор полиоксидоний: механизмы действия и аспекты клинического применения // Цитокины и воспаление. 2004. Т. 3, № 3. С. 41-47.
19. Пономарева Т. С., Дерябин П. Н., Каральник Б. В. и др. Влияние полиоксидония на иммуногенную и протективную активность живой чумной вакцины // Иммунология. 2014. Т. 35, № 5. С. 286-290.
20. Chauvaux S., Dillies M.A., Marceau M., et al. In silico comparison of Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis transcriptomes reveals a higher expression level of crucial virulence determinants in the plague bacillus. International Journal of Medical Microbiology. 2011. Vol. 301, N 2. P. 105-116. doi:10.1016/j.ijmm.2010.08.013.
21. Спицын А. Н., Уткин Д. В., Щербакова Н. Е. и др. MALDI-TOF масс-спектрометрический анализ штаммов возбудителя чумы. Проблемы особо опасных инфекций. 2016. № 2. С. 91-94. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2016-2-91-94
22. Котенева Е. А., Котенев Е. С., Калинин А. В. и др. Протеомное профилирование штаммов Yersinia pestis, циркулирующих на территории природных очагов Северного Кавказа и Закавказья. Журн. микробиол. 2019. № 4. С. 18-25. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-4-18-25
References
1. On the state of sanitary and epidemiological wellbeing of the population in the Russian Federation in 2019: State report. M.: Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing. 2020:299.
2. Shi L, Yang G, Zhang Z, et al. Reemergence of human plague in Yunnan, China in 2016. PLoS ONE. 2018;13(6):e0198067. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0198067
3. Kehrmann J, Popp W, Delgermaa B, et al. Two fatal cases of plague after consumption of raw marmot organs. Emerg Microbes Infect. 2020;9(1):1878-1880. Doi 10.1080/22221751.2020.1807412
4. Prevention of plague. Sanitary - epidemiological Regulations SP 3.1.7.3465-17. Bulletin of regulatory and methodical documents of Gossanepidnadzor, 2017;(4):3-2. https://mega-norm.ru/Data2/1/4293744/4293744127.pdf
5. Efficacy trials of Plague Vaccines: endpoints, trial design, site selection: WHO Workshop Meeting Report, April 23, 2018:INSERM, Paris. Available at: https://www.who.int/blueprint/ what/norms-standards/PlagueVxeval_FinalMeetingReport.pdf?ua=1. Accessed: 18 June 2021.
6. Demeure CE, Dussurget O, Fiol GM, et al. Yersinia pestis and plague: an updated view on evolution, virulence determinants, immune subversion, vaccination, and diagnostics. Genes and Immunity. 2019;20:357-370. https://doi.org/10.1038/s41435-019-0065-0
7. Balakhonov SV, Popova AYu, Mishchenko AI, et al. Case of Human Infection with Plague in the Kosh-Agach Region of the Republic of Altai in 2015. Communication 1. Clinical-Epidemi-ological and Epizootiological Aspects. Problems of Particularly Dangerous Infections. 2016;(1):55-60 (In Russ). DOI 10.21055/0370-1069-2016-1-55-60
8. Petrov RV, Khaitov RM, Nekrasov AV, et al. Polyoxidonium - mechanisms of action and clinical relevance. Medical Immunology. 2000;2(3):271-278 (In Russ).
9. Omel'chenko ND, Ivanova IA, Bespalova IA, Filippenko AV. Immunomodulators and specific prophylaxis of infectious diseases. Problems of Particularly Dangerous Infections. 201; (3):21-26 (In Russ). DO110.21055/0370-1069-2017-3-21-2.
10. Shchukovskaya TN, Kurylina AF, Shavina NYu, Bugorkova SA. Influence of polyoxidonium, Poly(I:C), dalargin on the protective efficacy of Yersinia pestis vaccine strain EV line NIIEG in experimental plague. Russian Journal of Immunology. 2020;23(1):41-50 (In Russ). https://doi.org/10.46235/1028-7221-005-IOP
11. Safety of work with microorganisms in pathogenic groups I-II (hazard): sanitary-epidemiological rules SP 1.3.3118-13. Moscow: Federal Center of hygiene and epidemiology, 2014. https://www.garant.ru/products/ipo/prime/doc/70563038/
12. World Health Organization. Vaccine Supply and Quality Unit. Manual of laboratory methods for testing of vaccines used in the WHO Expanded Programme on Immunization. World Health Organization, W99M https://apps.who.int/iris/handle/10665/63576
13. MU 3.3.1.1113-02. Main requirements for vaccine strains of the plague pathogen: Methodological Guidelines. Moscow: Federal Centre of State Epidemic Surveillance of Ministry of Health of Russian Federation, 2002. DOI: 10.13140/RG.2.1.1468.6246
14. Ashmarin IP, Vorobjov AA. Statistical methods in microbiological research. Leningrad: Medgiz, 1962 (In Russ). https://search.rsl.ru/ru/record/01005954123
15. Korzhevsky DE, Gilarov AV. Basics of histological technology. St. Petersburg: SpecialLIT, 2010 (In Russ).
16. Use of the method of time-long mass spectrometry with matrix-activated laser desorbsion/ionization (MALDI-ToF MS) to indicate and identify pathogenic pathogens I-II: Methodical recommendations. M.: Federal Center for Hygiene and Epidemiology of Rospotrebnadzor, 2015. https^/www.rospotrebnadzor.ru/documents/details.php?ELEMENT_ID=4693
17. Nekrasov AV, Puchkova NG. Polyoxidonium: the basics of synthesis and properties. Immunology. 2002;23(6):329-333 (In Russ).
18. Pinegin BV, Nekrasov AV, Khaitov RM. Immunomodulator polyoxidonium: mechanism of action and aspects of clinical application. Cytokines and Inflammation. 2004;3(3):41-47.
19. Ponomareva TS, Deryabin PN, Karal'nik BV, et al. The impact of polyoxidonium on immunogenic and protective activity alive plague vaccine. Imm unology. 2014;35(5):286-290.
20. Chauvaux S, Dillies MA, Marceau M, et al. In silico comparison of Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis transcriptomes reveals a higher expression level of crucial virulence determinants in the plague bacillus. International Journal of Medical Microbiology. 2011;301(2):105-116. doi:10.1016/j.ijmm.2010.08.013
21. Spitsyn AN, Utkin DV, Shcherbakova N.E, et al. MALDI-TOF Mass-Spectrometry Analysis of Plague Agent Strains. Problems of Particularly Dangerous Infections. 2016;(2):91-94 (In Russ.). https://doi.org/10.21055/0370-1069-2016-2-91-94
22. Koteneva EA, Kotenev ES, Kalinin AV, et al. Proteomic profiling of Yersinia pestis strains circulating in the area of natural plague foci of North Caucasus and Transcaucasia. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2019;(4):18-25. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-4-18-25
Об авторах
About the Authors
• Татьяна Николаевна Щуковская - д. м. н., профессор, главный научный сотрудник отдела иммунологии, ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора. +7 (909) 330-25-83, rusrapi@microbe.ru, tatyanaschuk@mail.ru. ОРСЮ IО: ЬИрэ:// orcid.org/0000-0001-8995-0894.
• Анастасия Юрьевна Гончарова - к. м. н., научный сотрудник отдела иммунологии, ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора. +7 (927) 110-83-55, rusrapi@ microbe.ru. ОРСЮ Ю: https://orcid.org/0000-0002-9994-7936.
• Светлана Александровна Бугоркова - д. м. н., и.о. зав. отделом иммунологии, ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора. rusrapi@microbe.ru. ОРСЮ Ю: https:// orcid.org/0000-0001-7548-4845.
• Ольга Михайловна Кудрявцева - к. б. н., старший научный сотрудник отдела иммунологии, ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора. +7 (905) 369-71-99, rusrapi@microbe.ru. ОРСЮ Ю: https://orcid.org/0000-0002-9894-3394.
• Наталья Евгеньевна Щербакова - научный сотрудник отдела диагностики инфекционных болезней, ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора. +7 (8452) 51-52-11, hainl@yandex.ru. ОРСЮ: 0000-0003-3261-6128.
• Адиля Саберьжановна Абдрашитова - к. б. н., ведущий научный сотрудник отдела диагностики инфекционных болезней, ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспо-требнадзора. +7 (8452) 51-52-11, Abdrashitova_AS@microbe.ru. ОРСЮ: 0000-0003-1803-4156.
Поступила: 02.07.2021. Принята к печати: 20.11.2021.
Контент доступен под лицензией СС БУ 4.0.
• Tatiana N. Shchukovskaya - Dr. Sci. (Med.), Professor, Head Researcher, Department of Immunology, Federal Government Health Institution «Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe», Saratov, Russia. +7 (909) 330-25-83, rusrapi@microbe.ru, tatyanaschuk@mail.ru. ORCID iD: https://orcid.org/0000-0001-8995-0894.
• Anastasia Yu. Goncharova - Cand. Sci. (Med.), Researcher, Department of Immunology, Federal Government Health Institution «Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe», Saratov, Russia. +7 (927) 110-83-55, rusrapi@ microbe.ru. ORCID ID: https://orcid.org/0000-0002-9994-7936.
• Svetlana A. Bugorkova - Dr. Sci. (Med.), Head, Department of Immunology, Federal Government Health Institution «Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe», Saratov, Russia. rusrapi@microbe.ru. ORCID iD: https://orcid. org/0000-0001-7548-4845.
• Olga M. Kudryavtseva - Cand. Sci. (Bio.), Senior Researcher, Department of Immunology, Federal Government Health Institution «Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe», Saratov, Russia. +7 (905) 369-71-99, rusrapi@ microbe.ru. ORCID iD: https://orcid.org/0000-0002-9894-3394.
• Natalya E. Shcherbakova - researcher at the Department of Diagnostics of Infectious Diseases, Federal Government Health Institution «Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe», Saratov, Russia. +7 (845-2) 51-52-11, hainl@yandex.ru. ORCID: 0000-0003-3261-6128.
• Adilya S. Abdrashitova - Cand. Sci. (Bio.), leader researcher at the Department of Diagnostics of Infectious Diseases, Federal Government Health Institution «Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe», Saratov, Russia. (845-2) 51-52-11, Abdrashitova_AS@microbe.ru. ORCID: 0000-0003-18034156.
Received: 02.07.2021. Accepted: 20.11.2021.
Creative Commons Attribution CC BY 4.0.
