CC BY
46
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2019
Ярков С.П., Третьяков С.И., Шаулина Е.К., Бровкина А.Н., Храмов Е.Н.
ПОВЫШЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ ТЕСТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ И СТАФИЛОКОККОВОГО ЭНТЕРОТОКСИНА ТИПА В НА ОСНОВЕ УСИЛЕНИЯ СЕРЕБРОМ И ИНСТРУМЕНТАЛЬНОЙ РЕГИСТРАЦИИ
Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения» Федерального медико-биологического агентства России, 125424, г Москва
Цель исследования. Разработка приемов повышения чувствительности иммунохроматографи-ческих тестов (ИХТ), предназначенных для выявления патогенных микроорганизмов и токсинов, за счет усиления контраста иммунохроматограмм и последующей приборной регистрации результатов анализа с помощью рефлектометра.
Материал и методы. В работе использовали ИХТ для выявления спор возбудителя сибирской язвы и стафилококкового энтеротоксина типа В (СЭБ), в которых в качестве маркера применяли наночастицы коллоидного золота (НКЗ). Для усиления контраста иммунохроматограмм применяли проявляющий раствор, состоящий из 1,5% гидрохинона и 0,15% нитрата серебра в 0,5 Млимонной кислоте. Регистрацию результатов проводили с помощью видеоцифрового анализатора Рефлеком, позволяющего количественно сравнивать интенсивность аналитической зоны теста для различных концентраций аналита. Полученные зависимости аппроксимировали экспоненциальной зависимостью первого порядка и вычисляли чувствительность иммунохрома-тографического теста.
Результаты. Воздействие на иммунохроматограмму проявляющего раствора приводило к осаждению на НКЗ атомов серебра, что увеличивало контраст аналитической и контрольной зон ИХТ. Усиление контраста аналитической и контрольной зон ИХТ позволяло визуально выявлять споры сибирской язвы и СЭБ с чувствительностью, превышающей чувствительность обычных ИХТ в 4 и 6 раз. После проведения рефлектометрии, полученные зависимости интенсивности окрашивания аналитической зоны ИХТ от концентрации аналита, аппроксимировали с помощью функции У=Уд+А1е(-Х/,1>, где Х- концентрация аналита, а У0, Ар t1 являются параметрами. Коэффициенты ковариации R2 близкие к 1,0 свидетельствуют о достоверности выбора аппроксимирующей функции. На основании полученных данных были вычислены нижние пределы детекции (чувствительность выявления) спор сибирской язвы и СЭБ. Выигрыш в чувствительности обнаружения составил 27 и 75 раз для спор возбудителя сибирской язвы и СЭБ соответственно, по сравнению с визуальной регистрацией обычных иммунохроматограмм. Проведено сравнение иммунохроматографического анализа с твердофазным иммунофермент-ным анализом (ТИФА).
Выводы. Разработанная процедура увеличения чувствительности ИХТ позволяет выявлять 3,7х104 м.к./мл спор возбудителя сибирской язвы и 200 пг/мл СЭБ, что превышает чувствительность ТИФА для этих аналитов. Время анализа составило 45 мин. Хранение компонентов им-мунохроматографической тест-системы возможно при комнатной температуре. Предложен состав экспериментальной иммунохроматографической тест-системы повышенной чувствительности.
Ключевые слова: возбудитель сибирской язвы; стафилококковый энтеротоксин типа В; иммунохроматография; усиление серебром.
Для цитирования: Ярков С.П., Третьяков С.И., Шаулина Е.К., Бровкина А.Н., Храмов Е.Н. Повышение чувствительности иммунохроматографических тестов для выявления возбудителя сибирской язвы и стафилококкового энтеротоксина типа В на основе усиления серебром и инструментальной регистрации. Медицина экстремальных ситуаций. 2019; 21(3): 454-463.
Для корреспонденции: Ярков Сергей Петрович, доктор биологических наук, старший научный сотрудник, доцент, начальник отдела спектральных методов анализа ФГУП «ГосНИИБП», 125424, г. Москва. Е-mail: niibp@dol.ru
MEDICAL AND BIOLOGICAL SCIENCES
Yarkov S.P., Tretyakov S.I., Shaulina E.K., Brovkina A.N., Khramov E.N.
ELEVATION THE SENSITIVITY OF IMMUNOCHROMATOGRAPHIC TESTS TO IDENTIFY THE CAUSATIVE AGENT OF ANTHRAX AND STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN TYPE B BASED ON SILVER AMPLIFICATION AND INSTRUMENTAL RECORDING
State Research Institute of Biological Engineering of the Federal Medical-Biological Agency of Russia, Moscow, 125424, Russian Federation
Aim of the dtudy. Development of methods for the elevation of sensitivity of immunochromatographic tests (ICT), designed to identify pathogenic microorganisms and toxins, by enhancing contrast of im-munochromatograms and subsequent instrumental recording the analysis results using a reflectometer. Material and methods. In actual work, ICT was used to identify anthrax pathogen spores and type B staphylococcal enterotoxin (SEB), in which colloidal gold nanoparticles (GNP) were used as markers. To enhance the contrast of immunochromatograms, a developing solution was used consisting of 1.5% hydroquinone and 0.15% silver nitrate in 0.5 M citric acid. The results were recorded using a Reflecom video-digital analyzer, which allows a quantitative comparison of the intensities in an ICT analytical zone for different analyte concentrations. The data obtained were approximated by exponential firstorder dependence, and the sensitivity of the immunochromatographic test was calculated. Results. The developing solution applied at immunochromatogram led to the precipitation of silver atoms on the GNP, leading to an increase the contrast of the analytical and control ICT zones. Strengthening the contrast ICT analytical and control zones allowed identifying visually anthrax spores and SEB with sensitivity exceeding the sensitivity of conventional ICT by 4 and 6 times. After reflectometry, the obtained dependences of the intensity of staining ICT analytical zone on the analyte concentration were approximated using the function Y = Y0 + Aje(-X/t1>, where X - is the concentration of analyte, and Y0, A1, tj are the parameters that are determined during the approximation. The covariance coefficient R2 was close to 1.0, testifying to the reliability of the choice of the approximating function. Based on the experimental data, the lower limits of detection (detection sensitivity) for anthrax spores and SEB were calculated. The gain in detection sensitivity accounted for 27 and 47 times for anthrax and SEB respectively, compared to visual recording of conventional immunochromatograms. A comparison between proposed format of immuno-chromatographic assay and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed. Conclusions. The proposedformatfor increasing in the sensitivity of ICT makes it possible to detect 3.7x104 m.c./ml of anthrax pathogen spores and 200 pg/ml of SEB, which exceeds the ELISA sensitivity for these analytes. The analysis time amounted to 45 minutes. Test system components storage is possible at room temperature. The composition of the experimental immunochromatographic test of high sensitivity is proposed. Keywords: anthrax pathogen, staphylococcal enterotoxin type B, immunochromatography, silver enhancement.
For citation: Yarkov S.P., Tretyakov S.I., Shaulina E.K., Brovkina A.N., Khramov E.N. Elevation the sensitivity of immunochromatographic tests to identify the causative agent of anthrax and staphylococcal enterotoxin type B based on silver amplification and instrumental recording. Meditsina ekstremal'nykh situatsiy (Medicine of Extreme Situations, Russian journal) 2019; 21(3): 454-463. (In Russian).
For correspondence: Sergey P. Yarkov, MD, Ph.D., DSci., Senior Researcher / Associate Professor, Head of the Department of Spectral Analysis Methods State Research Institute of Biological Engineering of the Federal Medical-Biological Agency, Moscow, 125424, Russian Federation E-mail: niibp@dol.ru
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgments. The study had no sponsorship. Received: April 17, 2019 Accepted: September 09, 2019
Введение
Иммунохроматографические тесты (ИХТ) широко применяются как экспресс-метод индикации патогенных бактерий, вирусов и токсинов в окружающей среде и при диагностике инфекционных заболеваний [1-3]. Несомненными преимуществами ИХТ являются: про-
ведение анализа в одну стадию без сложного лабораторного оборудования, компактность аналитической системы, возможность хранения при комнатной температуре в течение нескольких лет, без существенной утраты аналитических характеристик, короткое время анализа, визуальная оценка результата. Чувствительность ИХТ, как правило, лежит в диапазоне
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
105-106 м.к./мл для патогенных бактерий и 10-100 нг/мл для бактериальных и растительных токсинов, что примерно на порядок хуже, чем у метода твердофазного иммуноферментно-го анализа (ТИФА). Задача повышения чувствительности иммунохроматографического анализа (ИХрА), при сохранении простой процедуры его проведения, весьма актуальна [4]. Известны различные способы повышения чувствительности ИХрА - применение новых маркеров для конъюгации с антителами [1,5], инструментальных методов регистрации результатов, таких как рефлектометрия или флуориметрия [2,5]. Одним из путей повышения чувствительности ИХрА является повышение контраста аналитической и контрольной зон ИХТ за счет осаждения атомов серебра на наночастицах коллоидного золота при химическом восстановлении солей серебра [6,7]. Эффективность этого приема, получившего в англоязычной научной литературе название silver enhancement (усиление серебром), была продемонстрирована на примере выявления охратоксина [8], вирусов растений [9-12], бактерий Ralstonia solnacearum [13], Helicobacter pilory [14], сальмонелл [15], энтеропатогенного штамма E. zoli O157:H7 [16]. Работы, посвященные выявлению, бактерий -возбудителей особо опасных инфекций и бактериальных токсинов методом ИХрА с усилением серебром, авторам неизвестны.
Цели настоящей работы - повышение чувствительности ИХрА за счет усиления серебром, с сохранением формата анализа и проведения минимума дополнительных операций, а также демонстрация эффективности инструментальной регистрации результатов с последующей математической обработкой кривых титрования антигена для повышения чувствительности ИХрА в целом. В качестве объектов исследования были выбраны споры возбудителя сибирской язвы B. anthracis и стафилококковый энтеротоксин типа В (СЭБ). Оба объекта исследования имеют прикладное значение. B. anthracis является возбудителем особо опасной инфекции человека и животных, исключительно стойким к внешним воздействиям. Споры микроорганизма хорошо сохраняются во внешней среде десятилетиями без утраты патогенности, например в скотомогильниках.
456
СЭБ вызывает отравления при заражении патогенными стафилококками, поступающими в организм через воду и пищу.
Материал и методы
Изготовление ИХТ осуществляли согласно схеме, описанной нами ранее [2,17]. Впитывающие и конъюгатные подложки, а также аналитическая мембрана теста помещались в пластиковую оправу с круглым отверстием для нанесения образца и прямоугольным окном, в котором наблюдались аналитическая и контрольная зоны теста (рис. 1). Мультимем-бранный композит был модифицирован таким образом, чтобы течение элюирующей жидкости по мембранам в определенный момент прекращалось, за счет использования короткой впитывающей подложки. Наночастицы коллоидного золота (НКЗ), средним диаметром 25 нм для конъюгирования с антителами, получали восстановлением 0,01% раствора зо-лотохлористоводородной кислоты НАиС14 цитратом натрия [17]. Стабилизирующую концентрацию иммуноглобулинов для полученного золя золота, соответствующую точке адсорбционного насыщения поверхности частиц золя данными антителами, определяли визуально по агрегации и выпадению в осадок частиц золя. Конъюгировали полученный золь с МКА SA26, против антигенов возбудителя сибирской язвы. Аналитическую зону ИХТ для выявления спор возбудителя сибирской язвы формировали из кроличьих ПКА против спор В. anthracis, а контрольную зону - из антител кролика против иммуноглобулинов мыши.
В случае ИХТ для выявления СЭБ использовали мышиные МКА S222 для получения конъ-югата золя золота и МКА S643 для внесения в аналитическую зону ИХТ, в контрольную зону вносили антитела кролика против иммуноглобулинов мыши.
Изучение аналитических характеристик проводили на вакцинном штамме возбудителя сибирской язвы СТИ-1 и препарате СЭБ, полученном из ГНЦ «Прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора».
Регистрацию аналитического эффекта проводили как визуально по появлению (отсутствию) окрашенных полос в аналитической и контроль-
MEDICAL AND BIOLOGICAL SCIENCES
i{0k
5WC
/r
HO1
Ж i-10* 1510* г Ч 5\ог Но1 sé Но* (■0s
п - >2 Я
i Сл 0 m m \ i ¡ft
Рис. 1. Внешний вид иммунохроматограмм вакцинного штамма возбудителя сибирской язвы.
а - иммунохроматография, регистрация через 20 мин; б - проявление полученной иммунохроматограммы, регистрация через 15 мин. На поверхности пластиковой оправы указана концентрация микробных клеток в м.к./мл;
«К» - холостая проба.
ной зонах теста, так и с помощью видеоцифрового анализатора иммунохроматограмм Рефлеком и программы Видеотест 1.6® (ООО «Синтеко-Комплекс», Россия). Прибор регистрировал величину окрашивания аналитической и контрольной зон ИХТ в условных единицах. Измерения для каждой концентрации микробных клеток, токсинов и отрицательных контролей проводили пятикратно, вычисляли среднее арифметическое и определяли погрешность измерения с использованием коэффициентов Стьюдента (tp=2,78 при n = 5) с 95% надежностью. Графические построения и расчеты проводили с помощью программы Microcalc Origin 6.1.
Для приготовления проявляющего раствора использовали нитрат серебра ч.д.а. (ООО «Диа-М») и гидрохинон высшего сорта по ГОСТ 19627-74 с содержанием основного вещества 99,5%.
Иммунохроматографический анализ проводили в два приема. Исследуемую пробу, содержащую суспензию бактериальных клеток или раствор СЭБ в буфере для проведения иммунох-роматографического анализа, объемом 120 мкл, вносили в ИХТ на 20 мин. После формирования иммунохроматограммы вносили 80 мкл проявляющего раствора состава: 1,5% гидрохинона и 0,15% нитрата серебра в 0,5М лимонной кислоте. Компоненты проявляющего раствора смешивали непосредственно перед внесением. Результаты анализа регистрировали через каждые 5 мин. Общая длительность воздействия проявляющего раствора составляла 15-20 мин. Ввиду фоточувствительности реакции взаимодействия гидрохинона и солей серебра пластиковую оправу ИХТ после добавления проявляющего раствора помещали в светонепроницаемый пакет из черной бумаги.
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
Результаты и обсуждение
Иммунохроматография проводилась в «сэндвич» варианте. Бактериальные клетки или белковые молекулы токсина взаимодействовали с конъюгатом антител и НКЗ, образуя комплекс. Затем, под воздействием тока жидкости, по аналитической мембране комплекс перемешался к аналитической зоне теста, в которой происходило связывание с антителами захвата (формирование «сэндвича»), вследствие чего аналитическая зона окрашивалась в вишневый цвет. Несвязавшийся конъюгат перемещался по аналитической мембране к конрольной зоне теста, где вступал во взаимодействие с антителами, нанесенными на мембрану. В контрольной зоне ИХТ находились антитела антивидовые, по отношению к антителам конъюгата, что вызывало образование окрашенного иммунного комплекса.
Таким образом, в аналитической и контрольной зонах ИХТ имелись НКЗ, способные взаимодействовать с атомами серебра, возникающими при воздействии проявляющего раствора. Концентрации компонентов проявляющего раствора, а также его рН были подобраны нами экспериментально, исходя из следующих соображений: высокие концентрации гидрохинона и нитрата серебра в щелочных растворах взаимодействуют весьма быстро, с образованием черного осадка металлического серебра. Концентрации компонентов были подобраны так, чтобы за время движения фронта проявляющего раствора по впитывающей подложке и аналитической мембране ИХТ реакция восстановления завершалась в течение 15-20 мин. Находящиеся в аналитической и контрольной зонах теста НКЗ, способствовали осаждению атомов металлического серебра на своей поверхности, как центры кристаллизации. В результате интенсивность окрашивания зон ИХТ возрастала, а контраст между мембраной и зонами увеличивался.
Визуальное сравнение результатов имму-нохроматографии и последующего воздействия проявляющего раствора на готовые иммуно-хроматограммы представлено на рис. 1. Из рисунка видно, что интенсивность окрашивания аналитической и контрольной зон иммунохро-матограмм после стадии проявления солями
серебра возрастает, а цвет линий приобретает более насыщенный оттенок. При традиционной хроматографии определяемая визуально чувствительность не превышает 1,0 • 106 м.к./мл, обработка проявляющим раствором повышает чувствительность до 2,5 • 105 м.к./мл, т.е. примерно в 4 раза. Общее время анализа - 35 мин.
В то же время рефлектометрическая регистрация с помощью приборов результатов ИХрА может дать выигрыш в чувствительности выявления спор микроба сибирской язвы.
Использование рефлектометра позволяет измерить интенсивность окрашивания аналитической зоны теста, даже в тех случаях, когда невооруженным глазом окрашивание еще не наблюдается, либо наблюдение окрашенной зоны вызывает сомнение у оператора [2, 17]. Графики зависимости интенсивности окрашивания аналитической зоны теста (У) от концентрации бактериальных клеток (Х) для стадии иммуно-хроматографии и для стадии воздействия проявляющего раствора, полученные экспериментально, с помощью рефлектометра, приведены на рис. 2, а.
Графики хорошо аппроксимируются формулой экспоненциальной зависимости первого порядка:
У = У0 + А1е(-Х / Ч
где У0, А1, ^ являются параметрами, которые определяются при аппроксимации. Коэффициенты ковариации Я2 зависимостей близки к единице, что свидетельствует о достоверности выбранной аппроксимирующей функции. Чувствительность выявления спор возбудителя сибирской язвы вычислялась путем решения уравнения 0,5 = У0 + А1е(-Х / ^, численные значения величин параметров У0, А1, ^ были получены путем аппроксимации экспериментальных точек (табл. 1). Значение Y = 0,5 усл.ед. равно наименьшим показаниям рефлектометра в аналитической зоне теста, соответствующим положительному результату анализа без проведения стадии проявления иммунохроматограммы.
Обработку результатов проводили следующим образом. Перед построением графических зависимостей из экспериментально определенных значений интенсивности окрашивания аналитической зоны ИХТ для различных кон-
MEDICAL AND BIOLOGICAL SCIENCES
Рис. 2. Графики зависимости интенсивности окраски аналитической зоны ИХТ от концентрации аналита до и после воздействия проявляющего раствора. Время воздействия 20 мин.
а - иммунохроматография спор возбудителя сибирской язвы; б - иммунохроматография стафилококкового энтеротоксина типа В. 1- иммунохроматография; 2- проявление; 3- показания рефлектометра, соответствующие положительному
результату анализа без проведения стадии проявления;
центраций аналита вычитали среднее значение интенсивности холостой пробы в аналитической зоне ИХТ с учетом верхней доверительной границы случайной погрешности. Полученные значения параметров аппроксимации, а также вычисленные значения чувствительности ИХТ для различной длительности проявления приведены в табл. 1.
Приведенные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что использование приема титрования антигена с последующим воздействием проявляющего раствора, содержаще-
го соли серебра, в сочетании с рефлектометри-ческой регистрацией результата существенно повышают чувствительность выявления спор сибиреязвенного микроба имунохроматогра-фическим методом с 1,0 • 106 м.к./мл при визуальной регистрации без усиления серебром до 3,7 • 104 м.к./мл. Выигрыш в чувствительности составил 27 раз при выполнении описанного выше алгоритма анализа. Общее время ИХрА увеличивается с 20 мин до 40-45 мин, с учетом времени регистрации и проведения необходимых расчетов.
Таблица 1
Коэффициенты экспоненциальной зависимости первого порядка, описывающей иммунохроматографический процесс выявления спор возбудителя сибирской язвы
Длительность, Среднее значение и доверительные границы случайной погрешности для уровня надежности 95% Чувствительность, м.к./мл
Уо Л ti • 10-6 R2
Стадия иммунохроматографии
20 7,0 ± 0 -6,682 ± 0,244 12,730 ± 2,150 0,974 3,5 • 105
Стадия воздействия проявляющим раствором
5 9,6 ± 0 -8,830 ± 0,440 14,780 ± 3,734 0,949 4,5 • 105
10 7,5 ± 0 -6,723 ± 0,447 8,262 ± 2,423 0,898 3,3 • 105
15 5,4 ± 0 -5,316 ± 0,265 1,747 ± 0,971 0,993 1,4 • 105
20 6,4 ± 0 -5,977 ± 0,254 2,869 ± 0,675 0,952 3,7 • 104
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
Таблица 2
Коэффициенты экспоненциальной зависимости первого порядка, описывающей иммунохроматографический процесс выявления стафилококкового энтеротоксина типа В
Длительность, Среднее значение и доверительные границы случайной погрешности для уровня надежности 95% Чувствительность, нг/мл
Ус А1 и • 10-6 R2
Стадия иммунохроматографии
20 2,4 ± 0 -2,708 ± 0,207 26,73 ± 5,03 0,964 9,5
Стадия воздействия проявляющим раствором
5 5,4 ± 0 -5,068 ± 0,583 16,33 ± 5,25 0,904 0,6
10 7,4 ± 0 -7,290 ± 0,370 11,53 ± 1,94 0,972 0,6
15 10,0 ± 0 -10,124 ± 0,752 5,22 ± 1,10 0,958 0,3
20 13,2 ± 0 -13,123 ± 1,000 5,82 ± 1,30 0,955 0,2
Подобная процедура анализа была применена нами для иммунохроматографического выявления СЭБ.
Визуальное наблюдение иммунохромато-грамм СЭБ невооруженным глазом позволяет выявить 15 нг/мл токсина, после 20 мин воздействия проявляющего раствора на иммунохрома-тограммы - 2,5 нг/мл.
Графики зависимостей показаний рефлектометра от концентрации токсина при проведении иммунохроматографии и последующего проявления (рис. 2,б) хорошо аппроксимировались экспоненциальными зависимостями первого порядка. Результаты аппроксимации приведены в табл. 2.
Как и в случае с выявлением возбудителя сибирской язвы, чувствительность выявления СЭБ увеличивается по мере длительности воздействия проявляющего раствора и достигает
200 пг/мл. Выигрыш в чувствительности выявления токсина с применением рефлектоме-трии и проявляющего раствора составляет: 9,5 / 0,2 = 47,5 раза, а по сравнению с регистрацией невооруженным глазом без применения проявляющего раствора 15,0 / 0,2 = 75,0 раз.
Полученные нами данные свидетельствуют, что процедура ИХрА, с применением проявляющего раствора, содержащего соли серебра и гидрохинон, с последующей рефлектоме-трической регистрацией результата, позволяет достичь чувствительности, превышающей чувствительность твердофазного иммунофер-ментного анализа (ТИФА), без существенного изменения формата аналитической процедуры (табл. 3).
Для удобства проведения анализа нами предложен экспериментальный образец тест-системы, позволяющий хранить все компонен-
Таблица 3 Сравнительные характеристики ИХрА и ТИФА
Параметр ИХрА ИХрА с применением проявляющего раствора ТИФА
Чувствительность выявления спор В. м.к./мл 1,0 • 106 3,7 • 104 1,0 • 105
Чувствительность выявления СЭБ, нг/мл 15 0,2 1,0-2,0 [18]
Время анализа, мин 20 45 120
Необходимость промывок в ходе анализа Нет Нет Да
Регистрация результатов анализа Визуальная Рефлектометрия Спектрофотометрия
Условия хранения компонентов теста Комнатная температура Комнатная температура 6 ± 2 °С
Срок годности теста, мес 24 24 24
1 2
MUJtt" 1.11 HUIinmuiitai
ту íJM- utwcvr ' '
Hlllnw.! 4»ll
&tm i»_■
Рис. 3. Внешний вид иммунохроматографического теста.
1 - общая упаковка ИХТ; 2 - упаковка для иммунохрома-тографических тестов; 3 - иммунохроматографические тесты; 4 - буфер анализа; 5 - навеска нитрата серебра; 6 - деионизованная вода; 7- емкость для проявляющего раствора; 8 - навеска гидрохинона; 9 - раствор 0,5 Млимонной кислоты .
ты при комнатной температуре (рис. 3). Известно, что разбавленные водные растворы нитрата серебра и гидрохинона нестабильны, разлагаются под действием света и тепла. Поскольку проявляющий раствор готовится непосредственно перед применением, нами предложена тест-система, в которой компоненты проявляющего раствора - гидрохинон и нитрат серебра -хранятся отдельно в виде готовых сухих навесок, рассчитанных на добавление определенного объема буфера анализа и раствора лимонной кислоты. Это позволяет хранить все компонен-
MEDICAL AND BIOLOGICAL SCIENCES
ты при комнатной температуре в течение нескольких лет и допускает кратковременное повышение температуры хранения до плюс 35°С, без ущерба для аналитических характеристик тест-системы.
Заключение
Усиление контраста аналитической и контрольной зон иммунохроматографического теста путем воздействия солей серебра и гидрохинона (проявляющий раствор) позволяет выявлять споры сибирской язвы и стафилококковый энтеротоксин типа В с чувствительностью, превышающей чувствительность обычных ИХТ в 4 и 6 раз при визуальной регистрации невооруженным глазом.
Приборная рефлектометрия иммунохромато-грамм позволяет регистрировать зависимости интенсивности окрашивания аналитической зоны ИХТ от концентрации аналита до, и после воздействия проявляющего раствора. Математическая обработка таких зависимостей дает выигрыш в чувствительности обнаружения в 27 и 75 раз для спор возбудителя сибирской язвы и СЭБ соответственно, по сравнению с визуальной регистрацией невооруженным глазом им-мунохроматограмм, без применения проявляющего раствора. Проведение стадии проявления и последующей рефлектометрии иммунохро-матограмм несколько увеличивает время проведения анализа, однако не меняет в целом его формат и дает значительный выигрыш в чувствительности. Предложен состав экспериментальной тест-системы повышенной чувствительности для проведения ИХрА с применением проявляющего раствора, в состав которого входит нитрат серебра и гидрохинон. Указанная тест-система может долговременно храниться при температуре окружающей среды. Предложенный нами подход продуктивен в отношении иммунохроматографических тест-систем для выявления других патогенных микроорганизмов и токсинов. Достижение желаемого аналитического эффекта ИХрА может зависеть от состава проявляющего раствора, способа его нанесения на готовую иммунохроматограмму, условий и времени экспозиции. По-видимому, для каждой тест-системы эти факторы должны быть подобраны индивидуально.
461
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии
конфликта интересов.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской
поддержки.
ЛИТЕРАТУРА
1. Скопинская С.Н., Ярков С.П. Создание диагностических тест-систем на основе иммунохроматографии и наночастиц гексацианферрата(П) железа(Ш). Медицина экстремальных ситуаций. 2013; 2: 76-85.
2. Ярков С.П., Третьяков С.И., Башарова Л.А., Зло-бин В.Н. Индикация возбудителей особо опасных заболеваний с помощью иммунохроматографии и видеоцифрового анализа. Вестник РАМН. 2007; 12: 22-6.
3. Wong R.C., Tse H.Y. Lateral flow immunoassay. N-Y, Humana Press. 2009; 223.
4. Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Ways to reach lower detection limits in lateral flow immunoassays. Rapid Test -Advances in Design, Format and Diagnostic Applications. InTechOpen. 2018; 9-43.
5. Шиленко И.В., Ярков С.П., Скопинская С.Н., Злобин В.Н. Комплект для выявления возбудителей особо опасных заболеваний и токсинов люминесцентным иммунохроматографическим методом. Проблемы особо опасных инфекций. 2008; 2: 46-50.
6. Gupta S., Huda S., Kilpatrick P.K., Velev O.D. Characterization and optimization of gold nanoparticle-based silver-enhanced immunoassays. Analytical Chemistry. 2007; 79(10): 3810-20.
7. Rodriguez M.O., Covian L.B., Garcia A.C., Blanco-Lopez M.C. Silver and gold enhancement methods for lateral flow immunoassays. Talanta. 2016; 148: 272-8.
8. Anfossi L., Di Nardo F., Giovannoli C., Passini C., Baggiani C. Increased sensitivity of lateral flow immu-noassay for ochratoxin A through silver enhancement. Analytical andBioanalytical Chemistry. 2013; 405 (30): 9859-67.
9. DryginY.F., Blintsov A.N., Grigorenko V.G., Andreeva I.P., Osipov A.P., Varitzev Y.A., Uskov A.I., Kravchenko D.V, Novikov V.K., Atabekov J.G. High_Sensitivity Express Immunochromatographic Method for Detection of Plant Infection by Tobacco Mosaic. Virus Biokhimiya. 2009; 74(9): 1212-20.
10. Drygin Y.F., Blintsov A.N., Grigorenko V.G., Andreeva I.P., Osipov A.P., Varitzev Y.A., Uskov A.I., Kravchenko D.V, Atabekov J.G. Highly sensitive field test lateral flow immunodiagnostics of PVX infection. Applied Microbiology Biotechnology. 2012; 93: 179-189.
11. Panferov V.G., Safenkova I.V., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Post-assay growth of gold nanoparticles as a tool for highly sensitive lateral flow immunoassay .Application to the detection of potato virus X. Microchimica Acta. 2018;185: 506.
12. Panferov V.G., Safenkova I.V, Byzova N.A., Varitsev Y.A., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Silver-enhanced lateral flow immunoassay for highly-sensitive detection of
potato leafroll virus. Food and Agricultural Immunology. 2018; 29: 445-57.
13. Panferov V.G. , Safenkova I.V., Varitsev Y.A., Dre-nova N.V., Kornev K.P., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Development of the sensitive lateral flow immunoas-say with silver enhancement for the detection of Ral-stonia solanacearum in potato tubers. Talanta. 2016; 152:521-30.
14. Byzova N.A., Zherdev A.V., Sveshnikov P.G., Sadykhov E.G., Dzantiev B.B. Development of an immunochro-matographic test system for the detection of Helicobacter pylori antigens. Applied Biochemistry and Microbiology. 2015; 51(5): 608-17.
15. Liu C.C., Yeung C.Y., Chen P.H., Yeh M.K., Hou S.Y. Salmonella detection using 16S ribosomal DNA/RNA probe-gold nanoparticles and lateral flow immunoassay. Food Chemistry. 2013; 141 (3): 2526- 32.
16. Wang J, Chen M, Sheng Z. Development of colloidal gold immunochromatographic signal-amplifying system for ultrasensitive detection of Escherichia coli O157:H7 in milk. RSCAdvances. 2005; 5: 62300-5.
17. Titov A.A., Shilenko I.V., Morozov A.A., Yarkov S.P., Zlobin V.N. Development and optimization of immu-noassays for the detection of botulinum toxins. Applied Biochemistry and Microbiology. 2012; 48 (2): 222-8.
18. Germanchyuk V.G., Utkin D.V., Scherbakova S.A. Analysis of modern methods and means of express indication of toxins. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2012; 112(1): 51-4. (in Russian)
18. Германчук В.Г., Уткин Д.В., Щербакова С.А. Анализ современных методов и средств экспрессной индикации токсинов. Проблемы особо опасных инфекций. 2012; 112 (1): 51-4.
REFERENCES
1. Skopinskaya S.N., Yarkov S.P. Creation of diagnostic test systems based on immunochromatography and hexacyanferrate nanoparticles (ii) of iron (iiiJ. Medicina ekstremalnyh situaciy. 2013; 2: 76-85. (in Russian)
2. Yarkov S.P., Tretyakov S.I., Basharova L.A., Zlobin V.N. Indication of pathogens of particularly dangerous diseases with immunochromatography and video digital analysis. VestnikRAMN. 2007; 12: 22-6. (in Russian)
3. Wong R.C., Tse H.Y. Lateral flow immunoassay. N-Y, Humana Press. 2009; 223.
4. Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Ways to reach lower detection limits in lateralflow immunoassays. Rapid Test -Advances in Design, Format and Diagnostic Applications. InTechOpen. 2018; 9-43.
5. Shilenko I.V, Yarkov S.P., Skopinskaya S.N., Zlobin V.N. kit for the detection of pathogens of especially dangerous diseases of toxins by luminescent immuno-chromatographic method. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2008; 2: 46-50. (in Russian)
6. Gupta S., Huda S., Kilpatrick P.K., Velev O.D. Characterization and optimization of gold nanoparticle-based
silver-enhanced immunoassays. Analytical Chemistry. 2007; 79(10): 3810-20.
7. Rodriguez M.O., Covian L.B., Garcia A.C., Blanco-Lopez M.C. Silver and gold enhancement methods for lateral flow immunoassays. Talanta. 2016; 148: 272-8.
8. Anfossi L., Di Nardo F., Giovannoli C., Passim C., Baggiani C. Increased sensitivity of lateral flow immunoassay for ochratoxin A through silver enhancement. Analytical andBioanalytical Chemistry. 2013; 405 (30): 9859-67.
9. DryginY.F., Blintsov A.N., Grigorenko V.G., Andreeva I.P., Osipov A.P., Varitzev Y.A., Uskov A.I., Kravchenko D.V, Novikov V.K., Atabekov J.G. High_Sensitivity Express Immunochromatographic Method for Detection of Plant Infection by Tobacco Mosaic. Virus Biokhimiya. 2009; 74(9): 1212-20.
10. Drygin Y.F., Blintsov A.N., Grigorenko V.G., Andreeva I.P., Osipov A.P., Varitzev Y.A., Uskov A.I., Kravchenko D.V, Atabekov J.G. Highly sensitive field test lateral flow immunodiagnostics of PVX infection. Applied Microbiology Biotechnology. 2012; 93: 179-189.
11. Panferov V.G., Safenkova I.V., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Post-assay growth of gold nanoparticles as a tool for highly sensitive lateral flow immunoassay .Application to the detection of potato virus X. Microchimica Acta. 2018;185: 506.
12. Panferov V.G., Safenkova I.V, Byzova N.A., Varitsev Y.A., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Silver-enhanced lateral flow immunoassay for highly-sensitive detection of
MEDICAL AND BIOLOGICAL SCIENCES
potato leafroll virus. Food and Agricultural Immunology. 2018; 29: 445-57.
13. Panferov V.G. , Safenkova I.V., Varitsev Y.A., Dre-nova N.V., Kornev K.P., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Development of the sensitive lateral flow immunoassay with silver enhancement for the detection of Ral-stonia solanacearum in potato tubers. Talanta. 2016; 152:521-30.
14. Byzova N.A., Zherdev A.V., Sveshnikov P.G., Sadykhov E.G., Dzantiev B.B. Development of an immunochro-matographic test system for the detection of Helicobacter pylori antigens. Applied Biochemistry and Microbiology. 2015; 51(5): 608-17.
15. Liu C.C., Yeung C.Y., Chen P.H., Yeh M.K., Hou S.Y. Salmonella detection using 16S ribosomal DNA/RNA probe-gold nanoparticles and lateral flow immunoassay. Food Chemistry. 2013; 141 (3): 2526- 32.
16. Wang J, Chen M, Sheng Z. Development of colloidal gold immunochromatographic signal-amplifying system for ultrasensitive detection of Escherichia coli O157:H7 in milk. RSCAdvances. 2005; 5: 62300-5.
17. Titov A.A., Shilenko I.V., Morozov A.A., Yarkov S.P., Zlobin V.N. Development and optimization of immunoassays for the detection of botulinum toxins. Applied Biochemistry and Microbiology. 2012; 48 (2): 222-8.
18. Germanchyuk V.G., Utkin D.V., Scherbakova S.A. Analysis of modern methods and means of express indication of toxins. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2012; 112(1): 51-4. (in Russian)
Поступила 08 апреля 2019 Принята в печать 09 сентября 2019
