CC BY
17Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 19 (58). 2006. № 4. С.127-134.
УДК 591.11: 547.466
ПОВЕДЕНИЕ КРЫС В РАЗЛИЧНЫХ СТРЕСС-ТЕСТАХ ПРИ ДЕЙСТВИИ 1Ч-УРОНОИЛПРОИЗВОДНЫХ L-ЛЕЙЦИНА И L-ВАЛИНА
Коренюк И.И., Раваева М.Ю., Орехова В.В., Курьянов В.О., Чупахина Т.А.
Аминокислоты выполняют особую роль в обменных реакциях и являются родоначальниками гормонов и биологически активных соединений (полиаминов, креатина, энергетических субстратов) [1]. Большое внимание нейрофизиологов привлекают аминокислоты, обладающие нейромедиаторными свойствами (глицин, глутаминовая кислота, ГАМК), однако и среди аминокислот немедиаторной природы имеются аминокислоты, обладающие нейтротропным действием, такие как валин и лейцин. Так, опыты на лабораторных крысах показали, что валин повышает мышечную координацию и понижает чувствительность организма к боли, холоду и жаре [2]. Он применяется в клинике для лечения депрессии в качестве несильного стимулирующего соединения. Известно, что валин помогает предотвратить некоторые неврологические заболевания, а также применяется в коррекции рассеянного склероза, поскольку защищает миелиновую оболочку нервных волокон в спинном и головном мозге [3]. Также известно, что чрезмерно высокий уровень валина может привести к таким симптомам как парестезии (ощущение мурашек на коже) и галлюцинации [4].
Смеси аминокислот, содержащие лейцин используются в клинической практике (для парентерального введения) при стрессовых состояниях, поскольку один из метаболитов лейцина подавляет активность кортизола - гормона, активность которого значительно повышается при стрессах [5].
Валин и лейцин имеют разветвленный углеродный скелет и в связи с этим могут использоваться мышечными и нервными клетками в качестве источника энергии, способствуют регенерации мышечных белков, особенно при состояниях, усиливающие катаболические процессы [6]. Особенностью данных аминокислот является их способность, не изменяясь, проходить через гематоэнцефалический барьер. В связи с этим данные аминокислоты используются в клинике в качестве противошокового средства, а также при токсикозах, заболеваниях печени, анемий и других заболеваниях [7, 8]. Показано, что валин и лейцин усиливают проникновение в мозг других аминокислот, необходимых для синтеза нейромедиаторов, что приводит к улучшению памяти и концентрации внимания [3].
Такой обширный спектр нейротропных свойств валина и лейцина предполагает широкое использование их в качестве лекарственных препаратов при самых различных заболеваниях. Однако серьезным препятствием остается малая продолжительность эффектов природных аминокислот, что связано с быстрым их
распадом в организме под действием ферментов. Для создания высокоэффективных лекарств на основе аминокислот разрабатываются их синтетические аналоги, которые сохраняют природную активность и обладают высокой устойчивостью к действию протеаз. Такими свойствами могут обладать ^уроноилпроизводные валина и лейцина, такие как ^(1,2:3,4-ди-0-изопропилиден-а-0-галактопирануроноил)-валин (ДАГУ-Вал) и ^(1,2:3,4-ди-0-изопропилиден-а-0-галактопирануроноил)-лейцин (ДАГУ-Лей), однако, их психотропная активность не изучалась. В связи с этим, целью настоящего исследования явилось исследование психотропной активности данных производных аминокислот в серии экспериментальных моделей стресса.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнена на белых беспородных крысах-самцах массой 200-220 г, содержащихся в стандартных условиях вивария. Тестирование проводилось в утреннее время. Соединения растворялись в физиологическом растворе и вводились внутрибрюшинно в объеме 0.2 мл, в дозе 50 мг/кг. Животным контрольной группы таким же образом вводили физиологический раствор в аналогичном объеме.
Изучение поведенческих реакций при действии соединений проводилось в серии экспериментальных моделей стресса «открытое поле» [9], «черно-белая камера» [10], тест «вынужденного плавания» Порсолта [11, 12], тест «подвешивание за хвост» [13].
Статистическую обработку данных осуществляли с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Достоверным считались различия эффектов тестируемых соединений по сравнению с контролем при р<0,05.
При проведении экспериментов все биоэтические нормы были соблюдены.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Активность крыс в тесте «открытое поле» при действии тестируемых производных.
В результате проведенных исследований обнаружено, что в тесте «открытое поле» (табл. 1) ДАГУ-Вал достоверно понижал показатель горизонтальной двигательной активности (ГДА), повышал показатель исследовательской активности (ИА), а уровень дефекации (Деф) значительно не изменялся. При действии свободной аминокислоты валина (Вал) достоверно понижались ГДА, ИА и груминг (Гр), и значительно повышалась Деф. При сравнении действия ДАГУ-Вал и Вал, выявлено, что Вал оказывал более выраженное действие на поведенческие показатели крыс, чем его углеводный коньюгат.
Применение ДАГУ-Лей также приводило к снижению ГДА, вертикальной двигательной активности (ВДА) и Деф, а уровень ИА и Гр значительно повышались. Лейцин (Лей) достоверно понижал ГДА, ВДА, и Деф, а также повышает показатель Гр. Сравнительный анализ эффектов ДАГУ-Лей и Лей, показал, что Лей оказывал более выраженное ингибирующее действие на поведенческие реакции, чем ДАГУ-Лей.
Введение (ДАГУ) в дозе 50 мг/кг приводило к снижению ВДА, ИА, Деф и повышению Гр.
Таблица 1.
Поведенческая активность крыс в тесте "открытое поле" при действии тестируемых соединений (х ± S х ,п=10)
Соединения Показатели (у.е.)
ГДА ВДА ИА ГР ДЕФ
Контроль 19,5±4,1 6,5±1,1 11,4±1,6 1,6±0,5 1,2±0,7
ДАГУ 21,8±2,8 2,8±1,1** 8,4±1,9* 2,2±0,9* 0,4±0,2**
Вал 6,5±0,9* 0** 8,0±0,4** 0** 3,5±0,5**
ДАГУ-Вал 14,5±3,5** 2,8±0,5 13,8±3,9** 1,0±0,4 1,3±0,5
Лей 8,0±1,7** 0,5±0,3** 11,5±0,9 2,5±0,3 0,0±0,0
ДАГУ-Лей 10,0±2,7* 1,5±1,1** 15,5±1,2 1,0±0,4 0,8±0,2
Примечание:* - уровень достоверности различий по отношению к контролю р<0,05; ** -р<0,01
Исходя из того, что двигательная активность отражает величину процессов возбуждения ЦНС, а груминг и реакция дефекации в тесте «открытого поля» являются достоверными показателями уровня возбуждения вегетативной нервной системы [14], можно констатировать, что гликоконъюгаты ДАГУ-Вал и ДАГУ-Лей оказывали тормозное действие на нервную систему. Следует указать, что снижение двигательной активности крыс на фоне заметно возросшего груминга, по мнению ряда исследователей [15, 16] свидетельствует о развитии сильного стресса и тревожно-депрессивных изменений поведения. Другие авторы [17, 18] указывают, что подобные изменения поведения возникают при действии различных факторов, таких как гормоны и мозговые пептиды, действие которых направленно на те же механизмы, что и стресс. Кроме того, известно [14, 19], что увеличение двигательной активности в первые часы эксперимента может быть следствием повышенной стрессированности животных, и связано с адаптационными процессами организма. Таким образом, основываясь на интегрированной картине, отражающей не отдельные показатели, а изменение их в комплексе, можно предположить, что ДАГУ-Вал и ДАГУ-Лей способны индуцировать развитие тормозных процессов в нервной системе и уменьшать психоэмоциональное напряжение животных в тесте «открытое поле». В целом, сравнительный анализ действия ДАГУ-Вал и ДАГУ-Лей и соответствующих аминокислот показал более выраженное ингибирующее действие на двигательную активность животных последних. Следовательно, ацилирование исследуемых аминокислот приводит к смягчению ингибирующих эффектов и повышению ноотропных свойств.
Мы полагаем, что тормозное действие ДАГУ-Вал и ДАГУ-Лей вероятно связано с их способностью активировать процессы защитного торможения в ЦНС, в результате чего уменьшается психоэмоциональное напряжение крыс в тесте «открытое поле» и, следовательно, данные соединения оказывают стресспротекторное действие.
Влияние М-уроноилпроизводных на исследовательскую активность крыс в тесте «черно-белая камера».
В данном тесте ДАГУ достоверно уменьшала частоту и время выглядываний в светлый отсек камеры (табл. 2). ДАГУ-Вал и Вал по отношению к контролю уменьшали частоту и время выглядываний и выходов в светлый отсек камеры. Сравнительный анализ эффектов ДАГУ-Вал и Вал показал, что Вал ингибирует исследовательскую активность крыс сильнее, чем его ацилированное производное.
При анализе эффектов тестируемых препаратов в данном тесте подсчитывался коэффициент К отношения числа выходов к общему числу выглядываний и выходов. Для ДАГУ-Вал К оказался равным нулю, для ДАГУ К=0,06, в то время как в контроле К=0,18 (табл. 2). Применение аналогичного подхода к анализу длительности пребывания в светлом отсеке камеры (число Т) по отношению к общему времени выглядываний и выходов показал, что для ДАГУ-Вал Т=0, для Вал Т=1, (контроль Т=0,19) Следовательно, ацилирование Вал приводит к уменьшению его угнетающего действия на исследовательскую активность животных. Внутрибрюшинное введение ДАГУ-Лей приводило к снижению частоты и времени выглядываний и повышению частоты и времени выходов в светлый отсек камеры (табл. 2). Интегральный показатель К (отношение числа выходов к общему числу выходов и выглядываний) для ДАГУ-Лей = 0,6, для ДАГУ = 0,06 (для контроля К=0,18). Аналогичный показатель времени Т для ДАГУ-Лей = 0,85, для ДАГУ=0,36. При введении как ДАГУ-Лей, так и Лей все крысы продемонстрировали отказ от выходов в светлый отсек камеры. Таким образом, животные после введения Лей демонстрировали большую ингибированность исследовательского поведения, чем после инъекции ДАГУ и ДАГУ-Лей. Следовательно, ацилирование аминокислоты уменьшает её угнетающее действие.
Показатель дефекации, который связан с силой стрессированности животных, при действии аминокислот и их производных не изменялся.
«Черно-белая камера» считается одной из чувствительных моделей острой, «ситуативной» тревожности животных [13], в которой свою активность способно проявить большинство их известных классов анксиотропных препаратов. Крысы обычно предпочитают находиться в темном отсеке, однако анксиолитики увеличивают число выходов и время, проведенное в светлом отсеке, тогда как анксиогенные агенты приводят к обратным эффектам [20]. Поскольку наиболее выраженное увеличение исследовательской активности наблюдалось у крыс, получавших ДАГУ-Лей, можно предположить, что данное соединение является анксиолитиком.
Влияние М-уроноилпроизводных на исследовательскую активность крыс в тесте вынужденного плавания (тест Порсолта)
После введения ДАГУ у животных достоверно уменьшался латентный период (ЛП) первого зависания и увеличивалось количество освобождения от воды, а длительность активного плавания достоверно не изменялась (табл. 3).
ДАГУ-Вал достоверно уменьшал ЛП по сравнению с контролем, увеличивал время активного плавания и количество актов, направленных на освобождение от воды, таких как выпрыгивания, умывания, отряхивания головы (количество выпрыгиваний) (табл. 3). Вал снижал все поведенческие показатели.
Таблица 2.
Поведенческие эффекты соединений в тесте "Черно-белая камера"
(X ± Sx ,п=10)
Группы Частота выглядываний Время выглядываний (с) Частота выходов Время выходов (с) Болюсы Коэффициент К Коэффициент Т
Контроль 4,1±0,8 45,2±10,2 0,9±0,3 10,5±5,7 0 0,18 0,19
ДАГУ 1,4±0,2** 4,6±1,1** 0,1 ±0,1 2,8±2,8 0,4±0,2** 0,06 0,36
Вал 0** 0** 0,5±0,2 8,5±3,2 0 1 1
ДАГУ-Вал 1,0±0,7* 4,6±1,1** 0** 0** 0 0 0
Лей 1,0±0,4** 6,0±2,3** 0** 0** 0 0 0
ДАГУ-Лей 2,5±0,9 22,1±1,4* 1,5±0,8* 26,5±13,9** 0 0,6 0,85
Примечание: * - уровень достоверности различий по отношению к контролю (р<0,05); ** - р<0,01; К - интегральный показатель отношения числа выходов к общему числу выходов и выглядываний, Т - интегральный показатель отношения продложительности выходов к общему времени выглядываний и выходов животных в светлый отсек камеры.
При действии ДАГУ-Лей (табл. 3) наблюдалось достоверное уменьшение всех показателей активности крыс по сравнению с контролем. Лей достоверно уменьшал только ЛП. При сравнении эффектов ДАГУ-Лей, ДАГУ и Лей выявлено, что ЛП снижается в ряду ДАГУ-Лей ^ ДАГУ ^ Лей, а время активного плавания снижается в ряду ДАГУ ^ Лей ^ ДАГУ-Лей.
Данный тест широко используется для выявления антидепрессантных свойств у психотропных препаратов [11-13] и новосинтезированных соединений, в котором стадия иммобильности, или «зависания» традиционно является проявлением «отчаяния». Поскольку практически все антидепрессанты приводят к снижению времени иммобильности у экспериментальных животных [12], мы полагаем, что из ряда тестированных производных аминокислот только ДАГУ-Вал является антидепрессантом.
Исследование влияния производных аминокислот на поведение крыс в тесте «подвешивание за хвост»
Отметим, что тест основан на наблюдении, что крысы, при их подвешивании за хвост, демонстрируют определенный период иммобильности, по продолжительности которого судят об уровне их тревожности/страха и отчаяния [13].
Введение ДАГУ-Вал, также как и Вал, достоверно (р<0,05) снижает время пассивного зависания от 13,7±3,3 в контроле до 4,2±0,6 и 3,5±0,65 соответственно. Следует отметить, что Вал оказывает более выраженное действие, чем ДАГУ-Вал, то есть, ацилирование кислоты незначительно снижает её активность.
Таблица 3.
Показатели активности крыс в тест Порсолта при действии тестируемых _соединений (х ± S х , п=10)_
Группы Тестируемые параметры
ЛП, (с) активное плавание, (с) число выпрыгиваний
Контроль 88,9±10,6 142,2±11,6 41,9±4,5
ДАГУ 12,2±4,2** 145,2±5,8 61,4±5,7**
Вал 8,0±1,1** 134,5±2,7 30,0±4,2
ДАГУ-Вал 15,8±3,8** 164,8±1,8* 75,0±10,8**
Лей 9,0±0,6** 127,5±10,1 43,0±9,8
ДАГУ-Лей 22,2±15,3** 87,3±34,8* 20,0±6,9*
Примечание:* - уровень достоверности различий по отношению к контролю р<0,05; ** - р<0,01
При действии ДАГУ-Лей и Лей у животных наблюдается уменьшение времени иммобильности до 8,2±2,1 (р=0,05) и 7,3±1,2 (р=0,05) соответственно, причем эффекты ацилированной аминокислоты более выражены.
ДАГУ увеличивает время пассивного зависания крыс до 15,8±2,9 (р<0,05).
При сравнении эффектов указанных соединений установлено, что ДАГУ-Вал и ДАГУ-Лей оказывают выраженный антидепрессантный эффект, но последний уменьшает уровень депрессии у животных, но в меньшей степени, чем ДАГУ-Вал. Поскольку, данный тест, как и тест Порсолта, моделирует состояние депрессии и тревожности [19, 21], можно предположить, что ДАГУ-Вал обладает низкоселективным антидепрессантным действием, и является эффективным при различных видах и стадиях депрессии.
Из экспериментальных данных следует, что ^уроноилпроизводные валина и лейцина способны изменять поведенческую реакцию крыс на стресс. Рассматривая возможные механизмы психотропного действия соединений можно предположить, что данные производные, проникая через гематоэнцефалический барьер, изменяют функциональное состояние нейронов, что в свою очередь сдвигает баланс возбуждения-торможения нервной системы. Вероятно, тестируемые соединения избирательно действуют на нейроны с определенной эргичностью. В первую очередь это относится к серотонинергическим нейронам, поскольку активность именно этой системы доминирует над другими медиаторными системами у крыс со средней двигательной активностью [22, 23], используемых в наших экспериментах. В пользу этого предположения свидетельствует то, что во-первых, в случае повышения уровня серотонина в структурах головного мозга, увеличивается эмоциональность и угнетается двигательная активность животных [24], что и наблюдалось у животных в тесте «открытое поле». Во-вторых, известно также, что валин препятствует снижению уровня серотонина, а лейцин предотвращает его перепроизводство [4]. Нельзя исключить и влияния этих соединений на дофаминергическую систему, которая, также играет важную роль в регуляции движений [25]. Однако, наличие значительного количества серотониновых
рецепторов на дофаминергических нигростриатных нейронах [26], предполагает опосредованное действие серотонина на дофаминергическую систему, в результате которого осуществляется контроль выделения дофамина в базальных ганглиях, являющихся основным двигательным центром у крыс [19]. Кроме этого, активация и норадренергической системы приводит к угнетению эмоциональной активности животных [24].
Необходимо заметить, что по современным представлениям патогенез тревоги не является результатом дисфункции какой-либо одной нейромедиаторной системы, а отражает возникновение системного регуляторного дисбаланса различных нейромедиаторов на самых разных уровнях структурно-функциональной организации - от молекулярного до уровня целостного мозга [19]. Ключевое место в формировании отмеченного дисбаланса занимает ГАМК-ергическая система. Именно нарушение ГАМК-зависимых процессов в ЦНС опосредуют дисфункцию серотонин-, катехоламин- и пептидергических систем, приобретающих при последующем развитии и прогрессировании тревожных расстройств роль самостоятельных патогенетических механизмов. Таким образом, используемые нами в экспериментах соединения могут влиять на поведение, изменяя соотношения концентраций соответствующих медиаторов в различных отделах головного мозга.
ВЫВОДЫ
1. Тестированные N-уроноилпроизводные аминокислот оказывают психотропное действие, которое проявляется в изменении поведенческих реакций крыс в экспериментальных моделях стресса.
2. ^(1,2:3,4-ди-0-изопропилиден-а-0-галактопирануроноил)-валин в тесте «открытое поле» оказывает стресспротекторное действие, а в тестах Порсолта и «подвешивание за хвост» проявляет антидепрессантные свойства.
3. ^(1,2:3,4-ди-0-изопропилиден-а-0-галактопирануроноил)-лейцин проявляет стресспротекторные (в тесте «открытое поле») и анксиолитические свойства («черно-белая камера»).
Список литературы
1. Майстер А. Биохимия аминокислот. - М.: Мир, 1961. - 365 с.
2. Лелевич В.В., Селевич М.И., Шейбак В.М. Клиническо-лабораторные аспекты метаболической терапии. - Гродно, 1999. - 242 с.
3. Шейбак В.М. Обмен свободных аминокислот и кофермент А при алкогольной интоксикации. -Гродно, 1998. - 153 с.
4. Hirano N.W. Enzym immunoassay of hyman cytosolic aspartate aminotransferase.// Clinica Chimica Acta. - 1984. - V. 144. - P. 49-57.
5. Dolp R., Ahnefeld F.W., Grunert A., Shmitz E. Clinical studies on free amino acid concentration in plasma. Development of an acid pattern for parenteral nutrition during stress metabolism // Acta chir. scand. - 1979. - V. 145, № 494. - P. 127-129.
6. Swick R.W., Barnstein P.L., Stange J.L. The metabolism of mitochondrial proteins // J. of biological chemistry. - 1969. - V. 240, № 8. - Р. 3334-3340.
7. Островский Ю.М. Метаболические предпосылки и последствия потребления алкоголя. - М.: Наука, 1988. - 263 с.
8. Островский Ю.М., Островский С.Ю. Аминокислоты в патогенезе, диагностике и лечении алкоголизма. - М.: Наука, 1995. - 280 с.
9. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д.П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. М.: «Высшая школа», 1991. - 399 с.
10. Crawley J.N. Exploratory behavior models of anxiety in mice. // Neurosci. Biobehav. Revs. - 1985. -№ 9.-Р. 33-44.
11. Porsolt R.D., Pinchon M.Le., Jalfre M. Depression: a new animal model sensitive to antidepressant Treatments // Nature. - 1977. - V. 266. - P. 730-732.
12. Porsolt R.D., McArthur R.A., Lenegre A. Psychotropic screening procedures // F. van Haaren. Methods in Behavioral Pharmacology. - New York: Elsevier, 1993. - Р. 23-51.
13. Greenshaw A.J., Nguyen T.V., Sanger D.J. Animal models for asessing anxiolytic, neuroleptic and antidepressant drug action // A. Boulton, G. Baker, R. Coutts. Neuromethods. - Clifton: Humana press, 1988. - Р. 379-427.
14. Маркель А.Л. К оценке основных характеристик поведения крыс в тесте открытого поля // Журн. высш. нервн. деят. - 1981. - Т. 31, № 2. - С. 301-307.
15. Калуев А.В. Стресс и груминг. - М.: Авикс, 2002. - 146 с.
16. Макарчук Н.Е., Калуев А.В. Обоняние и поведение. - К.: КСФ, 2000. - 148 с.
17. Dunn A.J., Berrige C.W., Dunshem P. Behavioural tests: their interpretation and significance in the study of peptide action // Neuromethods. -New York: Humana Press. 1987. - P. 229-247.
18. Stone E.A., Manavalan S.J., Zhang Yi, Quartermain D. Beta-adrenoreceptor blockage mimics effects of stress on motor activity in mice // Neuropsyсhopharmacol.- 1995. - Vol. 12, № 1. - P. 65-71.
19. Калуев А.В. Стресс, тревожность и поведение. - К.: Энигма, 1998. - 92 с.
20. Harro J. Measurement of exploratory behavior in rodents // Methods in Neurosciences (V. 14, Paradigms for the Study of Behavior). - San Diego, New York: Academic Press, 1993. - P. 359-377.
21. Willner P. Animal models of depression: validity and applications // Depression and Mania. Advances in Biochemical Psychopharmacology. - New York: Raven Press, 1995. - P. 19-41.
22. Кругликов Р.И., Герцова В.М., Орлова Н.В. Изменение содержания моноаминов в мозге влияет на реакцию эмоционального резонанса // Журн. высш. нервн. деят. - 1995. - Т. 45, № 3. - С. 551-557.
23. Кругликов Р.И., Орлова Н.В, Герцова В.М. Содержание норадреналина и серотонина в симметричных отделах головного мозга крыс в норме, при обучении и введении пептидов // Журн. высш. нерв. деят. - 1991. - Т. 41, № 2. - С. 359-363.
24. Кулагин Д.А., Болондинский Б.К. Нейрохимические аспекты эмоциональной реактивности и двигательной активности крыс в новой обстановке // Успехи физиологических наук. - 1986. - № 1. - С. 92-110.
25. Кратин Ю.Г., Сотниченко Т.С. Неспецифические системы мозга. - Л.: Наука, 1997. - 342 с.
26. Sershen H., Hashim A., Lajtha A. Serotonin-mediated striatal dofamine release involves the dopamine uptake sites and the serotonin receptors // Brain Res. Bull. - 2000. - Vol. 53, № 3. - P. 535-537.
Поступила в редакцию 05.12.2006 г.
