CC BY
89
"ПОСТ-ГЕНОМНЫЕ" ТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ УСКОРЕННОЙ РАЗРАБОТКИ НОВЫХ ОТЕЧЕСТВЕННЫХ ЛЕКАРСТВ
К.В. Балакин, А.А. Иващенко
Центр Высоких Технологий ХимРар, г. Химки, Московская обл. E-mail: kb@chemrar.ru. тел.: +7-495 995-4941.
Конец XX века ознаменовался одним из ярких фундаментальных открытий из разряда тех, что определяют развитие прикладной науки и технологий на десятилетия вперед. Расшифровка человеческого генома, являющаяся великолепным плодом коллективного творчества огромной интернациональной армии исследователей, вызвала к жизни целый пласт новых технологий и даже целых научных направлений в области «наук о живом». Их влияние на целый ряд современных научных дисциплин, таких как биохимия, молекулярная биология, медицинская химия, фармацевтика, геномика и протеомика, оказалось столь велико, что повсеместно заговорили о свершившейся «геномной революции». Современная наука уже немыслима без молодых технологий и научных дисциплин «постгеномной эры», бурное развитие которых дает ценные практические результаты. Конечной целью применения этих технологий является наиболее эффективное, ускоренное прохождение пути от расшифрованных геномов до столь необходимых нашей стране лекарственных препаратов.
Как «постгеномные» технологии помогают находить новые лекарства?
В настоящее время для исследователей становится очевидным, что процесс эффективного поиска новых лекарств, а также биологических мишеней для их действия, может базироваться на систематическом анализе генетической информации [1, 2]. Последние достижения в этой области позволяют находить взаимосвязи между структурой лиганда и типом биомишени. В дальнейшем эти знания могут быть эффективно использованы на стадии непосредственного биологического скрининга.
МИШЕНИ
Л d х
£ X п.
Т /
! —Л '5-
/ /
лиганд
• структура
• данные по активности
• данные АРМЕ/Тох
мишень
• аминокислотная последовательность
• комплекс мишень-лиганд, данные кристаллографии
• расчет дескрипторов
• кластеризация
• поиск {по подобию, подструктура, ЗЭ-фармакофорный, докинг и т.д.) КССС-моделирование
# классификация (аминокислотная последовательность, вторичная
структура, функции) , поиск по подобию последовательности
• гомология
Рис. 1. Информационная матрица взаимодействия лиганд-мишень.
На сегодняшний день значительно число научных исследований в этой области посвящено созданию мишень-специфичных библиотек (МСБ) органических соединений. Ключевым моментов таких исследований является создание информационной матрицы взаимодействия лиганд-мишень, которая, по сути, является массивом данных, предназначенным для эффективного анализа геномной информации (рис. 1). Сведения, получаемые из анализа таких информационных матриц, способствует более глубокому пониманию механизмов действия и мишень-специфичной активности низкомолекулярных органических лигандов. В частности, такой подход с успехом используется для тестирования библиотек органических соединений в клеточных исследованиях, с целью определения биологических мишеней и изучения механизмов действия активных агентов. Другая схема исследований предполагает изучение наиболее значимых классов биологических мишеней, таких как определенные классы ферментов, рецепторы, связанные с G-белками, ядерные рецепторы и лиганд-зависимые ионные каналы, для in silico скрининга (т. е. «виртуального», компьютерного скрининга) и комбинаторного дизайна фокусированных библиотек. Обзор последних публикаций, посвященных in silico экспериментам в этой области показывает, что аннотированные библиотеки являются ценным источником информации для определения новых биологических мишеней и их низкомолекулярных лигандов на основе гомологического подобия соответствующих генов. Подобные систематические исследования позволяют в значительной степени ускорить процесс поиска новых агентов, обладающих мишень-специфичной активностью. Далее приведены некоторые конкретные примеры, объясняющие, как при помощи хемогеномных подходов можно интенсифицировать процесс открытия новых лекарств.
Современные хемогеномные подходы, связанные с изучением взаимодействий лиганд-биомишень, становятся все более популярными в сфере анализа ингибиторов пролиферации раковых клеток, например, с использованием методов биологического скрининга, разработанных в Национальном Институте Рака США (NCI). Одной из первых попыток комплексного хемогеномного анализа взаимодействий лиганд-биомишень стала работа Вейнштейна, опубликованная в 1997 [3]. С применением систематического подструктурного анализа, использующего статистические корреляции между активностью низкомолекулярных органических соединений и характером генной экспрессии, в процессе биологического скрининга на 60-клеточных линиях NCI удалось найти соединения, принадлежащие двум структурным подклассам, степень активности которых в значительной мере коррелировала с экспрессией определенных генов.
В продолжение этих работ в NCI было проведено фундаментальное исследование химического пространства, состоящего из 20,000 химических соединений, на активность по отношению к 80 линиям раковых клеток, с использованием специального алгоритма анализа данных - самоорганизующихся карт Кохонена [4]. Разработанная система классификации может с успехом использоваться для рационального дизайна новых противоопухолевых агентов, что удалось подтвердить в последующих научных работах. Так, с использованием экспрессионного набора состоящего из 400 генов удалось установить характер активности для синтетических соединений, проскринированных на 60 линиях раковых клеток [5]. В результате были обнаружены существенные закономерности между экспрессией мРНК и показателем 50% ингибирования роста опухолевых клеток. Эта работа наглядно проиллюстрировала существование тесной взаимосвязи между характером генной экспрессии и природой химического взаимодействия низкомолекулярного органического лиганда с биологической мишенью.
скрининг на клетках карциномы легких А549
анализ механизмов активности
2036 лидеров 65 активных соединений 16 клинически валидированных
169 механизмов 28 различных механизмов лекарств
действия действия 12 новых механизмов
Рис. 2. Определение новых механизмов действия противоопухолевых соединений с использованием информационной матрицы лиганд-биомишень.
Коллекции известных лигандов с экспериментально установленными и детально изученными механизмами действия могут быть чрезвычайно полезны для исследования возможных путей лекарственной терапии различных заболеваний и определения новых биологических мишеней. Не так давно был опубликован метод, позволяющий находить новые биологические мишени и исследовать механизмы действия лекарственных соединений, с применением технологии клеточных исследований и аннотированных информационных матриц лиганд-биомишень [6]. Аннотированная библиотека представляла собой коллекцию из 2036 биологически активных соединений с 169 различными экспериментально подтвержденными механизмами действия и степенью активности. Эти соединения были протестированы по отношению к карциноме легких А549. По результатам эксперимента удалось обнаружить, что 12 ранее не известных механизмов действия ассоциируются с ингибированием пролиферации изучаемых опухолевых клеток (Рис. 2).
Принципы гомологического подобия структура-активность, сформулированные Фраем в 1999 году [7], позволяют с использованием результатов биологического скрининга на одной конкретной биологической мишени предсказывать активность по отношению к другим биомишеням, обладающим гомологическим строением. Был опубликован целый ряд научных работ, посвященных этой тематике. Например, в научных исследованиях, проводимых компанией Сегер, анализировались свойства более чем 500 лекарственных субстанций, с применением 42 различных биомишеней [8]. В процессе исследования удалось разработать систему оценки подобия между обеими базами лекарств и биологических мишеней на основе так называемых двухцентровых фармакофорных дескрипторов. Было установлено, что лиганды, активные по отношению к определенным подтипам одной биомишени или к родственным типам различных биомишеней, как правило, характеризуются сходным типом взаимодействия, несмотря на невысокую степень гомологии биологических мишеней, например, таких как серотониновые рецепторы и ионные каналы. С другой стороны, сходные по строению лиганды могут обладать совершенно различным характером взаимодействия с биомишенями. Основываясь на концепции гомологического подобия, исследователи из компании Novartis разработали хемогеномную схему для анализа активности низкомолекулярных органических лигандов по отношению к четырем наиболее актуальным классам биологических мишеней: киназные ферменты, рецепторы, связанные с G-белками, ядерные рецепторы и ионные каналы. Предложенная схема базируется на технологии «ш вШео» скрининга и комбинаторного дизайна МСБ [9]. В соответствии с предложенной схемой, дизайн библиотек,
основанный на анализе гомологии биологических мишеней, состоит из нескольких принципиальных этапов. На начальной стадии исследования определяются последовательности генов, кодирующие соответствующие биологические мишени, которые впоследствии подвергаются клонированию и экспрессируются в форме, пригодной для технологии биологического скрининга. Используя аннотированную библиотеку уже известных активных соединений, подбираются наборы новых гомологичных биомишеней. После этой процедуры известные лиганды объединяются в реферативную базу. На заключительной стадии осуществляется поиск потенциальных лигандов по отношению к новой биомишени, с использованием специализированных алгоритмов структурного подобия. Обзор in silico методов скрининга показывает, что подобные методы исследований способствуют нахождению новых лигандов к биомишеням, обладающих определенной степенью гомологии к валидированным биологическим мишеням.
В другой работе аннотированная библиотека, состоящая из низкомолекулярных ингибиторов определенных типов гомологичных ферментов семейства цистеиновых протеаз, была использована для классификации определенного набора протеазных ферментов в соответствующие подсемейства, используя специальные параметры, характеризующие степень их аффинности по отношению к низкомолекулярным органическим лигандам [10]. Разработанная классификационная схема использовалась в целях определения цистеиновых протеаз и предсказания структуры их потенциальных низкомолекулярных лигандов, основываясь на данных кристаллографии.
Аннотированные библиотеки могут использоваться для определения закономерностей в структурах лигандов, активных по отношению к определенным типам биомишеней. Компания Lilly опубликовала данные по хемогеномике киназных ферментов [11]. Эти данные были использованы для создания специального хемогеномного описания 43 различных типов киназ. Консервативность АТФ-сайта связывания для известных киназных ферментов в комплексе с установленными закономерностями позволяют более детально изучать взаимодействия между низкомолекулярными ингибиторами и соответствующими киназными биомишенями. Очевидно, что успехи в сфере хемогеномной классификации киназных ферментов способствуют поиску новых низкомолекулярных ингибиторов. Хемогеномные подходы в настоящее время с успехом используются специалистами компании Lilly в проектах по поиску новых противоопухолевых соединений. «Обратный скрининг» и ускоренное создание инновационных лекарств
Одним из ярких воплощений «постгеномных» подходов, позволяющих существенно повысить эффективность создания отечественных инновационных лекарств, является так называемый обратный скрининг. В отличие от стандартного (прямого) биологического скрининга больших библиотек химических соединений на одной или нескольких биологических мишенях (как правило, выделенные белковые ферменты или рецепторы), в рамках концепции обратного скрининга одно или несколько соединений, обладающих доказанными фармакологическими эффектами, но неизвестными (или не конца понятными) механизмами действия, тестируются на большой панели биомишеней. Последние, как правило, соответствуют определенному спектру патологических состояний. Активность тестируемого соединения по отношению к одной или нескольким биомишеням из данной панели позволяет либо уточнять механизмы действия этого вещества, либо находить новые потенциальные области его терапевтического применения (новые индикации). В последнем случае возможно создание инновационного препарата, причем со значительно меньшими затратами, чем в случае традиционного пути создания новых лекарств. В качестве возможного варианта возникает задача получения химически модифицированных аналогов исходного соединения, обладающих улучшенными фармакологическими параметрами, пониженной токсичностью, оптимизированной фармакокинетикой и пр.
• выяснение механизма действия
• нахождение альтернативных биомишеней, относящихся
к другим терапевтическим индикациям
• нахождение "пехИп-с^Бв" аналогов
Рис. 3. Концепция обратного скрининга.
Некоторые практические воплощения описанной стратегии проиллюстрированы на рисунке 3. При помощи обратного скрининга соединение А, обладающее подтвержденной физиологической активностью (например,
Материалы VIII Международный конгресс «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации»
Стр. [434]
ингибирование роста злокачественной опухоли на животной модели in vivo), может быть протестировано на панели биомишеней, относящихся к противоопухолевой активности, а также к другим потенциальным терапевтическим индикациям (например, противовоспалительная активность). В результате может быть обнаружена биологическая мишень для действия данного соединения (например, фермент семейства протеиновых киназ), что позволит далее перейти к следующим этапам разработки, например, клиническим испытаниям. В ходе обратного скрининга не исключена вероятность нахождения альтернативных биомишеней, не относящихся к подавлению роста опухолей. В этом случае возможно обнаружение новых потенциальных терапевтических индикаций соединения А.
Соединение В, являющееся патентованной ЛС, может быть протестировано на панели биомишеней, относящихся к широкой потенциальной сфере терапевтического применения. В случае нахождения биомишеней отклика для этого вещества, не относящихся к его известной фармакологической активности, появляются серьезные предпосылки для новых терапевтических индикаций с возможностью патентования. Дополнительная возможность связана с обнаружением модифицированных структурных аналогов вещества В, обладающих аналогичным или новым профилем фармакологической активности. Именно в этом состоит суть стратегии создания next-in-class (в переводе с английского - следующий в классе) лекарств.
Еще один сходный вариант связан с тестированием смеси веществ C и D, являющихся патентованными лекарственными субстанциями с определенными клинически совместимыми терапевтическими индикациями. Как и в случае с веществом В, при помощи обратного скрининга возможно обнаружение новых патентоспособных терапевтических индикаций.
Во всех описанных примерах разработчикам удается минимизировать затраты, связанные с ранними стадиями разработки, а также (в случае лекарственных субстанций В-D) - с рядом дорогостоящих этапов клинических испытаний. Возможная экономия ресурсов по сравнению с полным циклом разработки ЛС «с нуля» может составить от 20 до 90%.
На практике для реализации всех этапов исследований, необходимых для проведения обратного скрининга, требуется применение целого комплекса научно-исследовательских технологий «постгеномной эры». Например, один из наиболее популярных подходов связан с применением специальных тест-систем на основе белковых микрочипов. Необходимые элементы этой методологии относятся к дисциплинам геномики, протеомики, комбинаторного химического синтеза, робототехники, молекулярной биологии, компьютерного анализа данных и др. Общая схема функционирования белкового микрочипа приведена на рис. 4.
активированный белковый анализ
микрочип микрочип результатов
Рис. 4. Исследование механизма действия соединения при помощи белкового микрочипа.
В общем случае микрочип состоит из определенного количества микроячеек, каждая из которых содержит индивидуальную белковую биомишень, ковалентно привязанную к микроячейке при помощи специальной химической линкерной системы. Анализируемое лекарственное соединение добавляют к каждой микроячейке, после чего определяют наличие взаимодействия между биомишенью и соединением при помощи различных методов детекции. Способы детекции весьма разнообразны; как правило, применяются методы, основанные на регистрации флуоресцентного, хемилюминесцентного или радиоактивного сигнала. Эта методология дает возможность проводить единовременный анализ большого количества биологических объектов с использованием одного или нескольких тестируемых соединений. В настоящее время разрабатываются белковые микрочипы, содержащие в своей структуре тысячи индивидуальных микроячеек, применение которых позволяет проводить огромное количество микроэкспериментов.
Возможны и другие технологические воплощения концепции обратного скрининга. Например, весьма популярны методы, основанные на ковалентной иммобилизации тестируемого соединения на твердом носителе (например, хроматографической колонке) с последующим добавлением биомишеней и анализом эффективности связывания. Все большую популярность приобретают методы в гомогенных условиях, при которых как
тестируемое соединение, так и белковые биомишени находятся в растворе, а эффективность их взаимодействия
тестируется при помощи специальных систем детекции. ***
Российские ученые-разработчики и производители лекарств оказались сегодня в непростом положении. Засилье «дженериковых» технологий, диктат со стороны крупных фармацевтических концернов в технологической и патентной сферах, материально-технический и кадровый голод отечественной науки, ценовое давление производителей из Юго-Восточной Азии - вот лишь неполный список проблем. В этой ситуации приходится рассчитывать на свои собственные внутренние резервы, главными из которых остаются высококвалифицированные ученые-исследователи, а также нарождающиеся научно-исследовательские компании новой волны. На помощь отечественным разработчикам приходят также новейшие исследовательские технологии «постгеномной эры», позволяющие рационализировать традиционные подходы к разработке столь необходимых стране лекарств. Освоение и широкое применение этих технологий создает реальные предпосылки для решения как минимум двух важнейших задач: перехода к высокотехнологичной фармацевтической индустрии, а также эффективного создания собственных инновационных лекарств.
ЛИТЕРАТУРА
1. Kubinyi H: Chemogenomics in drug discovery. Ernst Schering Res Found Workshop 2006, 58:1-19.
2. Bredel M, Jacoby E: Chemogenomics: An emerging strategy for rapid target and drug discovery. Nature Rev Genetics 2004, 5:262-275.
3. Weinstein JN, Myers TG, O'Connor PM, Friend SH, Fornace AJ Jr, Kohn KW, Fojo T, Bates SE, Rubinstein LV, Anderson NL et al: An information-intensive approach to the molecular pharmacology of cancer. Science 1997, 275:343349.
4. Rabow AA, Shoemaker RH, Sausville EA, Covell DG: Mining the National Cancer Institute's tumor-screening database: identification of compounds with similar cellular activities. J Med Chem 2002, 45:818-840.
5. Wallqvist A, Rabow AA, Shoemaker RH, Sausville EA, Covell DG: Establishing connections between microarray expression data and chemotherapeutic cancer pharmacology. Mol Cancer Therap 2002, 1:311-320.
6. Root DE, Flaherty SP, Kelley BP, Stockwell BR: Biological mechanism profiling using an annotated compound library. Chem Biol 2003, 10:881-892.
7. Frye SV: Structure-activity relationship homology (SARAH): a conceptual framework for drug discovery in the genomic era. Chem Biol 1999, 6:R3-R7.
8. Koch MA, Breinbauer R, Waldmann H: Protein structure similarity as guiding principle for combinatorial library design. Biol Chem 2003, 384:1265-1272.
9. Schuffenhauer A, Zimmermann J, Stoop R, van der Vyver JJ, Lecchini S, Jacoby E: An ontology for pharmaceutical ligands and its application for in silico screening and library design. J Chem Inf Comput Sci 2002, 42:947-955.
10. Greenbaum DC, Arnold WD, Lu F, Hayrapetian L, Baruch A, Krumrine J, Toba S, Chehade K, Bromme D, Kuntz ID, Bogyo M: Small molecule affinity fingerprinting. A tool for enzyme family subclassification, target identification, and inhibitor design. Chem Biol 2002, 9:1085-1094.
11. Vieth M, Higgs RE, Robertson DH, Shapiro M, Gragg EA, Hemmerle H: Kinomics-structural biology and chemogenomics of kinase inhibitors and targets. Biochim Biophys Acta 2004, 1697:243-257.
12. Bondensgaard K, Ankersen M, Thogersen H, Hansen BS, Wulff BS, Bywater RP: Recognition of privileged structures by g-protein coupled receptors. J Med Chem 2004, 47:888-899.
13. Tkachenko SE, Okun I, Balakin KV, Petersen CE, Ivanenkov YA, Savchuk NP, Ivashchenko AA: Efficient optimization strategy for marginal hits active against abl tyrosine kinases. Current Drug Disc Techn 2004, 1:201-210.
14. Zamora I, Oprea T, Cruciani G, Pastor M, Ungell A-L: Surface descriptors for protein-ligand affinity prediction. J
Med Chem 2003, 46:25-33.
