CC BY
16ИЮЛЬ - АВГУСТ 2 Ol О
Конкурс «Лучшая работа молодого ученого»
Экологическая токсикология
УДК 574.64 : 597 + 597- 146.11
Назарова Е. А.
Институт биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина РАН, пос. Борок.
Последовательность морфо-патологических изменений в почках пресноводных костистых рыб при хронической интоксикации солями кадмия.
Показано, что ионы кадмия в сублетальных концентрациях вызывают морфо-па-тологические изменения в почках, выявленные на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях уже на начальном этапе воздействия. Указанные изменения свидетельс-
Введение. Выяснение механизмов адаптаций рыб к различным факторам среды, в том числе и антропогенным, является важным аспектом решения одной из проблем экологии - взаимодействия организма и среды. Согласно концепции биомаркеров, признанной в 1990-е гг., наиболее удачными являются биохимические, физиологические и гистологические показатели. Почки рыб, наряду с печенью и жабрами, являются важнейшими маркерами загрязнения [7]. Среди токсикантов различной природы кадмий решением Европейского сообщества внесен в «черный список» загрязняющих веществ, представляющих наибольшую опасность для гид-робионтов. Показано, что уровень аккумуляции кадмия в почках рыб по сравнению с другими органами наибольший [10]. При этом в большинстве работ представлены данные по влиянию кадмия на ткани мезонефроса у важных в рыбоводстве лососевых и карповых рыб [13, 15, 17], а сведения по исследованию свободноживущих видов представлены скудно. Более того, многие вопросы, касающиеся тонких внутриклеточных перестроек в почках рыб в условиях загрязнения среды
твуют о функциональных нарушениях органа, ослаблении защитных функций организма и могут служить дополнительным гистологическим критерием при проведении мониторинговых исследований по оценке влияния на рыб антропогенных факторов среды.
кадмием, отрывочны и не систематизированы.
Цель работы - выявить последовательность структурных изменений в почках рыб отр. Cypriniformes на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях под действием сублетальных концентраций ионов кадмия.
Материал и методы исследования. Эксперименты проводили на обыкновенном карпе (Cyprinus carpió L.), усатом гольце (Barbatula barbatulo) и речном окуне (Perca fluviatilis). Условия постановки опытов и размерно-массовые характеристики рыб приведены в таблице 1.
Полутонкие срезы готовили на микротоме УМТП-3, окрашивали метиленовым синим по стандартной методике [9]. На микроскопе Olympus СХ31 с препаратов получали цифровые фотографии. Материал для электронной микроскопии фиксировали и обрабатывали по стандартной методике [9]. Ультратонкие срезы готовили на микротоме LKB 8800 и просматривали под электронным микроскопом JEM 1011.
Результаты обработаны статистически в программе Statistica 6.0, онпредставлены в виде средних
Ключевые слова: кадмий, пресноводные рыбы, мезонефрос, клетки.
значений и их стандартных ошибок (x±SE). Для оценки достоверности результатов использовали дисперсионный анализ (ANOVA, LSD-тест) при ¿>=0,05.
Результаты и обсуждение. Результаты исследований показали, что в норме структура интерсти-циальной и нефрогенной тканей и ультраструктура клеток почек карпа, гольца и окуня подобна таковой, описываемой в ранее опубликованных работах [3, 11, 14].
В ходе эксперимента в почках исследованных видов обнаружено развитие воспалительной реакции, включающей 2 взаимосвязанных процесса: альтерация и экссудация ткани. Показано, что эти процессы имеют строго определенную последовательность.
I этап. Альтерация: 1) повреждение митохондрий во всех типах клеток (рис. 1а, б); 2) образование ядерной петли в лейкоцитах, опустошение гранул в гранулоцитах (рис. 1а, б; табл. 2); 3) двукратное увеличение количества секреторных гранул, размыкание межклеточных контактов в проксимальных канальцах; 4) лизис содержимого палочковых клеток (рис. 1в, г); 5) увеличение размеров и количества
Таблица 1
Условия постановки экспериментов, размерно-массовые характеристики рыб.
условия экспериментов вид и возраст рыбы карп(1+) голец(3+) окунь(0+)
1) длина (x±SE), см 2) масса (x±SE), г 1) 17,2±0,9 2) 108±15,6 1) 8,6±1,2 2) 4,2±0,2 1) 9,0±0,6 2) 6,8±1,3
количество особей опыт 20 20 10
контр. 20 20 10
LC 50 (96 ч.) опыт 25 мг/л 25 мг/л 0,1 мг/л
контр. водопроводная вода
концентрация Cd в опыте иону металла) (расчет по опыт 5 мг/л; (0,2 от LC 50) 50 мкг/л; (0,002 от LC 50) 20 мкг/л; (0,2 от LC 50)
контр. водопроводная вода
сроки отбора проб, сут 7, 14, 21, 28 7, 14, 21, 28 7, 14
объем аквариумов, л 150 50 50
изучаемый орган туловищная почка
фагосом в макрофагах (в таблице 3 представлены данные по карпу, клетки окуня и гольца изменялись сходным образом); 6) некробиоз клеток лимфомиелоидной ткани.
Экссудация: 1) гиперемия кровеносных сосудов клубочка, утолщение базальной мембраны бо-уменовой капсулы (рис. 1д, е); 2) инфильтрация нефрогенной ткани эритроцитами, лимфоцитами, ней-трофилами и клетками с радиаль-но расположенными везикулами.
Таблица 2
Влияние сублетальных концентраций кадмия на интенсивность дегрануляции гранулоцитов.
Карп Голец Окунь
Срок N экспозиции Вид рыбы эозинофил (N=10) базофил (N=10) нейтрофил (N=10) эозинофил (N=10) эозинофил (N=10)
Контроль 0,21' 0,08' 0,03' 0,04' 0,07'
7сут 0,792 0,452 0,202 0,04' 1,233
14сут 1,252 3,634 0,463 0,333 0,312
Эксперимен' 21сут 2,903 3,043 4,804 0,282'3
28сут 4,373 3,554 0,583 0,122 __1
Примечание: N - количество исследованных клеток. Значения с различными цифровыми индексами для каждого типа клеток, достоверно отличаются между контролем и экспериментом (p<0,05; ANOVA, LSD тест). Индекс интенсивности дегрануляции гранулоцитов рассчитывали как отношение количества опустошенных гранул к количеству нормальных гранул для данного типа клеток.
Рис.1. I этап структурных изменений в почках исследованных видов.
а - лимфоцит окуня, контроль; б - лимфоцит окуня, 14 суток экспозиции в сублетальной концентрации кадмия; в - палочковая клетка карпа, контроль; г - палочковая клетка карпа, 7 суток экспозиции в сублетальной концентрации кадмия (канал палочковой клетки не сформирован); д - почечное тельце карпа, контроль; е - почечное тельце карпа, 7 суток экспозиции в сублетальной концентрации кадмия. Обозначения: Г - гранулы, ГР - гранулоцит, К - капилляр, КПК - канал палочковой клетки, М - мембрана, МТХ - митохондрии, рМТХ - разрешенные митохондрии, ШЭР - шероховатый эндоплазматический ретикулум, ФО - фибриллярная оболочка, Ц -цитоплазма, ЭР - эритроцит, ЯдП - ядерная петля, Я - ядро.
II этап. Альтерация: 1) расширение цистерн шероховатого эн-доплазматического ретикулума в лимфоцитах и клетках с радиально расположенными везикулами (рис. 2а, б); 2) разрушение эпителиоцитов проксимального отдела канальцев (рис. 2в, г); 3) размыкание межклеточных контактов и последующее разрушение эпителиоцитов дис-тальных участков канальцев. Экс-
судация: появление лейкоцитов и включений в просвете дистальных канальцев (рис. 2д, е).
Ш этап. Альтерация: 1) разрастание соединительной ткани вокруг разрушенных канальцев (рис. 2ж, з); 2) белковая дистрофия интерстициаль-ной ткани (рис. 2 и, к).
Некоторые из наблюдаемых нами морфопатологий зафиксированы у других видов рыб при различных
схемах экспериментов по влиянию токсикантов на почки рыб [2, 5, 16]. Данные патологии приводят к тяжелым функциональным изменениям в органе [13].
По мнению С.М. Короткова и И.А. Скульского [6], основное действие кадмия связано с атакой на сульфгидрильные группы белков мембран и с блокированием дыхательных процессов в митохонд-
Рис.2. II-III этапы структурных изменений в почках исследованных видов.
а - лимфоцит гольца, контроль; б - лимфоцит гольца, 14 суток экспозиции в сублетальной концентрации кадмия; в - участок проксимального канальца гольца, контроль; г - участок проксимального канальца гольца, 21 сутки экспозиции в сублетальной концентрации кадмия; д -участок дистального канальца гольца, контроль; е - участок дистального канальца гольца, 21 сутки экспозиции в сублетальной концентрации кадмия; ж - участок мезонефроса гольца, контроль (окраска метиленовым синим); з - участок мезонефроса гольца, 21 сутки экспозиции в сублетальной концентрации кадмия (окраска метиленовым синим); и - участок мезонефроса карпа, контроль (окраска метиленовым синим); к - участок мезонефроса карпа, 28 суток экспозиции в сублетальной концентрации кадмия (окраска метиленовым синим). Обозначения: БК - боуменова капсула, БКп - белковые капли, В - включения, ДК - дистальный каналец, ЗН - зона некробиоза, Л - лейкоциты, ПК - проксимальный каналец, ПКЦ -просвет канальца, РК - разрушенный каналец, РЛМТ - ретикуло-лимфомиелоидная ткань, СТ - соединительная ткань, ЭПЦ - эпителиоцит. Остальные обозначения те же, что на рис. 1.
Таблица 3
Влияние сублетальных концентраций кадмия на морфометрические параметры
макрофагов карпа (мкм)
Срок экспозиции клетка (ЬИ) N=10 фагосомы
размер (М) количество
Контроль 8,9±0,1х6,6±0,7 4,5±0,5х3,3±0,5 2,0±0,6
Эксперимент 7сут 9,8±1,5х7,5±0,5 5,3±0,5х4,0±0,5 2,5±0,7
14сут 9,9±1,5х6,2±0,5 5,6±0,7х3,5±0,6 4,3±0,6
21сут 12±1,1х8,7±0,9 4,8±0,6х3,6±0,4 5,7±0,8
28сут 11±0,6х7,7±2,4 5,4±0,6х4,3±0,6 4,5±0,6
Примечание: данные представлены в виде средних значений и стандартных ошибок среднего (x±SE). 1 -длина клетки, h -ширина клетки. N -количество исследованных
риях. Эти данные подтверждаются ультраструктурными исследованиями, проведенными в нашей работе, а также результатами других авторов, где для жабр, пронефроса и селезенки рыб показано, что среди прочих мембранных органоидов клеток, митохондрии оказались наиболее чувствительны к действию токсиканта [1, 8].
Увеличение размеров макрофагов за счет увеличения количества и размеров фагосом в этих клетках, наличие разрушенных остатков клеток в фагосомах указывает на гибель большого числа эритроцитов, а также лейкоцитов лимфоидно-го и зернистого рядов дифферен-
цировки. Гибель этих типов клеток позволяет предположить снижение устойчивости рыб к различным заболеваниям. Расширение цистерн шероховатого эндоплазматического ретикулума в цитоплазме лимфоцитов и клеток с радиально расположенными везикулами связано с усилением синтетической функции в клетках, возникшей в результате воздействия токсиканта и не являющейся специфической реакцией на кадмий [4].
Следует отметить, что наши исследования согласуются с ранее опубликованными работами, в которых авторы указывают наибольшую чувствительность проксимальных участков канальцев к действию
ионов металла [16, 17]. Некоторые авторы это явление связывают с тем, что металлотионеины проникают сквозь гломерулы и поступают в клетки проксимального канальца, где деградируют в лизосомах, высвобождая связанные ионы кадмия, в результате чего происходят тяжелые дегенеративные изменения в проксимальных участках канальцев [12]. Увеличение числа секреторных гранул в цитоплазме эпителио-цитов I типа проксимального отдела канальцев, скорее всего, связано с участием этих органелл в деградации металлотионеинов и удалении кадмия из организма.
Выводы.
1. Негативное влияние кадмия выражается в развитии воспалительной реакции почек, выявленной на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях уже на начальном этапе воздействия. Опустошение специфичных гранул гранулоцитов, расширение цистерн шероховатого эндоплазматического ретикулума в лимфоцитах и клетках с радиально расположенными везикулами, увеличение количества и размеров фаго-сом в макрофагах свидетельствуют об усилении секреторной, синтетической и фагоцитарной активности лейкоцитов и способствуют снижению повреждающего эффекта токсиканта. Последовательность проявления выявленных изменений не зависит от концентрации кадмия, вида и возраста рыб.
2. Выявленную нами последовательность изменений в почках под
действием ионов кадмия можно рассматривать как систему неспецифических реакций на действие большинства токсикантов. Данные изменения могут служить дополнительным гистологическим критерием при проведении мониторинговых исследований по оценке влияния на рыб антропогенных факторов среды.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Балабанова Л.В. Влияние кадмия на ультраструктуру иммунокомпетентных клеток селезенки и почек осетра Acipenser baeri Brand^/Би-ол. внутр. вод, 1998.-N 2.-С. 80-85.
2. Бубенкова Е.В. Назарова Е.А. Действие фенола и нафталина на структуру селезенки и туловищной почки карася серебряного//В сб. Биотехнология - охране окружающей среды.-М.: МГУ, 2005.-С. 68-71.
3. Винниченко Л.Н. Сравнительная ультраструктура нефрона. Атлас.-Л.: Наука, 1980.-136 с.
4. Заботкина Е.А., Балабанова Л.В. Изменение ультраструктуры иммунокомпетент-ных клеток селезенки при иммунизации карпа Cyprinus carpió LV/Биол. внутр. вод: информ. бюллетень,1989.-Ы 82.-С. 64-71.
5. Заботкина Е.А., Лапирова Т.Б. Влияние тяжелых металлов на иммуно-физиологический статус рыб//Успехи совр. биологии, 2003.-Т. 123, № 4.-С. 411-418.
6. Коротков С.М., Скульский И.А. Изменение влияния Cd2+ на дыхание изолированных митохондрий печени крысы после их преинкубации с Ca2+, Sr2+, Ba2+, Mn2+ и рутениевым красным// Цитология, 1996.-Т. 38, № 4/5.-С. 500-510.
7. Лукин А.А., Шарова Ю.Н. Оценка качества вод на основе гистологического анализа//Меж-
дун. форум по сохранению местообитаний в Баренцевом регионе. 2005. С.114-116.
8. Матей В.Е. Жабры пресноводных костистых рыб: Морфофункциональная организация, адаптация, эволюция.-СПб.: Наука, 1996.-204 с.
9. Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине.-СПб.: Наука, 1994.-400 с.
10. Моисеенко Т.И., Кудрявцева Л.П., Гашки-на Н.А. Рассеянные элементы в поверхностных водах суши: технофильность, биоаккумуляция и экотоксикология.-М.: Наука, 2006.-261 с.
11. Назарова Е.А. Экологическая пластичность структуры ренальной ткани пресноводных и морских костистых рыб: Автореф.дисс.. .к-та биол. наук.-Борок, 2009.-24с.
12. Райс Р.Х., Гуляева Л.Ф. Биологические эффекты токсических соединений: курс лекций.-Н.: НГУ, 2003.-208 с.
13. Фомин И.В. Функциональные изменения в выделительной системе карповых рыб при отравлении кадмием и нефтью//В сб. XXI век - перспективы развития рыбохозяйственной науки.-Спб.: Наука, 2002.-С. 82-85.
14. Cenini P. The ultrastructure of leucocytes in carp (Cyprinus carpio)//J. of Zoology, 1984.-V. 204, № 4.-P. 509-520.
15. Chowdhury M.J., Donald D.G., Wood C.M. Gastrointestinal uptake and fate of cadmium in rainbow trout acclimated to sublethal dietary cadmium//Aquatic Toxicology, 2004.-V. 69, № 2.-P. 149-163.
16. Madden E.F., Fowler B.A. Mechanisms of nephrotoxicity from metal combinations: A review// Drug and Chemical Toxicology, 2000. V. 23, N 1.-P. 1-12.
17. Singhal R., Jain M. Cadmium induced changes in the histology of kidneys in common carp, Cyprinus carpio (Cyprinidae)//Bull. of Environ. Contam. and Toxicol., 1997.-V. 58, N 3.-P. 456462.
Nazarova Ye.A.
Sequence of morphologic and pathologic changes in kidneys of freshwater bony fishes at a chronic intoxication
by cadmium salts
I.D. Papanin Institute of Inland Waters Biology , Russian Academy of Sciences, settlement Borok Yaroslavl region
It was shown that cadmium ions in sub-lethal concentrations induce morpho-pathologic alterations in fish kidneys which were revealed on tissue, cellular and sub-cellular levels early as at the initial stage of exposure. The said changes witness of functional disturbances in the organ, weakening of the organism protective functions and may serve as additional his-tological criterion in performing monitoring investigations into assessment of exposure of fishes to anthropogenic environmental factors.
Материал поступил в редакцию 26.04.2010 г
