CC BY
79
Вестник Томского государственного университета. Биология. 2013. № 3 (23). С. 91-99
клеточная биология и генетика
УДК 575.89
И.И. Брусенцов1, И.В. Брусенцова1, А.В. Катохин1, В.В. Беспрозванных2, Н.Н. Семенченко3, А.Э. Сазонов4, В.А. Мордвинов1
1 Институт цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск) 2Биолого-почвенный институт ДВО РАН (г. Владивосток) 3 Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр, Хабаровский филиал (г. Хабаровск) 4 Сибирский государственный медицинский университет (г. Томск)
популяционно-генетический анализ и филогеография китайского печеночного
СОСАЛЬЩИКА (Clonorchis sinensis Cobbold, 1875) НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ
Работа проведена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (проект № 16.522.12.2006) и проекта № 19 Интеграция СО РАН.
Clonorchis sinensis относится к эпидемиологически значимым трематодам, так как способен паразитировать у человека, вызывая хроническое заболевание -клонорхоз. В России данный вид встречается только в бассейне р. Амур. В работе впервые исследуется генетическое разнообразие C. sinensis в российской части его ареала с использованием стандартного маркерного фрагмента ДНК -внутреннего транскрибируемого спейсера 1. Были проанализированы 52 особи из пяти отдаленных географических точек, расположенных в Хабаровском и Приморском краях. Полиморфизм маркерного фрагмента исследовался путем анализа данных секвенирования ДНК. Расчет стандартных статистических индексов показал низкое генетическое разнообразие C. sinensis на исследуемой территории. Значение индекса Fst свидетельствует о низкой степени дифференциации изученных популяций. Анализ распределения попарных нуклеотидных различий предполагает недавнее изменение численности вида. Выдвинуто предположение об относительно позднем заселении клонорхом Приморья в результате человеческих миграций.
Ключевые слова: популяционная генетика; филогеография; трематоды; Clonorchis sinensis; Opisthorchiidae.
Введение
Китайский печеночный сосальщик - паразитическая трематода из семейства Opisthorchiidae. Основной ареал вида приходится на страны Восточной и Юго-восточной Азии, в первую очередь Китай [1]. На территории
России паразит распространен только в бассейне р. Амур на Дальнем Востоке [2]. C. sinensis, как и его близкородственные виды Opisthorchis felineus (Rivolta, 1884) и O. viverrini (Poirier, 1886), паразитируя в желчный прото-rax окончательный xозяев - рыбоядный млекопитающиx, включая человека [2], вызывает заболевание клонорxоз. В ряде случаев оно сопровождается тяжелыми осложнениями, в том числе xолангиокарциномой. По данным Международного агентства по изучению рака (IARC) C. sinensis отнесен к канцерогенным факторам первой группы [3].
Первые оценки внутривидового генетического разнообразия C. sinensis были сделаны на основе результатов анализа нуклеотидного полиморфизма в ряде ядерный и митоxондриальныx маркеров у 3-4 особей из разный мест ареала [4, 5]. Кроме того, ранее для ITS1 было выявлено два уровня внутривидовой вариабельности [6]. Однако, несмотря на большое эпидемиологическое значение этого паразитического вида, исследования его популяцион-ной структуры до сиx пор не проводились.
Популяционно-генетические исследования паразитическиx видов позволяют оценить степень иx генетического разнообразия и имеют огромное значение в понимании процессов, проxодящиx в иx m^^umx в прошлом и в настоящее время. Понимание факторов, определяющиx популяционно-генетическую структуру у трематод со сложным жизненным циклом, может иметь решающее значение для мероприятий, направленный на санитарно-эпидемиологический контроль трематодозов.
В настоящее время для популяционно-генетическиx исследований широко используются маркерные фрагменты ДНК (митоxондриальные гены, ITS1 и ITS2, микросателлитные последовательности), имеющие достаточную вариабельность, чтобы оценить генетическое разнообразие в природные m^^umx и реконструировать фитогеографию видов. ITS1 является некодирующим участком в кластере рибосомальныгс генов и эволюционирует гораздо быстрее, чем последовательности собственно рибосомальныгс РНК, а также ядерный белок-кодирующиx генов [7]. В результате высокой вариабельности ITS1 часто используется для решения филогенетическиx и популяционныx задач, в том числе и у трематод [8].
Цель работы - изучить генетическое разнообразие C. sinensis на российской части его ареала.
Материалы и методики исследования
Метацеркарии C. sinensis были собраны из мышечной ткани карповые рыб (Cyprinidae): гольяна озёрного (Phoxinus percnurus, Pallas, 1814), горчака обыкновенного (Rhodeus sericeus, Rhodeus sericeus, Pallas, 1776), желтощёка (Elopichthys bambusa, Richardson, 1845) и амурского чебачка (Pseudorasboraparva, Temminck и Schlegel, 1846), отловленный в треx гео-
графических точках: в Анученском (р. Арсеньевка) и Дальнереченском (р. Б. Уссурка) районах Приморского края и в г. Хабаровске (о. Б. Уссурийский, р. Амур) (рис. 1).
Рис. 1. Места сбора образцов C. .sinensis. Вверху для каждого района показано количество проанализированных образцов
Из 26 образцов ДНК была выделена стандартным фенол-хлороформным методом [9]. Для ПЦР и секвенирования использовались следующие праймеры: прямой 5'-GTCGTAACAAGGTTTCCGTA и обратный 5'-ACAC-GAGCCGAGTGATCC с температурой отжига 59°C. ПЦР проводилась в общем объеме 20 мкл (250 мкМ dNTP, 25 мкМ dUTP, праймеры по 200 нМ каждого, 0,1 ед. урацил-ДНК-гликозилазы (Fermentas), 1,5 мМ MgCl2, 1,5 ед.
TrueStart Hot Start Taq DNA polymerase (Fermentas) и соответствующий ей ПЦР буфер) при следующиx условияx: 37°С - 5 мин, 94°С - 2 мин, 10 циклов: 94°С - 10 с, 69°С, декремент -1°С за цикл - 20 с, 72°С - 40 с, 20 циклов: 94°С - 10 с, 59°С - 20 с, 72°С - 40 с, финальная элонгация при 72°С -
5 мин. Секвенирование проводилось по методу Сэнгера с использованием BigDye terminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems, USA). Продукты реакции Сэнгера были проанализированы на приборе ABI 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). Последовательности депонированы в Genbank (KC987514-539). Последовательность наиболее представленного гаплотипа наxодится в Genbank под номером KC987514.
Кроме полученные нами данные, мы также использовали 26 последовательностей фрагмента ITS1 C. sinensis, депонированные в Genbank с номером JQ048576-601 из Спасского (с. Кронштадтка) и Уссурийского (с. Кондратеновка) районов (см. рис. 1) [6]. Таким образом, для анализа была подготовлена выборка из 52 последовательностей; использовался фрагмент позиций 153-607 (JQ048601). Суммарно было оxвачено 5 географически точек (см. рис. 1).
Расчет стандартные статистик генетического разнообразия и оценка демографической динамики вида были проведены с помощью программы DnaSP 4.5 [10]. Медианная сеть гаплотипов была построена методом median joining в программе Network 4.6 [11]. Степень дифференциации популяций рассчитана в программе Arlequin 3.5 [12].
Результаты исследования и обсуждение
Анализ нуклеотидного полиморфизма во фрагменте ITS1 выявил низкое генетическое разнообразие у C. sinensis в Приморье. Анализируемый фрагмент был представлен двумя формами: 92,3% последовательностей имели 450 п.о., а 7,7% - 455 п.о. Различие последовательностей по длине объясняется разным количеством повторов (GCCTG). Было найдено всего
6 гаплотипов. Доля полиморфные позиций (S) составила 1,8% (8 пар оснований, из которые 5 приxодится на инсерцию / делецию (И/Д)). Индекс генного (гаплотипического) разнообразия (Hd) - 0,21 ± 0,05, нуклеотидного (п) - 0,0006 ± 0,0002.
Далее мы провели оценку различий между 5 популяциями, использованными в анализе. Согласно S. Wright, полученное значение индекса Fst (0,045; р = 0,059) свидетельствует о низкой степени иx дифференциации [13].
При построении сети гаплотипов было выявлено значительное преобладание одного (мажорного) гаплотипа, доля которого составила 88,5%. Из оставшиxся 5 гаплотипов 3 были синглетными, т.е. встретились только у одной особи (рис. 2). Максимальное расстояние между гаплотипами составило 3 нуклеотидные замены и одну И/Д 5 оснований, т.е. оно является относительно большим для такой слабоструктурированной сети.
Рис. 2. Медианная сеть гаплотипов C. sinensis.
Указаны частоты гаплотипов в выборке, размер узла сети пропорционален частоте гаплотипа. Цветовая кодировка обозначает места сбора образцов и соответствует таковой на рис. 1
Таким образом, мы показали, что исследованная территории клонорха характеризуют:
1) низкое генетическое разнообразие;
2) низкие различия между популяциями;
3) бедная гаплотипическая сеть с преобладанием одного гаплотипа.
Наблюдаемую нами картину можно объяснить экспансией вида после
переселения небольшой группы на новые территории («эффект основателя», когда происходят снижение разнообразия и случайное смещение частот гаплотипов) или после прохождения видом «узкого бутылочного горлышка» на занимаемой им ранее территории. Формирование подобной структуры под действием отбора (преобладание одного гаплотипа вследствие его приспособительного преимущества) можно исключить, поскольку ITS1 считается селективно нейтральным участком ДНК.
Многие виды палеоарктической зоны претерпели снижение численности в результате геоклиматических событий плейстоцена с последующей экспансией из небольшой предковой группы, сохранившейся в убежищах (рефугиумах) [14]. В нашей работе, посвященной O. felineus, было показано крайне низкое разнообразие вида на огромной территории и высказано предположение о восстановлении этого вида из популяции с низкой численностью и бедным генофондом [15]. Напротив, у другого близкородственного вида O. viverrini, ареал которого ограничен бассейном р. Меконг в тропических широтах, было показано высокое генетическое разнообразие и наличие разветвленной сети гаплотипов [16]. К сожалению, фактически нет работ, исследующих генетическое разнообразие клонорха на территории его обширного ареала, приходящегося как на умеренную, так и на субтропическую климатические зоны.
Для подтверждения гипотезы об экспансии вида мы провели оценку динамики численности C. sinensis на российской части ареала с помощью анализа распределения попарных нуклеотидных различий. Было получено унимодальное L-образное распределение замен (рис. 3), что позволяет предположить недавнее изменение численности вида на российской части его ареала. Этот анализ также позволяет оценить параметр т (т = 2ut; t - время,
рассчитанное в поколениях; u - скорость накопления мутаций в последовательности за поколение). Для шистосом (Schistosomatidae, Trematoda) было показано, что скорость накопления мутаций составляет 0,8% за миллион лет [17]. Используя данные С.А. Беэра о том, что смена поколений у близкородственного вида O. felineus происходит за один год, мы приняли такую же оценку для C. sinensis [18] и рассчитали, что изменение численности C. sinensis на изучаемой территории началось порядка 4,5 тыс. лет назад.
0,8
0,Б
0,4
0,2
0,
0 5 10 15 20
Попарные различия
Рис. 3. Распределение попарных нуклеотидных различий.
Зеленая сплошная линия - значения, ожидаемые для модели растущей популяции, красная пунктирная - полученные нами значения
Во время плейстоценовых похолоданий климат на изучаемой территории был значительно холоднее современного. Несмотря на отсутствие ледового щита, повсеместно встречались участки вечной мерзлоты, и долины были заболочены [19]. Таким образом, условия были непригодны для существования C. sinensis. Поскольку основной современный ареал C. sinensis расположен на территории Китая, то логично предположить, что заселение изучаемой территории произошло именно оттуда по завершению ледникового периода. Однако на пути естественной миграции из Восточной Азии на Дальний Восток России присутствует географический барьер - Малый Хинган и Мань-чжуро-Корейские горы, являющиеся серьезным препятствием для диких животных [20, 21]. Поскольку данные археологических раскопок свидетельствуют о появлении активных миграций человеческих племен на территории Маньчжурии начиная с 6,5 тыс. лет назад, можно предположить, что основную роль в заселении Приморья клонорхом мог сыграть человек [22].
Заключение
Таким образом, показано низкое генетическое разнообразие C. sinensis на изучаемой территории. Филогеографический анализ вида позволил предположить, что подобная картина могла сформироваться вследствие недавнего проникновения вида на Дальний Восток России, имевшего место приблизительно 4,5 тыс. лет назад и предположительно связанного с миграциями человека.
Литература
1. Посохов П.С. Клонорхоз в Приамурье. Хабаровск : Изд-во Дальневосточ. гос. мед. ун-
та, 2004. 187 с.
2. Беспрозванных В.В., Ермоленко А.В., Румянцева Е.Е. и др. Нозоареалы клонорхоза в
Приморском крае // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2012. № 2. С. 7-14.
3. Bouvard V., Baan R., Straif K. et al. A review of human carcinogens--Part B: biological
agents // The lancet oncology. 2009. Vol. 10, № 4. P. 321-322.
4. Lee S., Huh S. Variation of nuclear and mitochondrial DNAs in Korean and Chinese iso-
lates of Clonorchis sinensis // The Korean journal of parasitology. 2004. Vol. 42, № 3. P. 145-148.
5. Park G-M. Genetic comparison of liver flukes, Clonorchis sinensis and Opisthorchis viver-
rini, based on rDNA and mtDNA gene sequences // Parasitology research. 2007. Vol. 100, № 2. P. 351-357.
6. Tatonova Y., Chelomina G., Besprosvannykh V. Genetic diversity of nuclear ITS1-5.8S-ITS2
rDNA sequence in Clonorchis sinensis Cobbold, 1875 (Trematoda: Opisthorchidae) from the Russian Far East // Parasitology international. 2012. Vol. 61, № 4. P. 664-674.
7. Hwang U.W., Kim W. General properties and phylogenetic utilities of nuclear ribosomal DNA
and mitochondrial DNA commonly used in molecular systematics // The Korean journal of parasitology. 1999 Vol. 37. P. 215-228.
8. NolanM., Cribb T. The use and implications of ribosomal DNA sequencing for the discrimi-
nation of digenean species // Advances in parasitology. 2005. Vol. 60, № 2. P. 101-163.
9. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 2344 p.
10. Rozas J., Sanchez-DelBarrio J., MesseguerX., RozasR. DnaSP, DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods // Bioinformatics (Oxford, England). 2003. Vol. 19, № 18. P. 2496-2497.
11. Bandelt H., Forster P., Röhl A. Median-joining networks for inferring intraspecific phylogenies // Molecular biology and evolution. 1999. Vol. 16, № 1. P. 37-48.
12. Excoffier L., Laval G., Schneider S. Arlequin (version 3.0): an integrated software package for population genetics data analysis // Evolutionary bioinformatics online. 2005. Vol. 1. P. 47-50.
13. Wright S. Evolution and Genetics of Population. Chicago : University of Chicago Press, 1978. 590 p.
14. HewittG. Post-glacial re-colonization of European biota // Biological Journal of the Linnean Society. 1999. Vol. 68, № 1-2. P. 87-112.
15. Brusentsov I.I., Katokhin A.V., Brusentsova I.V. et al. Low Genetic Diversity in WideSpread Eurasian Liver Fluke Opisthorchis felineus Suggests Special Demographic History of This Trematode Species // PloS one. 2013. Vol 8(4). e62453.
16. Thaenkham U., NuamtanongS., Sa-nguankiatS. etal. Monophyly of Opisthorchis viverrini populations in the lower Mekong Basin, using mitochondrial DNA nadl gene as the marker // Parasitology international. 2010. Vol. 59. P. 242-247.
17. DespresL., Imbert-EstabletD., Combes C., Bonhomme F. Molecular evidence linking hom-inid evolution to recent radiation of schistosomes (Platyhelminthes: Trematoda) // Molecular phylogenetics and evolution. 1992. Vol. 1, № 4. P. 295-304.
18. Беэр С.А. Биология возбудителя описторхоза. М. : Тов-во науч. изд. КМК, 2005. 336 c.
19. Белянин П. Растительность междуречья рек Уссури и Сунгач в позднем плейстоцене (Приморский край). Актуальные проблемы палеогеографии и стратиграфии плейстоцена. М. : Географ. факультет МГУ, 2010. С. 14.
20. Driscoll C., Yamaguchi N., Bar-Gal G. et al. Mitochondrial phylogeography illuminates the origin of the extinct caspian tiger and its relationship to the amur tiger // PloS one. 2009. Vol. 4, № 1. P. e4125.
21. Shi Y., Cui Z., Li J. Reassessment of Quaternary glaciation problems in East China. Earth Sciences 2 / ed. by G. Tu // Advances in Science of China: Earth Sciences. 1987. P. 45-54.
22. ВострецовЮ. Приморские охотники-собиратели и земледельцы бассейна Японского моря: адаптация и взаимодействие в среднем и позднем голоцене (6500-1800 лет назад) : автореф. дис. ... д-ра ист. наук. СПб., 2010. 64 c.
Поступила в редакцию 15.06.2013 г.
Tomsk State University Journal of Biology. 2013. № 3 (23). Р. 91-99
Ilja I. Brusentsov1, Irina V. Brusentsova1, Alexey V. Katokhin1, Vladimir V. Besprozvannykh2, Nadezhda N. Semenchenko3, Alexey E. Sazovov4, Viatcheslav А. Mordvinov1
1 Institute of Cytology and Genetics of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia
2 Institute of Biology and Soil Science of the Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences, Vladivostok, Russia
3Pacific Research Fisheries Centre, Khabarovsk, Russia
4Siberian State Medical University, Tomsk, Russia
POPULATION GENETIC ANALYSIS AND PHYLOGEOGRAPHY OF CHINESE LIVER FLUKE (Clonorchis sinensis Cobbold, 1875) FROM THE RUSSIA
This work was partially supported by the Ministry of education and science of Russia project № 16.522.12.2006 and the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences (interdisciplinary integration project № 19 and 52).
In the present work, genetic diversity and phylogeography of the Far Eastern population of the liver fluke Clonorchis sinensis has been studied using nuclear rDNA internal transcribed spacer 1 (ITS1) sequences. C. sinensis is a causative factor of serious pathologies in humans. It is widely distributed in East Asia, but in Russia it is only found in the Far East. 26 metacercarian samples were collected at three distant localities in Khabarovsk and Primorsky Krai and were subjected to ITS1 sequencing. We also used 26ITS1 sequences of C. sinensis from Primorsky Krai (two localities), which were previously deposited in GenBank. Statistical analysis was performed using the program DnaSP 4.5 and Arlequin 3.5. The median haplotype network was
nonyn^uoHHO^eHemunecKuu aHanui u $uwгеогрa$un
99
constructed by median joining using Network 4.6. Standard statistics showed low genetic diversity in the studied population: S, the number of polymorphic positions was 1.8%; Hd, haplotype diversity, was 0.21 ±0.05; and n, nucleotide diversity, was 0.0006 ± 0.0002. The obtained value of Fst was 0.045, which is indicative of low genetic differentiation.
To establish the genealogical relationships between the haplotypes, we constructed a statistical parsimony network. It was found out that one major haplotype was identified in 88.5% of the sampled individuals. Of other five haplotypes, three were unique (singlets). The maximum distance between haplotypes was 3 SNP and one indel (5 substitutions). To estimate the population dynamics of C. sinensis in Russian part of the area, the analysis of pairwise nucleotide differences distribution was conducted. Unimodal mismatch distribution suggests a recent change in population size. Therefore, we believe that our data are consistent with a "founder effect" hypothesis, when a small number of migrants that were not genetically representative of the ancestral population have colonized a new area. To estimate the expected time of the species expansion, we used substitution rate (0.8%/MY) previously established for Schistosoma species (Schistosomatidae, Trematoda). Based on these data, C. sinensis expansion began approximately sooner than 4.5 kBP. We conclude that the outspread of the studied species to the Russian Far East territory could be due to the Holocene migration of the final hosts including humans.
Key words: population genetics; phylogeography; Trematoda; Clonorchis sinensis; Opisthorchiidae.
Received June 15, 2013
