CC BY
11
УДК [575.174.015.3:582.542.1](829.3)
ПОПУЛЯЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ DESCHAMPSIA ANTARCTICA ИЗ ДВУХ РЕГИОНОВ ПРИМОРСКОЙ АНТАРКТИКИ
И.О. Андреев1, Е.В. Спиридонова1, С.С. Киръяченко2, И.Ю. Парникоза1, Д.Н. Майданюк13, Р.А. Волков4, И.А. Козерецкая2, В.А. Кунах1
(1Институт молекулярной биологии и генетики HAH Украины, г. Киев, Украина; 2Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, г. Киев, Украина; 3Луганский национальный университет имени Тараса Шевченко, г. Луганск, Украина; 4 Черновицкий национальный университет имени Юрия Федьковича, г. Черновцы, Украина; e-mail: i.o.andreev@imbg.org.ua)
Сравнительный анализ последовательностей участка ITS1-2 рДНК D. antarctica показал, что после ледникового периода в Антарктику могли мигрировать растения вида с различными генотипами. Применение RAPD-маркеров обнаружило различия в уровне полиморфизма между популяциями D. antarctica, расположенными в разных широтах, а также ограниченность обмена генетическим материалом между ними.
Ключевые слова: Deschampsia antarctica, RAPD-анализ, ITS рДНК, Антарктика.
Deschampsia antarctica Desv. является одним из двух аборигенных цветковых растений антарктической флоры, точное время и направление проникновения которых в Антарктику остаются неясными. В связи с этим необходим поиск маркеров, позволяющих прояснить эти вопросы. Целью работы была оценка генетического полиморфизма D. antarctica из двух регионов Приморской Антарктики методом RAPD-анализа и путем сравнения нуклео-тидных последовательностей ITS рДНК.
Материалы и методы
Изучено 15 растений D. antarctica из Приморской Антарктики, 9 из которых собраны в окрестностях Аргентинских о-ов, а остальные — на о-ве Кинг-Джордж (арх. Южные Шетландские о-ва). Координаты мест сбора растений опубликованы ранее [1, 2]. ДНК выделяли, как описано в работе [3]. Для RAPD-анализа использовали 30 десятинуклео-тидных праймеров. ПЦР, разделение продуктов и анализ результатов проводили, как описано ранее [3]. Расчет количества полиморфных локусов, генетических расстояний по Жакарду с последующей кластеризацией всех образцов методом UPGMA, индекса разнообразия Шеннона и молекулярной вариан-сы (AMOVA) выполняли при помощи программы FAMD 1.21beta [4].
Участок ядерного гена 18S-25S рРНК, включающий ITS1, ген 5.8S рРНК и ITS2, амплифициро-вали со специфическими праймерами к концевым участкам генов 18S и 25S рРНК [5]. Продукты клонировали c использованием вектора pBluescript II
SK(+). Последовательности ДНК определяли с использованием набора "fmol DNA Cycle Sequencing System" (Promega, США) на автоматическом секве-наторе ABI PRISM 3100-AVANT. Полученные последовательности депонированы в GeneBank под номерами GU181209—GU181220. Сравнение нукле-отидных последовательностей рДНК и построение дендрограмм проводили с помощью программы PAUP 4.0b10 [6].
Результаты и обсуждение
Анализ полиморфизма рДНК. Определена последовательность клонированного участка рДНК, содержавшего ITS1, 5,8S рДНК и ITS2, из 12 растений D. antarctica, собранных в разных районах Приморской Антарктики. Длина анализируемого фрагмента была одинаковой для всех клонов, совпадала с размером этого участка рДНК D. antarctica из Южной Америки (арх. Огненная Земля и Фолклендские о-ва), представленного в GenBank (AM041213—AM041215), и составляла 595 п.н. ITS1 и ITS2 имели длину 217 и 215 п.н. соответственно. Последовательности клонов сходны на 96,3%, наибольшее количество вариабельных нуклеотидов обнаружено в ITS1 (6,5%), меньшее — в ITS2 (2,3%) и наименьшее — в гене 5,8S рРНК (1,8%).
Методами объединения соседей и максимальной экономии построены дендрограммы, отражающие сходство последовательностей участка ITS1-2 D. antarctica из разных популяций (рисунок, а). В качестве внешней группы использовали D. laxa, D. elongata, D. tenella из Ю. Америки и Новой Зеландии, последовательности ITS1-ITS2 которых имеются в Gen-
Дендрограмма, построенная методом объединения соседей для участка 1Т81-2 рДНК Б. аМагсйса и родственных видов (а). Приведены значения бутстреп-поддержки узлов; Дендрограмма генетического подобия, построенная методом иРОМА на основании
коэффициентов Жакарда по результатам ИАРБ-анализа (б)
Bank (AM041238, AM041230, AM041244). Дендро-граммы, построенные обоими методами, были практически идентичны и отличались лишь величинами бутстреп-поддержки отдельных ветвей. Полученные результаты с высокой достоверностью показывают принадлежность изученных представителей D. antarctica к одной монофилетической группе.
Сравнение последовательностей показало, что у D. antarctica имеется как минимум четыре варианта ITS1-ITS2, отличающихся между собой по отдельным нуклеотидам. Эволюционно исходным был вариант № 1, характерный для растений из Ю. Америки. В большинстве популяций из Антарктики выявлен производный от него вариант № 2, отличающийся одной нуклеотидной заменой в ITS1. Вариант № 3, обнаруженный в трех антарктических образцах (о. Ялур 1, о. Уругвай, о. Кинг-Джордж 5), происходит от варианта № 2, отличаясь от него двумя заменами в ITS1 и ITS2. Наиболее своеобразным является вариант № 4 из образца 6 с о-ва Кинг-Джордж, занимающий на дендрограмме базальное положение (рисунок, а). Он отличается от наиболее близкой к нему последовательности из Ю. Америки (Огненная Земля 1) восемью нуклеотидными заменами, из которых семь приходятся на ITS1 и одна — на ITS2.
Считается, что формирование современной флоры Антарктики происходило после окончания последнего оледенения за счет миграции растений из Субантарктики. Полученные данные показывают, что в метапопуляции D. antarctica о. Кинг-Джордж присутствуют три варианта рДНК (№ 2, 3 и 4), а у растений с Аргентинских о-ов — два варианта (№ 2 и 3), которые отличаются от варианта № 1, характерного для растений с Огненной Земли и Фолклендских о-ов. Можно предложить два объяснения этим данным: 1) полиморфизм участка ITS1-2 в антарктических популяциях D. antarctica обусловлен
неоднократной миграцией растений из генетически различных популяций из-за пределов Антарктики; 2) антарктические варианты 1Т81-2 возникли уже на территории Антарктики после иммиграции растений. Второе объяснение представляется логичным для эволюционно производных вариантов № 2 и 3, которые отличаются лишь отдельными мутациями. Появление вариантов № 2 и 3 произошло, очевидно, на ранних этапах колонизации Антарктики, поскольку сегодня оба варианта достаточно широко распространены. В то же время обнаружение на о. Кинг-Джордж уникального варианта № 4 подтверждает представления о формировании генофонда Б. аШагсйса в Антарктике на основе нескольких исходных генотипов. Окончательное прояснение происхождения варианта № 4 требует дополнительных исследований с привлечением большего количества образцов растений из разных географических районов.
ЯЛРВ-анализ. Всего было получено 289 ампли-конов, 28 (9,7%) из которых оказались полиморфными. На построенной дендрограмме растения сгруппировались в два кластера в соответствии с географическим происхождением (рисунок, б). Анализ молекулярной вариансы (АМОУА) показал, что географическая удаленность популяций, расположенных на расстоянии около 450 км, позволяет объяснить более половины (58%) генетического полиморфизма проанализированной выборки растений. Четкое деление образцов на две группы свидетельствует об ограниченности обмена генетическим материалом между ними. В то же время внутри групп распределения образцов в соответствии с местом сбора не наблюдается, что указывает на отсутствие существенных барьеров репродуктивной изоляции в пределах каждой географической группы. Последнее можно объяснить переносом растений и семян Б. аШагсйса на небольшие расстояния между островами птицами.
Между двумя географическими группами популяций Б. аМагсИеа обнаружены отличия в уровне генетического полиморфизма: доля полиморфных фрагментов для растений с Аргентинских о-ов составила 3,4%, а для растений с о. Кинг-Джордж — 6,2%; значение индекса Шеннона, характеризующего генное разнообразие, — 0,015 и 0,024 соответственно. Эти отличия контрастируют еще больше, если учесть размер территории сбора образцов. Растения с о. Кинг-Джордж собраны на небольшом участке вблизи польской станции "Арцтовский", за исключением одного образца (№ 6) из окрестностей бразильской станции "Команданте Ферраз", удаленной примерно на 9 км. Образцы второй группы собраны с нескольких островов, расстояние между самыми удаленными из которых (о-ва Берселот и Питерман) около 17 км. Можно назвать, по крайней мере, две причины выявленных различий в уровне генетического полиморфизма между группами растений с о. Кинг-Джордж и Аргентинских о-ов. Одна — более позднее заселение последних и проявление эффекта основателя. С этим вполне согласуется обнаружение на о. Кинг-Джордж уникального варианта 1Т81-2, которое указывает, что генофонд этой метапопуляции, вероятно, формировался на основе более разнообразного материала в результате скрещивания между растениями, имеющими различное происхождение.
Другой причиной сравнительно низкого генетического разнообразия растений Аргентинского архипелага можно считать более суровые климати-
ческие условия (этот район расположен примерно на 330 км дальше от экватора), воздействие которых проявляется в более жестком естественном отборе либо периодическом сокращении численности популяций, результатом чего является снижение генетической гетерогенности.
Выводы
Сравнительный анализ последовательностей участка 1Т81-2 рДНК показал присутствие в антарктических популяциях Б. аШаССа вариантов, отличающихся специфическими мутациями от растений с Огненной Земли и Фолклендских о-вов. Обнаруженный в антарктических популяциях полиморфизм рДНК можно объяснить как объединением различных генотипов, попавших сюда в результате нескольких миграций, так и позднейшим появлением новых мутаций. ИАРО-методом выявлена принадлежность изученных растений к двум группам в соответствии с географическим происхождением, а также установлены различия в уровне генетического полиморфизма между популяциями,
расположенными в разных широтах.
* * *
Работа выполнена при поддержке Украинского Национального Антарктического центра, Отдела биологии Антарктики Польской академии наук и лично проф. 8. Каки8-8ш2С2е»8к1, а также гранта Президента Украины для молодых ученых (0Р/Р11/0048).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Parnikoza I.Yu., Miryuta N.Yu, Maidanyuk D.N, Lo-parev S.A, Korsun S.G., Budzanivska I.G., Shevchenko T.P, Polischuk V.P., Kunakh V.A, Kozeretska I.A. Habitat and leaf cytogenetic characteristics of Deschampsia antarctica Desv. in the Maritime Antarctica // Polar Science. 2007. Vol. 1. P. 121—128.
2. Kozeretska I.A, Parnikoza I.Yu., Mustafa O., Tyschen-ko O.V., Korsun S.G., Convey P. Development of Antarctic herb tundra vegetation near Arctowski station, King George Island // Polar Science. 2010. Vol. 3. P. 254—261.
3. Спиридонова E.B., Адноф Д.М., Андреев И.О., Кунах В.А. Стабильность генома высокопродуктивной клеточной линии К-27 Rauwolfia serpentina Benth. при изме-
нении условий выращивания // Biopolymers and Cells. 2007. T. 23. № 2. С. 86-92.
4. Schlüter P.M., Harris S.A. Analysis of multilocus fingerprinting data sets containing missing data // Mol. Ecol. Notes. 2006. Vol. 6. P. 569-572.
5. White T.J., Bruns T., Lee S., Taylor J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics // PCR protocols: a guide to methods and applications / Eds. M. Innis, D. Gelfand, J. Sninsky, T. White. San Diego: Academic Press, 1990. P. 315—322.
6. Swofford D.L. PAUP*: Phylogenetic analysis using parsimony (* and other methods). Version 4. Champaign, Illinois: National Illinois History Survey, 2002.
Поступила в редакцию 10.04.10
POPULATION GENETIC ANALYSIS OF DESCHAMPSIA ANTARCTICA FROM TWO REGIONS OF MARITIME ANTARCTICA
I.O. Andreev, E.V. Spiridonova, S.S. Kyryachenko, I.Yu. Parnikoza, D.N. Maidaniuk, R.A. Volkov, I.A. Kozeretska, V.A. Kunakh
Comparative sequence analysis of the ITS1-2 region of the rDNA of D. antarctica indicate that genetically distinct plants of the species migrated to Antarctica during the post-glacial period. Ap-
plication of RAPD-markers revealed the difference in the levels of polymorphism between populations of D. antarctica from different latitudes as well as the limited gene flow between them.
Key words: Deschampsia antarctica, RAPD-analysis, ITS rDNA, Antarctica. Сведения об авторах
Андреев Игорь Олегович — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. Института молекулярной биологии и генетики НАН Украины. Тел. +380445260798; e-mail: i.o.andreev@imbg.org.ua
Спиридонова Екатерина Васильевна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. ИМБиГ НАНУ. Тел. +380445260798; e-mail: i.o.andreev@imbg.org.ua
Киръяченко Сергей Сергеевич — канд. биол. наук, ассистент Киевского национального университета имени Тараса Шевченко. Тел. +38044 5223995; e-mail: skyryachenko@gmail.com Парникоза Иван Юрьевич — канд. биол. наук, науч. сотр. ИМБиГ НАНУ. Тел. +380445260798; e-mail: parnikoza@gmail.com
Майданюк Дмитрий Николаевич — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. Луганского национального университета имени Тараса Шевченко. Тел. +380642537267; e-mail: redmaidan@gmail.com Волков Роман Анатолиевич — докт. биол. наук, проф., зав. каф. молекулярной генетики и биотехнологии Черновицкого национального университета имени Юрия Федьковича. Тел. +380372584793; e-mail: ra.volkov@gmail.com
Козерецкая Ирина Анатольевна — канд. биол. наук, доцент Киевского национального университета имени Тараса Шевченко. Тел. +38044 5223995; e-mail: kozeri@gmail.com
Кунах Виктор Анатольевич — член-корр. НАН Украины, докт. биол. наук, проф., зав. отделом ИМБиГ НАНУ. Тел. +380445260798; e-mail: kunakh@imbg.org.ua
