CC BY
16УДК 577.21:638.12
Е. В. Гузенко
ПОПУЛЯЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПЧЕЛОСЕМЕЙ APIS MELLIFERA L., РАЗВОДИМЫХ НА ПАСЕКАХ МИНСКОЙ ОБЛАСТИ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: e.guzenko@igc.by
В статье представлены данные молекулярно-генетического анализа пчелосемей, разводимых на пасеках Минской области (Беларусь). Определены информативные SSR-маркеры, позволяющие с высокой степенью достоверности выявлять межсемейный и внутрисемейный полиморфизм, устанавливать чистоту и гибридность пчелосемей. Моделирование в программе STRUCTURE v.2.3.4 позволило дифференцировать исследуемые пчелосемьи на три кластера. Точность принадлежности варьировала от 79,3 до 99,3%. Выявлены пчелосемьи с разной степенью метизации. Рассчитанное значение индекса фиксации F (в среднем 0,107) свидетельствовало о преобладании гетерозигот в исследуемых пчелосемьях, а значение Ho < He — об интенсивном процессе межпородной гибридизации. Анализ мтДНК установил два варианта локуса COI-COII мтДНК — PQ и Q, что свидетельствует о принадлежности образцов к эволюционным линиям М и С.
Ключевые слова: медоносная пчела, Apis mellifera L., гибридизация, метизация, молекулярно-генетические методы идентификации, анализ митохондриальной ДНК, анализ ядерной ДНК.
Введение
Медоносные пчелы (Apis mellifera L., Hymenoptera: Apidae) — основные насекомые-опылители на нашей планете. Облетая около 80% дикорастущих и культурных растений, п способствуют получению максимальных урожаев. Опыление пчелами положительно отражается на питательных и вкусовых качествах плодов и посевных кондициях семян [1]. С каждым годом растет актуальность исследований, связанных с изучением биологии медоносных пчел. Это обусловлено негативными процессами, такими как уменьшение биоразнообразия и снижение количества пчелиных семей, наблюдаемыми в большинстве стран. Так в Европе за последние 20 лет количество пчелосемей снизилось на 16% [2], в США ежегодные потери приближаются к 50% [3]. Среди генетических причин, вызывающих резкое сокращение численности пчелосемей, называют массовую гибридизацию вследствие бесконтрольного завоза и научно-необоснованного разведения пчел.
В результате гибридизации пчелы теряют
комплекс адаптивных признаков [4]. Показано, что гибридные пчелы менее устойчивы к абиотическим стресс-факторам [5, 6], воздействию пестицидов [7, 8], характеризуются пониженным иммунитетом [9, 10], что повышает их восприимчивость к паразитам [11, 12] и патогенам [13, 14]. Результатом межпородной метизации становится снижение адаптации гибридных пчелиных семей к меняющимся условиям окружающей среды, что также приводит к увеличению их гибели. При гибридизации и потери чистопородности происходит утрата генофондов аборигенных подвидов пчел [15]. В настоящее время темная лесная пчела Apis mellifera mellifera L., один из уникальных подвидов медоносной пчелы, признан исчезающим на территории Европы [16]. Таким образом, вопросы сохранения чи-стопородности A. mellifera приобретают мировое значение.
Одно из основных условий сохранения генофонда любого биологического вида является его достоверная идентификация. Наиболее часто таксономическую принадлежность пчел оценивают по морфометрическим характери-
стикам. Однако последние исследования показали, что точность данного метода зависит от выбранных для анализа признаков [17]. В условиях массовой гибридизации пчел основными инструментами идентификации становятся методы молекулярно-генетического анализа.
Секвенирование митохондриальной ДНК (мтДНК) пчел выявило существование полиморфизма в спейсерном участке, локализованном между генами COI и COII (последовательность между генами цитохромоксидазы I и цитохромоксидазы II). Известно, что этот участок образован последовательностью гена тРНК-Leu и сложными повторами АТ-пар [18]. Повторы сгруппированы Р и Q элементами. Элемент Р длиной 54 п. н. состоит только из АТ-пар, содержание АТ-пар в элементе Q составляет 93% [19]. В сложных повторах Р-Q элементов Р может иметь варианты Р0, Р1, Р2, отличающиеся небольшими делециями и инсерциями. Пчелы разных пород характеризуются разными комбинациями элементов Р и Q. Наиболее короткий фрагмент локуса COI-COII мтДНК, содержащий единственный элемент Q, выявляется у подвидов южных пород пчел (серая горная кавказская, карпатская, итальянская и др.), у среднерусской породы регистрируются несколько вариантов локуса — PQQ, PQQQ, PQQQQ (от 500 п. н. до 1 500 п. н.). Вариабельность длины межгенного локуса COI-COII мтДНК обнаруживается ПЦР, дополнительный полиморфизм выявляется при ПДРФ-анализе (DraI-тест), который позволяет дифференцировать свыше 100 гаплотипов медоносной пчелы [20]. Однако, материнский тип наследования мтДНК создает некоторые ограничения для молеку-лярно-филогенетических исследований пчел и позволяет установить происхождение только по материнской линии.
Микросателлитные локусы являются удобным инструментом для анализа генетической структуры популяций, оценки гетерозиготно-сти, степени инбридинга, определения коэффициентов генетического родства, вычисления генетических дистанций между популяциями и подвидами и оценки включения чужеродных генов одних видов в генные комплексы других. Это связано с тем, что микросателлитные локусы имеют ряд преимуществ: они многочисленны, гипервариабельны, чрезвычайно
информативны и широко представлены по всему геному.
Первые микросателлитные локусы у Apis melífera были описаны в 1993 г. [19]. К настоящему времени у медоносных пчел известно около 552 полиморфных STR-маркеров [21], что позволило создать на их основе карту сцепления [22]. В геноме медоносной пчелы 60% всех микросателлитов приходится на кодирующую область, при этом 50% трину-клеотидных и 25% динуклеотидных повторов расположены в экзонах [23]. Все эти локусы полиморфные и многие из них успешно ам-плифицируются у других видов рода Apis — A. cerana (58%), A. dorsata (59%) и A. florea (38%). К настоящему времени на основании данных о степени полиморфизма STR-локу-сов охарактеризованы популяции медоносных пчел Европы [24, 25], Ближнего Востока [26] и Африки [27].
Пчеловодство — важная отрасль сельского хозяйства и древний промысел населения Беларуси с тысячелетним опытом и традициями. Характерными этапами его становления и развития выступали охота за медом, бортничество, колодное пасечное хозяйство, рамочная система содержания пчел. Разрушение местных, аборигенных, пчел в Беларуси началось в послевоенные годы, когда для восстановления пчеловодства в колхозы и совхозы тысячами завозились пчелопакеты с Северного Кавказа и Закавказья. Был внедрен план породного районирования, в результате которого повсеместно использовались пчеломатки южных подвидов [28]. К сожалению, и в настоящий момент на территории республики продолжает осуществляться активная и планомерная инвазия зарубежных пород пчел с целью максимального получения товарного меда. На фоне бесконтрольного завоза пчел и последующей их метизации, все более актуальным становится сохранение и разведение чистопородных пчел.
В Беларуси нами начаты системные молеку-лярно-генетические исследования пасечных и бортевых медоносных пчел, обитающих на территории республики [29, 30]. Цель работы заключалась в определении комплекса ДНК-маркеров, позволяющих устанавливать чистопородность и выявлять метизацию медоносных пчел.
Материалы и методы
Материалом для исследований служили рабочие пчелы Apis mellifera, собранные самостоятельно владельцами пасек. Нами случайным образом отбирались по 10 особей из 50 пчел каждой семьи, которые привозили с пасек в лабораторию, выделялась ДНК и проводился индивидуальный анализ. В таблице 1 указано название линии/породы пчел (со слов пчеловода) и расположение пасеки.
Отобранных для исследования пчел фиксировали в 96% этаноле и хранили до выделения ДНК при -10 °С. Выделение ДНК проводили из торакса (груди) и брюшка. Материал измельчали, ресуспендировали в 200 мкл ТЕ буфера (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA). Для выделения ДНК использовали Genomic DNA Purification Kit (#K0512) (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с инструкцией производителя. Анализ полиморфизма локуса COI-COII в мтДНК проводили с использованием ПЦР со специфическими праймерами (GGCAGAATAAGTGCATTG; CAATATCATTGATGACC). Реакционная смесь включала 20 нг геномной ДНК, по 5 пмоль прямого и обратного праймера, 2
мМ смеси дНТП (dNTPs), 50 мМ MgCl2 и 5 ед./мкл Taq-полимеразы. ПЦР проводили в термоциклере MyCycler™ (BioRad, США) в следующих условиях: 92 °С в течение 3 мин, 30 циклов с параметрами: денатурация при 92 °С — 30 сек, отжиг праймеров при 500 °С — 1 мин 30 сек, элонгация при 63 °С — 2 мин. Конечная элонгация при 72 °С — 10 мин. Качество прохождения реакции оценивалось по гель-электрофорезу. При наличии продукта реакции проводили рестрикционный анализ (DraI-тест) с использованием эндонуклеазы DraI (SibEnzyme®) в соответствии с инструкцией производителя. Продукты рестрикции оценивали в 1,5% агарозном геле.
Анализ полиморфизма микросателлитных повторов ДНК проводили с использованием ПЦР с флуоресцентно-мечеными праймера-ми [31]. Реакционная смесь включала 20 нг геномной ДНК, по 5 пмоль прямого и обратного праймера, 2 мМ смеси дНТП (dNTPs), 50 мМ MgCl2 и 5 ед./мкл Taq-полимеразы. ПЦР проводили в термоциклере Thermal Cycler С1000 (BioRad, США) в следующих условиях: 94 °С — 3 мин, 30 циклов с параметрами:
Таблица 1
Перечень образцов медоносных пчел, использованных в исследовании
№ Линия/порода, происхождение Расположение пасеки
1 Маркен 1. Бакфаст. Голландия
2 Маркен 2. Бакфаст. Голландия
3 КВ057 х КВ294. Линия Келд. Бранштруб
4 Альгердас Альшеюс. Каунас. Литва Минский район
5 Бакфаст. Кричев. Беларусь
6 Линия 81. Краинка. Австрия
7 Nieska. Краинка. Польша
8 Альпийка. Польша
9 Среднерусская
10 Среднерусская Полесский радиоэкологический заповедник.
11 Среднерусская
12 Гибрид Краинка х Карпатка Молодечненский район
денатурация при 94 °С — 30 сек, отжиг прай-меров — 30 сек (температура отжига подбиралась в зависимости от праймера), элонгация при 72 °С — 30 сек. Конечная элонгация при 72 °С — 10 мин. Качество прохождения реакции оценивалось по гель-электрофорезу. При наличии продукта реакции фрагменты разделялись на приборе с большей разрешающей способностью ABI3500 Genetic Analyzer, который, считывая флуорофор метки, определял размер фрагмента в сравнении со стандартом MCLAB's Orange DNA Size Standard. Уровни генетической структуры популяции вычисляли на основе R-статистики Райта.
Филогенетические отношения установлены путем расчета парных генетических расстояний Nei [32] с использованием GenAlEx 6.41
Выявленные варианты
[33]. Кластерный анализ был проведен с помощью программы STRUCTURE 2.3.4 [34]. Количество кластеров (К) находилось в диапазоне от 1 до 10. Для визуализации результатов, их математического подтверждения методами Evanno [35] была использована веб-программа STRUCTURE Harvester [36].
Результаты и обсуждения
Специфичность образцов по полиморфизму локуса COI-COII мтДНК
При индивидуальном ДНК-анализе пчел по локусу COI-COII, особи с разными гапло-типами внутри семьи не выявлены. При анализе межсемейного полиморфизма найдены два варианта фрагмента P-Q локуса COI-COII мтДНК — Q и PQ (табл. 2).
Таблица 2
экуса COI-COII мтДНК
№ Линия/порода пчел Элемент № Линия/порода пчел Элемент
1 Маркен 1. Бакфаст PQ 7 Nieska. Краинка Q
2 Маркен 2. Бакфаст Q 8 Альпийка Q
3 КВ057 х КВ294. Линия Келд Q 9 Среднерусская Q
4 Альгердас Альшеюс Q 10 Среднерусская Q
5 Бакфаст Q 11 Среднерусская Q
6 Линия 81. Краинка Q 12 Гибрид Краинка х Карпатка Q
У пчел семьи 1 в локусе С01-С011 ампли-фицирован фрагмент размером 600-650 п. н., у пчел семей 2-12 — фрагмент размером 500-550 п. н. Наиболее коротким фрагментом локуса С01-С011 мтДНК, содержащим только элемент Q в одной копии, характеризуются южные подвиды пчел эволюционной ветви С (теёа, caucasica, сесгор1а, сагтса, Щжйса), обитающие на территории от Ближнего Востока до Италии. Подвиды пчел, относящиеся к эволюционным ветвям А, М, О, Y и Z, характеризуются более длинным фрагментом локуса СО1-СО11 мтДНК и содержат одну копию элемента Р в разных вариантах и от 1 до 5 копий элемента Q [37].
С целью подтверждения полученных данных
мы проводили DraI-тест. Известно, что межгенная область СО1-СОП мтДНК А. mellifera вариабельна по длине за счет различного количества копий последовательности Q (192196 п. н.) и полной или частичной делеции последовательности Р0 (67 п. н.). Анализ вариации длины фрагмента Р^ и полиморфизма сайта рестрикции легли в основу теста для дополнительной характеристики гаплотипов мтДНК. Разработчики теста изучили 302 пчелосемьи, принадлежащих к 12 подвидам, и обнаружили 21 вариант гаплотипов, которые были однозначно отнесены к той или иной эволюционной линии подвида по мтДНК [20]. В результате ПЦР и последующей рестрикции выявляются 7 вариантов гаплотипов: Р^,
ад, PoQQQ, PQ, PQQ, PQQQ, Q, которые
имеют различные сочетания трех последовательностей Р0 (67 п. н.), Р (54 п. н.) и Q (192196 п. н.) [20].
Результаты проведенного нами DraI-теста показали, что у образцов семьи 1 самый «тяжелый» фрагмент рестрикции был приблизительно 500 п. н., у образцов семей 2-12 самый «тяжелый» фрагмент рестрикции — 400-430 п. н. Сравнивая полученные данные с картой рестрикции [20], мы установили, что образцы семьи 1 соответствуют гаплотипу М2, который характеризуется наличием фрагмента рестрикции 483/487 п. н. и соответствует пчелам западно-европейского происхождения, образцы семей 2-12 соответствуют гаплотипу С1, который характеризуется наличием фрагмента рестрикции 420-422 п. н. и соответствует пчелам, обитающим в регионе северного Средиземноморья.
Таким образом, по анализу мтДНК установлено, что пчелосемьи 1 и 2, заявленные
Число выявленных аллелей варьировало в зависимости от пчелосемьи и от локуса: от 1 (А24) до 11 (АР043), среднее число аллелей на локус составляло от 3,7 (НВ-С16-05) до 7,3 (НВ-С16-01) (табл. 4). Среднее эффективное число аллелей составило 3,3. Обнаружено 82 редких аллеля, что составляет 47,7% от общего числа аллелей, частота встречаемости
как аналогичные, принадлежат к разным подвидам: 1 пчелосемья — A. m. mellifera или A. m. iberiensis; 2 пчелосемья — A. m. caucasica, или A. m. carnica, или A. m. ligustica. Образцы семей 9, 10, 11 заявленные как среднерусская порода пчел (A. m. mellifera) по данным анализа мтДНК принадлежат к южным породам пчел (A. m. caucasica, или A. m. carnica, или A. m. ligustica).
Генетическое разнообразие, чистота и ги-бридность пчелосемей
По данным литературы, нами подобраны 8 STR-локусов, которые являются наиболее полиморфными у большинства подвидов пчел, обитающих на территории Европы и России. Оптимизация условий ПЦР позволила получить четкую картину амплификации и установить внутрисемейный (чистота) и межсемейный полиморфизм.
Всего было идентифицировано 172 аллеля размером от 65 до 316 п. н. (табл. 3).
редких аллелей варьировала от 0,050 до 0,25. Наиболее полиморфными оказались микро-сателлитные локусы НВ-С16-01, НВ-ТНЕ-03, А113, АР043, в которых выявлялось от 7 до 11 аллелей. Самым полиморфным из всех восьми SSR-локусов был локус НВ-С16-01, в нем зафиксировано 34 аллеля, из них 14 редких (с частотой встречаемости менее 0,3%).
Таблица 3
Характеристика проанализированных STR-локусов
STR-локус Номер хромосомы Количество выявленных аллелей Количество редких аллелей Размер аллеля, п. н.
минимальный максимальный
А24 7 15 9 (60,0%) 95 214
A88 8 12 4 (33,3%) 136 156
A113 6 29 15 (51,7%) 124 246
AP043 3 27 14 (51,8%) 110 222
HB-THE-03 13 19 4 (21,1%) 179 204
HB-C16-01 16 34 14 (42,2%) 247 316
HB-C16-05 1 18 12 (66,7%) 65 108
A28а 14 18 10 (55,6%) 112 144
Таблица 4
Популяционно-генетические параметры исследуемых пчелосемей
Локус № I Но Не иНе F 18
семья №1. Маркен 1. Бакфаст. Голландия
НВ-С16-05 3 2,571 1,011 0,500 0,611 0,667 0,182
НВ-С16-01 6 5,143 1,705 1 0,806 0,879 -0,241
НВ-ТНЕ-03 5 3,273 1,352 0,833 0,694 0,758 -0,200
А88 4 3,600 1,330 0,833 0,722 0,788 -0,154
А113 7 4,909 1,736 0,778 0,796 0,843 0,023
АР043 7 4,909 1,754 0,778 0,796 0,843 0,023
А24 5 2,382 1,165 0,444 0,580 0,614 0,234
А28а 6 2,783 1,363 0,375 0,641 0,683 0,415
среднее 5,375 3,696 1,427 0,693 0,706 0,759 0,035
с 0,498 0,402 0,098 0,079 0,032 0,034 0,082
семья №2. Маркен 2. Бакфаст. Голландия
НВ-С16-05 3 2,740 1,049 0,700 0,635 0,668 -0,102
НВ-С16-01 9 4,444 1,817 1 0,775 0,816 -0,290
НВ-ТНЕ-03 9 6,667 2,030 1 0,850 0,895 -0,176
А88 4 2,597 1,094 0,700 0,615 0,647 -0,138
А113 8 4,878 1,803 0,700 0,795 0,837 0,119
АР043 11 7,692 2,221 0,900 0,870 0,916 -0,034
А24 5 3,509 1,392 0,900 0,715 0,753 -0,259
А28а 5 3,175 1,331 0,800 0,685 0,721 -0,168
среднее 6,750 4,463 1,592 0,838 0,743 0,782 -0,131
с 1,013 0,661 0,154 0,046 0,034 0,035 0,046
семья №3. КВ057 х КВ294. Линия Келд. Бранштруб
НВ-С16-05 2 1,835 0,647 0,700 0,455 0,479 -0,538
НВ-С16-01 5 2,909 1,249 1 0,656 0,700 -0,524
НВ-ТНЕ-03 4 2,746 1,132 0,222 0,636 0,673 0,650
А88 2 1,105 0,199 0,100 0,095 0,100 -0,053
А113 5 4 1,474 0,750 0,750 0,800 0
АР043 7 4,444 1,653 0,800 0,775 0,816 -0,032
А24 1 1 0 0 0 0 -
Продолжение таблицы 4
Локус № Ке I Но Не иНе F
А28а 7 4,444 1,678 0,700 0,775 0,816 0,097
среднее 4,125 2,810 1,004 0,534 0,518 0,548 -0,057
с 0,811 0,498 0,230 0,131 0,109 0,116 0,143
семья №4. Альгердас Альшеюс. Каунас. Литва
НВ-С16-05 3 2,667 1,040 0,700 0,625 0,658 -0,120
НВ-С16-01 7 5,128 1,749 1 0,805 0,847 -0,242
НВ-ТНЕ-03 5 4,348 1,511 1 0,770 0,811 -0,299
А88 2 1,969 0,685 0,875 0,492 0,525 -0,778
А113 6 4,082 1,569 0,800 0,755 0,795 -0,060
АР043 3 1,942 0,791 0,600 0,485 0,511 -0,237
А24 3 1,942 0,791 0,500 0,485 0,511 -0,031
А28а 3 1,653 0,687 0,400 0,395 0,416 -0,013
среднее 4 2,966 1,103 0,734 0,602 0,634 -0,222
с 0,627 0,477 0,155 0,079 0,056 0,059 0,088
семья №5. Бакфаст. Кричев. Беларусь
НВ-С16-05 2 1,600 0,562 0,500 0,375 0,395 -0,333
НВ-С16-01 4 2,353 1,063 0,700 0,575 0,605 -0,217
НВ-ТНЕ-03 5 3,175 1,331 0,900 0,685 0,721 -0,314
А88 3 2,778 1,055 0,800 0,640 0,674 -0,250
А113 4 1,800 0,855 0,556 0,444 0,471 -0,250
АР043 4 2,326 0,996 0,800 0,570 0,600 -0,404
А24 5 1,942 1,010 0,300 0,485 0,511 0,381
А28а 5 3,774 1,431 0,800 0,735 0,774 -0,088
среднее 4 2,468 1,038 0,669 0,564 0,594 -0,184
с 0,378 0,261 0,095 0,071 0,044 0,046 0,087
семья №6. Линия 81. Краинка. Австрия
НВ-С16-05 2 1,220 0,325 0,200 0,180 0,189 -0,111
НВ-С16-01 8 4,878 1,803 0,900 0,795 0,837 -0,132
НВ-ТНЕ-03 8 5,714 1,874 1 0,825 0,868 -0,212
А88 4 2,410 1,013 1 0,585 0,616 -0,709
А113 3 2,198 0,856 1 0,545 0,574 -0,835
Продолжение таблицы 4
Локус № Ке I Но Не иНе F
АР043 5 3,922 1,449 0,900 0,745 0,784 -0,208
А24 8 4,082 1,692 0,900 0,755 0,795 -0,192
А28а 4 1,527 0,708 0,100 0,345 0,363 0,710
среднее 5,250 3,244 1,215 0,750 0,597 0,628 -0,211
с 0,861 0,579 0,202 0,132 0,082 0,087 0,164
семья №7. Nieska. Краинка. Польша
НВ-С16-05 3 2,462 0,974 1 0,594 0,633 -0,684
НВ-С16-01 5 3,057 1,330 1 0,673 0,712 -0,486
НВ-ТНЕ-03 5 2,893 1,268 0,556 0,654 0,693 0,151
А88 2 1,117 0,215 0,111 0,105 0,111 -0,059
А113 3 1,906 0,787 0,667 0,475 0,503 -0,403
АР043 5 2,531 1,164 0,556 0,605 0,641 0,082
А24 4 2,492 1,087 0,667 0,599 0,634 -0,113
А28а 4 2,348 1,088 0,556 0,574 0,608 0,032
среднее 3,875 2,351 0,989 0,639 0,535 0,567 -0,185
с 0,398 0,214 0,126 0,100 0,065 0,069 0,107
семья №8. Альпийка. Польша
НВ-С16-05 4 2,381 1,089 0,600 0,580 0,611 -0,034
НВ-С16-01 8 5,882 1,900 1 0,830 0,874 -0,205
НВ-ТНЕ-03 7 3,774 1,608 0,900 0,735 0,774 -0,224
А88 4 1,905 0,914 0,300 0,475 0,500 0,368
А113 4 2,656 1,168 0,778 0,623 0,660 -0,248
АР043 5 3,636 1,383 0,800 0,725 0,763 -0,103
А24 2 1,835 0,647 0,700 0,455 0,479 -0,538
А28а 3 1,515 0,639 0,200 0,340 0,358 0,412
среднее 4,625 2,948 1,169 0,660 0,595 0,627 -0,072
с 0,706 0,510 0,158 0,099 0,059 0,062 0,113
семья № 9. Среднерусская. Полесский радиоэкологический заповедник
НВ-С16-05 6 3,846 1,500 0,800 0,740 0,779 -0,081
НВ-С16-01 9 4,762 1,843 1 0,790 0,832 -0,266
Продолжение таблицы 4
Локус № Ке I Но Не иНе F
НВ-ТНЕ-03 2 2 0,693 1 0,500 0,600 -1
А88 4 3,175 1,258 0,900 0,685 0,721 -0,314
А113 5 3,846 1,448 0,900 0,740 0,779 -0,216
АР043 6 2,857 1,373 0,600 0,650 0,684 0,077
А24 3 1,412 0,566 0,333 0,292 0,318 -0,143
А28а 2 1,117 0,215 0,111 0,105 0,111 -0,059
среднее 4,625 2,877 1,112 0,706 0,563 0,603 -0,250
с 0,844 0,454 0,197 0,117 0,087 0,090 0,116
семья № 10. Среднерусская. Полесский радиоэкологический заповедник
НВ-С16-05 6 3,240 1,455 0,778 0,691 0,732 -0,125
НВ-С16-01 11 5 2,025 0,900 0,800 0,842 -0,125
НВ-ТНЕ-03 4 2,571 1,120 0,444 0,611 0,647 0,273
А88 5 2,469 1,201 0,700 0,595 0,626 -0,176
А113 9 6,061 1,970 0,800 0,835 0,879 0,042
АР043 7 5 1,739 0,700 0,800 0,842 0,125
А24 7 5,714 1,831 0,900 0,825 0,868 -0,091
А28а 3 2,800 1,061 0,286 0,643 0,692 0,556
среднее 6,500 4,107 1,550 0,688 0,725 0,766 0,060
с 0,926 0,526 0,138 0,077 0,036 0,037 0,089
семья № 11. Среднерусская. Полесский радиоэкологический заповедник
НВ-С16-05 5 2,128 1,051 0,400 0,530 0,558 0,245
НВ-С16-01 9 5,556 1,968 0,900 0,820 0,863 -0,098
НВ-ТНЕ-03 9 6,452 2,013 0,800 0,845 0,889 0,053
А88 6 4,651 1,640 0,600 0,785 0,826 0,236
А113 9 5,714 1,947 0,900 0,825 0,868 -0,091
АР043 8 3,390 1,610 0,900 0,705 0,742 -0,277
А24 5 2,740 1,261 0,500 0,635 0,668 0,213
А28а 2 1,471 0,500 0,200 0,320 0,337 0,375
среднее 6,625 4,013 1,499 0,650 0,683 0,719 0,082
с 0,905 0,650 0,188 0,094 0,065 0,068 0,078
Окончание таблицы 4
Локус № Ке I Но Не иНе F 18
семья № 12. Гибрид Краинка х Карпатка
НВ-С16-05 6 3,390 1,440 0,900 0,705 0,742 -0,277
НВ-С16-01 7 5,556 1,825 0,900 0,820 0,863 -0,098
НВ-ТНЕ-03 6 2,778 1,330 0,300 0,640 0,674 0,531
А88 6 3,226 1,446 1 0,690 0,726 -0,449
А113 5 2,941 1,277 1 0,660 0,695 -0,515
АР043 4 3,175 1,258 1 0,685 0,721 -0,460
А24 4 3,448 1,304 1 0,710 0,747 -0,408
А28а 2 2 0,693 0,400 0,500 0,526 0,200
среднее 5 3,314 1,322 0,813 0,676 0,712 -0,184
с 0,567 0,359 0,111 0,103 0,031 0,033 0,132
Примечание. № — количество выявленных аллелей, № — количество эффективных аллелей, I — информационный индекс Шеннона, Но — наблюдаемая гетерозиготность, Не — ожидаемая гетерозиготность, Б — коэффициент инбридинга
В таблице 5 приведены результаты вычислений популяционно-генетических параметров исследуемых пчелосемей. Анализ высокополиморфных STR-локусов показал, что в трех из двенадцати исследованных пчелосемей отмечен незначительный дефицит гетерозигот (семьи 1, 10, 11) (табл. 4), остальные семьи не испытывали дефицита гетерозигот (Но < Не), что свидетельствует об интенсивном процессе межпородной гибридизации в данных пчелосемьях. Наибольшее генетическое разнообразие по величине индекса Шеннона установлено у пчелосемей 2 (I = 1,592), 10 (I = 1,550), 11 (I = 1,499), наименьшее — у пчелосемьи 7 (I = 0,989).
Индекс фиксации Б варьировал от 0,187 до -0,236 в зависимости от локуса, и в среднем составил -0,107, что подтверждает преобладание гетерозигот (табл. 5). Значения индекса Б^также показали, что 78,7% всего разнообразия обусловлено внутрисемейными различиями и только 21,3% приходится на межсемей-
ные различия. Минимальные межсемейные различия отмечены по локусу АР043 (11%), максимальные — по локусу А88 (30%).
Микросателлитные маркеры достаточно информативны и активно используются при изучении генетического разнообразия медоносных пчел. Comuet J. М. показал, что для получения статистически значимой оценки структуры популяции медоносной пчелы, а также для отнесения особей неизвестного происхождения к популяциям на основании генетического расстояния между особями и популяциями достаточно изучить полиморфизм 10 микросателлитных маркеров [38]. Современные исследования специалистов доказали, что достоверные результаты могут быть получены и при меньшем количестве SSR-маркеров.
На основе изучения вариабельности 7 микросателлитных локусов определена зона интрогрессии между пчелами подвидов А. т. mellifera и А. т. ligustica в Альпах на гра-
Таблица 5
Коэффициенты F-статистики Райта, рассчитанные для исследуемых пчелосемей
SSR-локус F IS F IT F ST
HB-C16-05 -0,157 0,117 0,237
HB-C16-01 -0,236 -0,005 0,186
HB-THE-03 -0,060 0,158 0,206
А88 -0,221 0,151 0,305
А113 -0,168 0,086 0,217
АР043 -0,110 0,013 0,110
А24 -0,093 0,202 0,270
А28а 0,187 0,329 0,175
среднее -0,107 0,131 0,213
Е 0,047 0,038 0,021
нице между Францией и Италией [16], в Швейцарии, Норвегии, Франции [39], Польше [40]. Анализ вариабельности 6 микросателлитных локусов позволил выяснить относительную чистоту линий иберийской популяции пчел подвида A. m. iberiensis в Испании и доказать генетическую изоляцию от популяции пчел подвида A. m. intermissa из Северной Африки и Португалии [41].
Мы изучили полиморфизм восьми высокополиморфных SSR-локусов в пчелосемьях и выполнили анализ структуры с использованием моделирования в STRUCTURE v.2.3.4. Обнаружена достоверная разница между образцами и показана дифференциация на три четко выраженных кластера (K = 3). Точность консолидированности большинства особей в пределах кластера 1 (34 особей из 120 включенных в анализ) варьировала в пределах от 79,3 до 99,2%. Аналогичный показатель для особей в пределах кластера 2 (56/120) — от 75,9 до 99,2% и для особей в пределах кластера 3 (25/120) — от 88,0 до 99,3%. Зафиксировано пять пчел, вероятность отнесения которых к тому или иному кластеру колебалась от 30,8 до 68,3%. Индивидуальный молекулярно-ге-нетический анализ пчел позволил оценить степень метизации в семьях. Установлено, что пчелосемья 1 состоит из особей, которые относятся к разным кластерам (4 : 5 : 1). Ана-
логичная, но в меньшей степени, ситуация наблюдается в пчелосемьях 4 (8 : 2), 5 (8 : 2), 9 (7 : 3), 10 (6 : 4). Выявление в одной семье рабочих пчел с разными генотипами связано с особенностями биологии размножения пчел — полиандрией. Это означает, что пчело-матка одновременно спаривалась с трутнями, отличающимися по своему генетическому происхождению (разные породы, экотипы и т. д.).
Пчелосемьи 2, 3, 6, 7, 8, 11, 12 являются генетически выровненными (чистыми) и однозначно кластеризуются.
Анализ генетических дистанций показал, что все пчелосемьи делятся на две ветки: к одной принадлежат пчелосемьи 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12; к другой — только одна пчелосемья 6 (рис. 1). Это означает, что шестая семья имеет отличное от других генетическое происхождение, что совпадает с информацией о стране происхождения данного образца — линия краинской породы пчел австрийской селекции, которая, по данным мо-лекулярно-генетического анализа, является «чистой», т. е. генетически однородной.
Остальные образцы — это разнообразные гибриды южных подвидов пчел. Анализ ден-дрограммы подтверждает данное заключение.
Семьи 1, 2, 3, 4, 5, 8 — принадлежат одной ветви дендрограммы с небольшими генетическими дистанциями между собой. Анализируя
Рис. 1. Генетические расстояния между исследуемыми пчелосемьями
происхождение данных пчелосемей, можно однозначно заключить, что это гибриды породы Бакфаст. Данный вывод подтверждается максимальной генетической близостью 1 и 2 семьи, что совпадает с их заявленным общим происхождением (линии Бакфаст) (табл. 1, рис. 1). Известно, что порода Бакфаст получена путем скрещивания медоносных пчел подвида А. т. ligustica и местных популяций медоносных пчел Великобритании. Следовательно, образцы 3, 4, 5, 8 генетически близки к южному подвиду А. т. ligustica.
Семьи 7, 9, 10, 11, 12 также группируются на одной ветке дендрограммы, следовательно, являются генетически близкими. Образцы 7 и 12 заявлены как «Nieska. Краинка. Польша» и «гибрид Краинка х Карпатка». Вероятнее всего, это гибриды южных подвидов А. т. сагтса, А. т. саграЫса, которые широко используются в разведении на территории Восточной Европы, в том числе Беларуси (бытовое название Краинка и Карпатка). Семьи 9, 10, 11 были заявлены как среднерусские пчелы (табл. 1), однако анализ мтДНК и SSR-анализ опровергли эту информацию. Данные образцы однозначно являются южными подвидами пчел, а так как на дендрограмме они группируются вместе с образцами 7, 12, то являются гибридами подвидов А. т. сагтса, А. т. саграйса (табл. 1, рис. 1).
Таким образом, комплексный молекуляр-но-генетический анализ пчелосемей с использованием восьми высокоэффективных
SSR-маркеров (НВ-С16-05, НВ-С16-01, НВ-ТНЕ-03, А88, А113, АР043, А24, А28а) и маркеров митохондриального генома позволил с высокой степенью достоверности выявить межсемейный и внутрисемейный полиморфизм, установить происхождение, чистоту и гибридность пчелосемей.
Заключение
Для сохранения генофонда аборигенных пчел и чистопородного разведения необходима точная идентификация подвидовой принадлежности и происхождения семей. Только использование молекулярно-генетических методов оказывается эффективным для различения подвидов медоносной пчелы с большим уровнем достоверности в условиях их массовой гибридизации. Нами определены категории информативных SSR-маркеров с высоким дифференцирующим потенциалом. Обнаружена достоверная разница в генетической структуре исследуемых пчелосемей и показано разделение на три кластера. Выявлен внутрисемейный и межсемейный генетический полиморфизм, установлены чистопородные и помесные пчелосемьи. Представленные в статье результаты исследований являются новыми данными о генетическом полиморфизме медоносных пчел, разводимых в Республике Беларусь.
Список использованных источников
1. Харченко Н. А., Рындин В. Е. Пчеловод-
ство: учеб. для студ. вузов. - М.: Издательский центр «Академия», 2003. - 368 с.
2. Declines of managed honey bees and beekeepers in Europe / S. G. Potts, S. P. Roberts, R. Dean, G. Marris, M. A. Brown, R. Jones, P. Neumann, J. Settele. - Journal of Apicultural Research. - 2010. - 49(1): 15-22 (doi: 10.3896/ IBRA.1.49.1.02).
3. Colony Collapse Disorder (CCD) and bee age impact honey bee pathophysiology / van D. Engelsdorp, K. S. Traynor, M. Andree,
E. M. Lichtenberg, Y. Chen, C. Saegerman, D. L. CoxFoster. - PLoS ONE. - 2017. - 12(7): e0179535 (doi: 10.1371/journal.pone.0179535).
4. Анализ генетической структуры популяций медоносной пчелы (Apis mellifera L.) / М. Д. Каскинова, Р. А. Ильясов, А. В. Поскря-ков, А. Г. Николенко. - Генетика, 2015. - 51, 1199-1202 (doi: 10.7868/S0016675815100070).
5. A case control study and a survey on mortalities of honey bee colonies (Apis mellifera) in France during the winter of 2005-2006. / M. P. Chauzat, A.-C. Martel, Zeggane, S. Drajunudel, F. Schurr, M.-C. Clément, M. RibièreChabert, M. Aubet, J.-P. Faucon. -Journal of Apicultural Research. - 2010. - 49(1): 40-51 (doi: 10.3896/IBRA.1.49.1.06).
6. EPILOBEE Consortium, Chauzat M. P., Jacques A., Laurent M., Bougeard S., Hendrikx P., Ribière-Chabert M. Risk indicators affecting honeybee colony survival in Europe: one year of surveillance. Apidologie, 2016, 47(3): 348-378 (doi: 10.1007/s13592-016-0440-z).
7. Pesticides and honey bee toxicity — USA / R. M. Johnson, M. D. Ellis, C. A. Mullin, M. Frazier. - Apidologie. - 2010. - 41(3): 312331 (doi: 10.1051/apido/2010018)
8. van Engelsdorp D., Meixner M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. Journal of Invertebrate Pathology. - 2010. - 103(Suppl.): S80-S95 (doi: 10.1016/j.jip.2009.06.011).
9. Fundamentals of the honey bee (Apis mellifera) immune system / A. Larsen,
F. J. Reynaldi, E. Guzmân-Novoa. Review. Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias. -2019. - 10(3): 705-728 (doi: 10.22319/rmcp. v10i3.4785).
10. DeGrandi-Hoffman G., Chen Y. Nutrition, immunity and viral infections on honey bees.
Current Opinion in Insect Science, 2015, 10: 170-176 (doi: 10.1016/j.cois.2015.05.007).
11. High-resolution linkage analyses to identify genes that influence Varroa sensitive hygiene behavior in honey bees / J. M. Tsuruda, J. W. Harris, L. Bourgeois, R. G. Danka, G. J. Hunt. PLoS ONE. - 2012. - 7(11): e48276 (doi: 10.1371/journal.pone.0048276).
12. Long-term temporal trends of Nosema spp. infection prevalence in northeast Germany: continuous spread of Nosema ceranae, an emerging pathogen of honey bees (Apis mellifera), but no general replacement of Nosema apis / S. Gisder, V. Schüler, L. L. Horchler, D. Groth,
E. Genersch. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2017. - 7: 301 (doi: 10.3389/ fcimb.2017.00301).
13. Honeybee immunity and colony losses /
F. Nazzi, D. Annoscia, E. Caprio, Di Prisco G., F. Pennacchio. - Entomologia. - 2014. - 2(2) (doi: 10.4081/entomologia.2014.203).
14. Pathogens, pests, and economics: drivers of honey bee colony declines and losses / K. M. Smith, E. H. Loh, M. K. Rostal, C. M. Zambrana-Torrelio, L. Mendiola, P. Daszak. EcoHealth. -2014. - 10(4): 434-445 (doi: 10.1007/s10393-013-0870-2).
15. Il'yasov R. A., Poskryakov A. V., Nikolenko A. G. Biomika, 2017, 9(2): 71-90.
16. Varying degrees of Apis mellifera ligustica introgression in protected populations of the black honey bee, Apis mellifera mellifera, in north west Europe / A. B. Jensen, K. A. Palmer, J. J. Boomsa, B. V. Pedersen. - Molecular Ecology. - 2005. - 14: 93-106 (doi: 10.1111/j.1365-294X.2004.02399.x).
17. The accuracy of morphometric characteristic analysis depends on the type of the assessed traits of honey bees (Apis cerana F. and Apis mellifera L.) / Olga Frunze, Dong-Won Kim, Eun-Jin Kang, Kyungmun Kim, Bo-Sun Park, Yong-Soo Choi. - Journal of Asia-Pacific Entomology. - September, 2022 (doi: 10.1016/j. aspen.2022.101991).
18. A worldwide survey of genome sequence variation provides insight into the evolutionary history of the honeybee Apis mellifera / A. Wallberg, F. Han, G. Wellhagen, et al. - Nature Genetics. - 2014. - Vol. 46. - P. 1 081-1 088.
19. Estoup A. Characterization of (GT)n and (CT)n microsatellites in two insect species Apis
mellifera and Bombus terrestris / A. Estoup, M. Solignac, M. Harry, J. M. Cornuet. - Nucleic Acids Research. - 1993. - Vol. 21, Is. 6. -P. 1 427-1 431.
20. Garnery L. A simple test using restricted PCR-amplified mitochondrial-DNA to study the genetic-structure of Apis mellifera L. / L. Garnery, M. Solignac, G. Celebrano, J. M. Cornuet. - Experientia. - 1993. - Vol. 49, is. 11.
- P. 1 016-1 021.
21. Five hundred and fifty microsatellite markers for the study of the honeybee (Apis mellifera) genome / M. Solignac, D. Vautrin, A. Loiseau, F. Mougel, E. Baudry, A. Estoup, L. Garnery, M. Haberl, J.-M. Cornuet. - Molecular Ecology Notes. - 2003. - 3(2): 307-311 (doi: 10.1046/j.1471- 8286.2003.00436.x).
22. A microsatellitebased linkage map of the honeybee, Apis mellifera L. / M. Solignac, D. Vautrin, E. Baudry, F. Mougel, A. Loiseau, J.-M. Cornuet. - Genetics. - 2004. - 167(1): 253-262 (doi: 10.1534/genetics.167.1.253).
23. InSatDb: a microsatellite database of fully sequenced insect genomes / S. Archak, E. Meduri, P. S. Kumar, J. Nagaraju. - Nucleic Acids Research. - 2007. - 35(Suppl_1): D36-D39 (doi: 10.1093/nar/gkl778).
24. Hybrid origins of honey bees from Italy (Apis mellifera mellifera) and Sicily (A. m. sicula) / P. Franck, L. Garnery, G. Celebrano, M. Solignac, J.-M. Cornuet. - Molecular Ecology.
- 2000. - 9(7): 907-921 (doi: 10.1046/j.1365-294x.2000.00945.x).
25. Molecular characterisation of indigenous Apis mellifera carnica in Slovenia / S. Susnik, P. Kozmus, J. Poklukar, V. Meglic. - Apidologie.
- 2004. - 35(6): 623-636 (doi: 10.1051/ apido:2004061).
26. Molecular confirmation of a fourth lineage in honeybees from the Near East / P. Franck, L. Garnery, M. Solignac, J.-M. Cornuet. Apidologie. - 2000. - 31(2): 167-180 (doi: 10.1051/apido:2000114).
27. Genetic diversity of the honey bee in Africa: microsatellite and mitochondrial data / P. Franck, L. Garnery, A. Loiseau, B. P. Oldroyd, H. R. Hepburn, M. Solignac, J.-M. Cornuet.
- Heredity. - 2001. - 86: 420-430 (doi: 10.1046/j.1365-2540.2001.00842.x).
28. Гузенко, Е. В. Генетическая характеристика медоносных пчел Apis mellifera L., раз-
водимых на пасеках Беларуси / Е. В. Гузенко, А. И. Царь, В. Н. Кипень, В. А. Лемеш // Пчеловодство холодного и умеренного климата: Материалы 5-й Международной научно-практической конференции. - Москва-Псков, 2021.
- С. 48-52.
29. Elena Guzenko, Nastassia Tsar, Viachaslav Kipen, Valentina Lemesh. Establishing of Taxonomic Affiliation and Hybridization of Honeybees (Apis melifera L.) in Belarus Using Molecular Genetic Methods. - Iternational Congress on Bee Sciences, 16-18 June 2022, Р. 95.
30. Microsatellite variation in honey bee (Apis mellifera L.) populations: hierarchical genetic structure and test of the infinite allele and stepwise mutation models / A. Estoup, L. Garnery, M. Solignac, J. M. Cornuet. -Genetics. - 1995 Jun;140(2):679-95. doi: 10.1093/ genetics/140.2.679.
31. Nei, M. Analysis of gene diversity in subdivided populations / M. Nei. - Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1973. - Vol. 70, № 12. -P. 3 321-3 323.
32. Peakall, R. GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research — an update / R. Peakall, P. E. Smouse. - Bioinformatics. - 2012. - Vol. 28, № 19. - P. 2 537-2 539.
33. Pritchard, J. K. Inference of population structure using multilocus genotype data / J. K. Pritchard, M. Stephens, P. Donnelly. -Genetics. - 2000. - Vol. 155, № 2. - P. 945-959.
34. Evanno, G. Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study / G. Evanno, S. Regnaut, J. Goudet. - Mol. Ecol. - 2005. - Vol. 14, № 8. -P. 2 611-2 620.
35. Earl, D. A. STRUCTURE HARVESTER: a website and program for visualizing STRUCTURE output and implementing the Evanno method / D. A. Earl, B. M. vonHoldt.
- Conservation Genetics Resources. - 2012. -Vol. 4, № 2. - P. 359-361.
36. Garnery L., Franck P., Baudry E., et al. Genetic biodiversity of the West European honeybee (Apis mellifera mellifera and Apis mellifera iberica). II. Mitochondrial DNA. Genetics, Selection and Evolution.1998; 30:31-47.
37. New methods employing multilocus genotypes to select or exclude populations as origins of individuals / J. M. Cornuet, S. Piry,
G. Luikart, A. Estoup, M. Solignac - Genetics, 1999. - 153(4): 1989-2000.
38. Gene flow in admixed populations and implications for the conservation of the Western honeybee, Apis mellifera / G. Soland-Reckeweg, G. Heckel, P. Neumann, et al. - Journal of Insect Conservation. - 2009 - Vol. 13 - P. 317-28 (doi: 10.1007/s10841-008-9175-0).
39. Nuclear and mitochondrial patterns of introgression into native dark bees (Apis mellifera mellifera) in Poland / A. Oleksa, I. Chybicki, A. Tofilski, J. Burczyk. - Journal of Apicultural
Research. - 2011 - Vol. 50(2). - P. 116-129 (doi: 10.3S96/IBRA.1.50.2.03).
40. Molecular characterization and population structure of Apis mellifera from Madeira and the Azores / De la Rúa P., J. Galián, B. V. Pedersen, J. Serrano. - Apidologie. - 2006 - Vol. 37 -P. 699-70S.
41. Шеметков, М. Ф. Советы пчеловоду / М. Ф. Шеметков, В. И. Головнев, М. М. Кочевой. 3-е изд., перераб. и доп. - Мн.: «Ураж-дай», 1991. - 399 с.
E. V. Guzenko
POPULATION AND GENETIC CHARACTERISTICS OF BEE COLONIES APIS MELLIFERA L. BRED IN THE APIARIES OF MINSK REGION OF THE REPUBLIC OF BELARUS
State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, the Republic of Belarus e-mail: e.guzenko@igc.by
The Article presents data on the molecular genetic analysis of the bee colonies bred in the apiaries of Minsk Region (Belarus). Informative SSR markers, allowing the identification of intercolony and intracolony polymorphism with a high degree of reliability and establishing the purity and hybridity of bee colonies, were determined. Modeling, using STRUCTURE v.2.3.4, made it possible to differentiate the bee colonies under study into three clusters. The membership accuracy varied from 79.3 to 99.3%. Bee colonies with varying crossbreeding degrees were identified. The calculated value of the FIS fixation index (average 0.107) indicated the predominance of heterozygotes in the bee colonies studied, and the Ho < He value indicated an intensive process of interbreeding hybridization. Analysis of mtDNA revealed two variants of the mtDNA COI-COII locus — PQ and Q, which indicates the belonging of samples to M and C evolutionary lines.
Keywords: honey bee, Apis mellifera L., hybridization, crossbreeding, molecular-genetic identification methods, mitochondrial DNA analysis, nuclear DNA analysis.
Дата поступления в редакцию: 06 февраля 2023 г.
