CC BY
176
УДК 616.611-002
ПОПУЛЯЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА И АНАЛИЗ РАСПРОСТРАНЕННОСТИ ГЕНОВ-КАНДИДАТОВ РЯДА МУЛЬТИФАКТОРИАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ СРЕДИ НАСЕЛЕНИЯ*
М.И. ЧУРНОСОВ
Е.В. НЕКИПЕЛОВА
Т.С. ТЕКУНОВА1, ОА. КОНЕВА1
ЕЛ. РЕШЕТНИКОВ 1
Л.Ю. АКУЛОВА1
И.С. ДОБРОДОМОВА
О.Б. АЛТУХОВА1, С.С. ДЕМИН1
Белгородский государственный университет
e-mail: [email protected]
В работе исследована популяционо-генетическая структура населения Центральной России по данным о полиморфизме двух STR локусов У-хромосомы (0У3393 и ОУБЭвв) и распространенность генов-кандидатов ряда мультифакториальных заболеваний: гена фактора некроза опухоли
а (ТЫРа-308), трансформирующего фактора роста Р1 (TGFP1-869), интерлейкина 11_-1В, ангиотензин-превращающего фермента (АСЕ) и синтазы окиси азота eNOS (NOS3).
Ключевые слова: полимеразная цепная реакция, гены-кандидаты, мультифакториальные заболевания, популяционно-генетическая структура населения, геноти-пирование.
2 Белгородская областная клиническая больница Святителя Иосафа
e-mail:[email protected]
Изучение генетической природы мультифакториальных заболеваний (МФЗ) продолжает оставаться одной из самых сложных проблем в медицинской генетике. Успешная реализация международной программы «Геном человека», завершившейся построением подробной генетической карты человека, открыла новые возможности в изучении генетики мультифакториальных заболеваний [1, 2]. Широкое использование в исследованиях генетических основ МФЗ получили открытые в последние десятилетия методы анализа ДНК-полиморфизма: полимеразная цепная реакция (ПЦР), секвенирование, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), полиморфизм микросателлитных (STR) и минисателлитных (VNTR) нуклеотидных повторов. В настоящее время наиболее перспективными для расшифровки генетической природы широко распространенных заболеваний человека имеют открытые сравнительно недавно однонуклеотидные полиморфные маркеры [4, 5, 8]. Однонуклеотидные полиморфизмы, имея высокую частоту (1 на 100-300 нуклеотидов), значительно распространены в геноме, что позволяет проводить с их использованием широкомасштабные исследования.
Для картирования генов МФЗ у человека с использованием ДНК-маркеров применяется несколько подходов. При кандидатном картировании для исследования отбираются гены, биохимические продукты которых влияют на возникновение или течение заболевания (гены-кандидаты). Выявление ассоциаций полиморфизмов генов-кандидатов с рассматриваемым МФЗ или с его патогенетически значимыми признаками (симптомами или синдромами) позволяет в конечном результате «картировать» заболевание [10, 11, 12].. Следует отметить, что для кандидатного картирования используются только уже известные гены.
При идентификации генов наследственной предрасположенности к мульти-факториальным заболеваниям одним из традиционных методов является анализ сцепления ДНК — маркеров с заболеванием в семьях больных. Данный метод основан на прослеживании косегрегации генов при передаче от родителей к потомкам в ряду поколений. ДНК — маркеры, близкорасположенные к генам, ответственным за развитие заболевания, с большей вероятностью будут переданы от родителей к детям совместно [3, 8, 9].
В настоящее время для выявления генов МФЗ все более широко применяется
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ и РГНФ.
анализ ассоциаций, при котором, в отличие от анализа сцепления, осуществляется тестирование ассоциации между генотипом и патологическим фенотипом на выборках неродственных индивидов [1, 12]. Для этого важное значение имеют популяционные данные о распространенности среди населения исследуемых генетических маркеров.
Целью работы явилось изучение популяционно-генетической структуры населения Центральной России по данным о полиморфизме двух STR локусов У-хромосомы (DYS393 и DYSз88) и распространенности генов-кандидатов ряда муль-тифакториальных заболеваний: гена фактора некроза опухоли а (TNFа-308), трансформирующего фактора роста Р1 (TGFP1-869), интерлейкина 1_-1В, ангиотензин-превращающего фермента (АСЕ) и синтазы окиси азота eNOS (NOS3).
Материалом для исследования полиморфизма гена ангиотензин-превращающего фермента (АСЕ) [7] и гена синтазы окиси азота eNOS (NOSз) [8] послужила ДНК 282 коренных жителей Белгородской области: Прохоровского (п = 137) и Красненского (п = 145) районов, полученная при экспедиционном обследовании населения этих районов.
Выборка индивидуумов для тестирования генов-кандидатов ряда мультифакто-риальных заболеваний формировалась на базе нефрологического отделения Областной клинической больницы (п = 241). В данной выборке проводилось генотипирование трех молекулярно-генетических маркеров: диаллельных локусов генов фактора некроза опухоли а (ТОТа-308) [1], трансформирующего фактора роста Р1 (TGFP1-869) и интерлейкина Ш-1В [2, 3].
Микросателлитные локусы DYS393 и DУS388 [5, 6] У-хромосомы изучены в популяциях Болховского района Орловской области (п = 75), Репьевского района Воронежской области (п = 89), Черемисиновского района Курской области (п = 59) и Боровского и Барятинского районов Калужской области (п = 117). Популяционная выборка формировалась при экспедиционном обследовании из лиц мужского пола, относящихся к коренному русскому населению Центральной России.
У обследованных индивидуумов осуществлялся забор венозной крови в объеме 8-9 мл из локтевой вены пробанда в пробирки с консервантом, содержащим 0,5М раствор ЭДТА (рН=8.о). Выделение геномной ДНК из периферической крови проведено методом фенольно-хлороформной экстракции.
Анализ всех локусов осуществлялся методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК. ПЦР проводилась на амплификаторе «Терцик-МС4» производства компании «ДНК-технология» с использованием ДНК-полимеразы ТИегтиэ аquаticus производства фирмы «Силекс-М» и олигонуклеотидных праймеров, синтезированных фирмой «Синтол».
Генотипирование ДНК-маркеров производилось методом анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) продуктов ПЦР-амплификации специфических участков генома с использованием соответствующих ферментов рестрикции производства ООО "Сибэнзим" (Новосибирск) по стандартным методикам.
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью общепринятых популяционно-генетических методов [4].
Исследование полиморфных маркеров генов фактора некроза опухоли а (TNFа-зо8), трансформирующего фактора роста Р1 (TGFP1-869) и интерлейкина 1_-1В проводили на выборке из 241 индивидуума. Полученные результаты представлены в табл. 1.
Анализ частот генотипов изучаемых полиморфных маркеров генов показал, что для всех рассмотренных маркеров в выборке наблюдаемое распределение генотипов соответствует теоретически ожидаемому [9, 11].
Выявлено следующее распределение аллелей гена I _-1В: аллель Т с частотой 64,73%, аллель С — 35,27%. Самым частым генотипом является генотип СТ (53,94%), на втором месте по распространенности — генотип ТТ (37,76%), на третьем — генотип СС (8,30%). Наиболее распространеным аллелем гена фактора некроза опухоли а является аллель ТОТ*1 (88,36%), гена трансформирующего фактора роста Р1 - аллель Т (61,66%).
Таблица 1
Распределение аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов фактора некроза опухоли а (ТЫРа-308), трансформирующего фактора роста 01 (TGFP1-869) и интерлейкина I ИВ среди населения Центрального Черноземья
Ген Аллели, генотипы Частоты (%) (п=241)
!1_-1В -511 С Аллель С 35,27
Аллель Т 64,73
Генотип СС Б,30
Генотип СТ 53,94
Генотип ТТ 37,76
ТЫРа-30Б Аллель ТОТ*1 ББ,36
Аллель ТОТ*2 11,64
Генотип ТОТі/ТОТі 7Б,61 (125)
Генотип ТОТі/ТОТ2 19,50 (31)
Генотип ТОТ2/ТОТ2 1,Б9 (3)
СИ СС со Рч О И Аллель С 3Б,34
Аллель Т 61,66
Генотип СС 12,27 (20)
Генотип СТ 52,15 (Б5)
Генотип ТТ 35,5Б (5Б)
При изучении гена ангиотензин-превращающего фермента (АСЕ) установлено, что частота аллеля АСЕ*1 варьировала от 0,504 у жителей Прохоровского района до 0,538 у населения Красненского района (табл. 2). Аллель АСЕ*й встречался с частотой
0,462 и 0,496 — Красненский и Прохоровский районы соответственно (табл. 2).
Таблица 2
Распределение генотипов, наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности, индекса фиксации полиморфных маркеров гена ангиотензин-превращающего фермента (АСЕ) и гена синтазы окиси азота еЫОБ (ЫОБЗ) среди русского населения Белгородской области
Локусы Прохоровский район Белгородской области Красненский район Белгородской области
1 2 3
АСЕ
EN 137 145
N0
!! 32 51
!Э 74 54
ЭЭ 31 40
!! 34.75 41.96
!Э 6Б.50 72.0Б
ЭЭ 33.75 30.96
АСЕ*! 0.504 0.53Б
АСЕ*Э 0.496 0.462
еЫОБ
N 136 14Б
N0
АА Б 5
АВ 37 57
ВВ 91 Б6
Ые
Окончание табл. 2
1 2 3
АА 5,61 7,58
АВ 42,67 51,83
ВВ 88,16 88,58
eNOS*A 0,195 0,226
eNOS*B 0,805 0,774
При анализе аллельного полиморфизма локуса еNOS было идентифицировано 2 аллеля с числом повторов 4 (аллель А), 5 (аллель В). Максимальная частота аллеля еNOS* А была в Красненском районе и составила 0,226, в Прохоровском районе она составила 0,195. Аллель еNOS*В с максимальной частотой был выявлен в Прохоровском районе (0,805).
Исследование полиморфизма локусов DYSз88 и DYS393 Y-хромосомы показало различия между частотами их аллелей в изученных популяциях Центральной России. Распределение частот аллелей в пяти популяциях Центральной России представлено в табл. 3.
Таблица 3
Частоты аллелей локусов ОУБ388 и ОУБ393 в популяциях русских Центральной России
Локус л ч л 3 Орловская область Болховский район Воронежская область Репьевский район Курская область Черемиси- новский район Калужская область Боровский и Барятинский районы В целом по Центральной России
DYS3 0 0,024 0,000 0,000 0,000 0,006
1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
2 0,085 0,041 0,051 0,072 0,066
3 0,695 0,827 0,797 0,758 0,760
4 0,195 0,122 0,136 0,156 0,162
5 0,000 0,010 0,017 0,014 0,006
> а 1 0,013 0,000 0,000 0,008 0,005
2 0,720 0,723 0,814 0,752 0,753
3 0,187 0,217 0,150 0,207 0,187
884 0,080 0,048 0,034 0,018 0,048
5 0,000 0,012 0,000 0,015 0,007
Самым частым в популяциях русских оказался аллель DYS393*13, частота которого во всей выборке составила 76%. С наибольшей частотой он встречается в Репьев-ском (82,7%) и Черемисиновском (79,7%) районах, а наименьшая распространенность этого аллеля наблюдается в Болховском районе — 69,5%. На втором месте по частоте находится аллель DYS393*14 (в общей выборке встречается с частотой 16,2%). С наибольшей частотой он выявлен в Болховском районе (19,5%), с наименьшей — в Репьев-ском районе (12,2%). На третьем месте по распространенности находится аллель DYS393*12. Частота его встречаемости варьирует в пределах 4,1% (Репьевский район) -8,5% (Болховский район). В целом в Центральной России его распространенность составляет 6,6%. Редкие аллели DYS393*10, DYS393*15 встречаются среди населения Центральной России с частотой 0,6%. При этом они регистрируются не во всех популяциях. Так, аллель DYS393*10 выявлен только в Болховском районе (2,4%), аллель DYS393*15 - в Репьевском (1%), Боровском и Барятинском (1,4%) и Черемисиновском (1,7%) районах.
Самым распространенным по локусу DYSз88 оказался аллель 12, частота которого во всей выборке - 75,3%. С наибольшей частотой он выявлен в Черемисиновском районе (81,4%), в Боровском и Барятинском районах его процентное содержание соста-
вило 75,2%, в Болховском и Репьевском районах он встречается с одинаковой частотой 72%. На втором месте по распространенности находится аллель DYS388*13 (в целом по данным районам Центральной России — 18,7%). С наибольшей частотой он встречается в Репьевском (21,7%) и Боровском и Барятинском (20,7%) районах, с наименьшей — в Черемисиновском районе (15%). Третьим по частоте является аллель DYS388*14 (4,8% во всей выборке), его распространенность варьирует в широких пределах — от 8% в Болховском до 1,8% в Боровском и Барятинском районах. Редкие аллели DYS388*11 и DYS388*15 встречаются среди населения Центральной России с частотой 0,5% и 0,7% соответственно.
Таким образом, нами изучено распределение частот аллелей и генотипов генов — кандидатов ряда мультифакториальных заболеваний: генов фактора некроза опухоли a (TNFa-308), трансформирующего фактора роста pi (TGFpi-869), интерлейкина IL-1B, генов ангиотензин-превращающего фермента (АСЕ) и изучен полиморфизм STR локусов DYS388 и DYS393 Y-хромосомы среди населения Центральной России. Выявлены популяционные особенности распространенности данных генетических маркеров. Полученные данные могут быть использованы для изучения ассоциаций рассмотренных генетических маркеров с мультифакториальными заболеваниями, при проведении судебно-медицинской экспертизы по идентификации личности и установлению предполагаемого отцовства, для рассмотрения вопросов антропогенеза населения юга Центральной России.
Литература
1. Картамышева Н.Н., Чумакова О.В., Кучеренко А.Г., Сергеева Т.В. Прогрессирование хронического гломерулонефрита: клинико-морфологические взаимосвязи // Нефрология и диализ. - 2003. - Т.5, №4. - С. 395-398
2. Камышова Е.С. Клиническое значение полиморфных маркеров гена ангиотензинпрев-ращающего фермента, гена синтетазы альдостерона и гена эндотелиальной синтетазы оксида азота при хроническом гломерулонефрите. Автореферат дисс. к.м.н. — 2004. — 35 с.
3. Вашурина Т.В., Сергеева Т.В. Цитокины и адгезивные молекулы в патогенезе хронического гломерулонефрита / / Нефрология и диализ. - 2002. - №4. - С.232-239.
4. Животовский Л.А. Статистические методы анализа частот генов в природных популяциях. Итоги науки и техники. Общая генетика. - М., ВИНИТИ. - 1983. - С. 76-104.
5. Кравченко С.А., Сломинская П.А. Л.А. Бец и др. Полиморфизм STR—локусов Y-хромосомы у восточных славян в трех популяциях из Белоруссии, России и Украины // Генетика, 2002. - Т.38, №1. - С.97-104.
6. Лимборская С.А., Хуснутдинова Э.К., Балановская Е.В. Этногеномика и геногеогра-фия народов Восточной Европы.- М.: Наука, 2002.-261 с.
7. Милосердова О.В., Сломинский П.А., Тарская Л.А. и др. Полиморфные маркеры генов ангиотензиногена и ангиотензин-превращающего фермента у якутов. Отсутствие ассоциации с уровнем кровяного давления / / Генетика. - 2001. - Т.37, №5. - С. 712-715.
8. Мустафина О.Е., Шагисултанова Е.И., Насибуллин Т.Р. и др. Полиморфизм минисателлита гена эндотелиальной синтазы окиси азота: исследование в популяциях ВолгоУральского региона и анализ ассоциации с инфарктом миокарда и эссенциальной гипертензией // Генетика. - 2001. - Т.37, №5. - С. 668-674.
9. Hulkkonen J. Inflammotory Cytokines and Cytokine Gene Polymorphisms in Chronic Lymphocytic Leukaemia, in Primary Sjogren's Syndrome and Haelthy Subjects. - Tampere. -2002. - 81 р.
10. Wufuer M., Fang M.W., Cheng Z.H., Qiu C.C. Polymorphism of angiotensin converting enzyme gene and natural longevity in the Xinjiang Uygur people: an association study// Zhonghua Yi Xue Za Zhi. - 2004. - V.84. - P.1603-1606.
11. Sugiura Y., Niimi T., at al. Transforming growth factor ?1 gene polymorphism in rheumatoid arthritis // Annals of the Rheumatic Diseases. - 2002. - V. 61. - P. 826-828.
POPULATION-GENETIC STRUCTURE AND THE ANALYSIS OF PREVALENCE OF GENES-CANDIDATES OF SOME MULTIFACTORIAL DISEASES AMONG THE POPULATION
M.I. CHURNOSOV1 E.V. NEKIPELOVA2 T.S. TEKUNOVA1
О.А. KONEVA1, E.A. RESHETNIKOV1 L.Yu. AKULOVA1, I.S. DOBRODOMOVA1 O.B.ALTUCHOVA1 , S.S. DEMIN1
Belgorod State University e-mail: [email protected]
At this work research the populjatsiono-genetic structure of the population of the Central Russia by data about polymorphism of two STR Y-chromosome loci (DYS393 and DYS388) and prevalence of genes-candidates of some multifactorial diseases is investigated: a factor gene некроза tumours a (TNFd-308), the transforming factor of growth P1 (TGFP1-869), интерлейкина IL-1B, angiotensin-transforming of enzyme (ASYA) and синтазы окиси nitrogen eNOS (NOS3).
Key words: polimerase chain reaction, gey-candidates, multifactorial diseases, population-genetic structure of the population, genotiping.
2 Belgorod Regional clinical hospital St. Iosaf
e-mail: [email protected]
