CC BY
20ism
РТОВИВЧЕННЯ ТА С0РТ03НАВСТ
С. О. Ясеновська,
старший науковий ствроб1тник
А. О. Глибовець,
науковий ст'вро&тник УкраТнський ¡нститут експертизи сортчв рослин
УДК 631.527:633.822:57.085.2
Отримання посу?(рстшки?с лжй М 'яти перцеШ (Mentha piperita. L.) буМо&ат^т itro
У crani наведет'результат дост'дження сорт м'яти перцево! на посухослйю'сть /з застосуван-ням бютехнолопчних методе селекцИ, основаних на використанм шмного мутагену ПЕГ-6000 та клонального розмноження в культурi тканин i орган'ш in vitro.
Ключовй слова:
м'ята перцева, сорт, рослина-регенерант, посухосгпйкють, живильне середовище, калюс
У люостепових районах УкраТни м'яту перцеву (Mentha piperita L.) вирощують для потреб фармацевтичноТ промис-ловосгп як еф1роолмну рос-лину. Св1жу або сушену траву використовують для добуван-ня еф1рноТ оли i натурального ментолу [1,2].
Традицмним методом розмноження м'яти е розсадний cnoci6. Проте для прискорено-го впровадження новихсорлву виробництво, а також розмноження ункальних селекцмних генотигпв використання лише цього методу недостатньо. Необхщно розробити ефек-тивн1 технологи розмноження i виробництва високоякюно-го посадкового матер1алу на принципово новм методичнм основ1. Перспектива створен-ня таких технологм пов'язана з розробкою заход1в клонального мкророзмноження на ochobI комплексу кттинних технологм з використанням ¡зольованих тканин i opraHiB in vitro.
Ниш накопичено великий фактичний матер1ал щодо впливу р!зних xiMiHHHX та фь зичних мутаген!в на ¡зольоваш тканини й органи в ряд1 вид1в
рослин [3,4]. Мутагеннуоброб-ку використовують для розши-рення генетичноТ мшливост1 за отримання сомаклошв, а також як попередшй етап у клпиншй селекцп на стшкють до бю-тичних та абютичних факторш [5,6].
Метою даноТ роботи було вивчення сортш м'яти перцево! з метою видтення гене-тичних джерел високо!' стрес-стмкост1 до посухи ¡з засто-суванням хЫчного мутагена пол1етиленглколю-6000 (ПЕГ-6000).
Пор1вняння частот яюсних ознак у популяцтх проводили за допомогою методу х\-квадрат (х) [7].
Об'екти та методика до-слщжень. Об'ектом досль джень слугували сорти м'яти перцевоТ Прилуцька 6 та С1м-феропольська 200.
Дослщження проводились у лабораторп бютехнологп та
Схожють насшня
бюрганоманггтя Нацюнально-го ушверситету бюресурсш та природокористування УкраУни.
Для отримання посухостмких лЫм м'яти перцевоТ використо-вували живильне середовище Мурас1ге-Скуга (МС). Приго-тування поживних середовищ проводилось з використанням традицмних методик, прийня-тиху роботах по культур! тканин [7]. Як мутаген застосовували ПЕГ-6000, який е непроникною осмотично активною речови-ною.
Вмют еф1рноТ оли визначали методом прискореного екстра-гування розчинниками зпдно з ДСТУ 7096:2009.
Результати дослщжень та Ух обговорення. Дослщжен-ня спйкосп рослин м'яти до посухи проводилося на осно-в\ визначення фююлопчного параметра-стрес-депрест проростання насшня в розчиш сахарози, Ытуючого недоста-
Таблиця 1
м'яти перцевоТ
Сорт Загальна мльк сть Схожють насшня X2 05
насшня, шт штук % факт. теорет.
Прилуцька 6 □мферопольська 200 100 100 21 15 21 15 1,00 3,84
еОРТОВИВЧЕННЯ #Г гон
та охорона прав на сорти рослин
_СТ0Р1НКА МОЛОДОГО ВЧЕНРГО_
Отримання посухоспйких л1н1й м'яти перцевсн [Меп^а р1репЬа. 1_.) в умовах ¡п у^го
Таблиця 2
Одержання асептичних проростов сортш м'яти перцево'Г в 4% розчиж хлорамшу
Сорт Тривалють стерил1зацм, (хв.) Загальна кшыисть проростов, шт. Кшыасть ¡нф1кованих проростов через 5 д16 Ефективнють стерил1-зацм, (%) X2 А 05
штук % факт. теорет.
Прилуцька 6 15 21 3 14 86 0,008 3,840
Омферопольська 200 15 15 2 13 87
чу вологи. Насшня пророщу-вали в термостат! без доступу св1тла при постшнм температур! 21-22 °С протягом 16 д!б у чашках Петр! (табл.1).
Осктьки Х205 факт. < Х205 те-орет., то р1зниця м\ж ктькютю пророслих насЫин обох сортт м'яти перцевоТ неютотна.
Було встановлено, що чим вищий вщсоток проростання насшня в умовах посухи, тим посухостмюший зразок.
Оцшка реакцм сортш м'яти на стресову дю була рганою у фююлопчних змшах показни-юв. Залежно вщ генотипу сор-ти розр1знялися амплпудою такого фЫолопчного параметра, як проростання, що дало змогу розподтити Ух на стши та середньостмк!. Сорт м'яти Прилуцька 6 е посухостшю-шим, нЬк С1мферопольська 200, що пщтверджуеться до-слщженнями, проведеними в
Таблиця 3 Склад середовищ для культивування калюсноТ тканини м'яти перцевоТ
Рис 1. Рослини - регенеранти сорту Прилуцька 6.
розсаднику конкурсного сор-товипробування.
Отриман1 проростки стери-люувапи розчином хлорамшу (4%) протягом 15 хв та виса-джували на агаризоване без-гормональне живильне серед-овище МС. Результати стерил1-заци представлен! в табл. 2.
Х205 факт. < Х205теорет., тому немае ¡стотноТ р1зниц1 мЬк ефективн!стю простерил!зова-них проростюв досл!джуваних сорт!в м'яти.
Хпорам!н, як стерил1затор, виявився ефективним засо-бом для отримання стерильних проростк!в обох сорт!в м'яти перцевоТ (рис. 1).
Стерилюован! експлантати м'яти перцевоТ на модиф!кованому середовищ! МС (вар!ант перший з додаванням 0,5 мг/л БАП, варгант другий з додаванням 1 мг/л БАП + 0,5 мг/л НОК та 0,1 мг/л ЮК) через дектька тижнт прол1ферували калюсну тканину (табл. 3).
Культивували калюсы тканини в темшй культуральнш юмнат! за I 25±1°С, вщнос-ноТ вологост! - 60-65%. У по-дальшому одержану калюсну тканину використовували для одержання посухостмких кли тинних л1н1й.
Рис. 2. Рихлий калюс м'яти перцевоТ
Найбшьш ¡нтенсивно рихлий, здатний до регенераци калюс, утворювався за субкультиву-вання експлантатш або цтих пагон!в на середовищ! другого варганта (рис.2).
У досл!дженнях по добору посухост!йких кл!тинних л!н!й м'яти перцевоТ використовува-лося модифковане живильне середовище МС доповнене регуляторами росту (1 мг/л БАП + 0,5 мг/л НОК). Як селективний агент використовували мутаген ПЕГ-6000 [8]. М!крокалюси висаджували на середовище ¡з сублетальною концентрац!-ею ПЕГ-6000. Для встановлен-ня сублетальноТ концентрацм ПЕГ-6000 калюсну культуру висаджували на живильн! серед-овища з ркзною концентрацию ПЕГ (10%; 20%; 30%; 40%)! ви-являли концентрацю, при якм також спостер!галося значне зменшення приросту калюсноТ тканини. Дал! проводилася жорстка селекцт з використан-ням сублетальноТ концентрацм за схемою: -1,2,3 пасаж! - на середовищ! ¡з селективним фактором; 4, 5 - контроль без селективного агента; 6, 7 - на селективному середовищ!.
Було встановлено, що кон-центрацт сублетальноТ дози
Компоненти середовище, мг Перший вар1ант Другий вар1ант
МС-макро, 100 50
МС-мкро 1 1
Ре-хелат 5 5
Мезошозит 100 100
Сахароза, г 20 20
В1 0,1 0,5
вв 0,5 -
РР 0,5 -
Глщин 2 -
Пдрол1зат казешу - 0,5
БАП 0,5 1
НОК - 0,5
ЮК - 0,1
Агар 0,7% 0,7%
ДрЬкджовий 10
экстракт
еОРТОВИВЧЕННЯ #1' гон
та охорона прав на сорти рослин
СТ0Р1НКА МОЛОДОГО ВЧЕНРГО
Отримання посухостмких лУй м'яти перцевоТ [МеШ;Ьа р1рег1Ъа. 1_.) в умовах ¡п у^го
Рис. 3. Морфогенний посухоспй-кий калюс м'яти перцевоТ
ПЕГ-6000 для сортш Прилуць-ка 6 становить 30%, а Фмфе-ропольська 200 - 20%.
У результат! послщовних доборш вихляли резистентш клони, що стабшьно збер1гали ознаку стшкост! до селективного агента (рис.3).
Для усгпшного морфогенезу вщ1бран1 калюси висаджу-вали на живильне середови-ще МС, доповнене 6-бензил-амшопурином у концентраци 0,5 мг/л.
Проб1рки переносили у свплу кул ьту рал ьнуюм нату з умовам и: температура 25°С, 16-годинний фотоперюд, освплення 3000 -4000 лк (рис.4) [9].
Для вкоршення вщбирапи пагони одного розм1ру з добре розвиненими листками й виса-джували в живильне середови-ще. Досл1джували середовище МС з половинною концентрац1-ею макросолей, м1кроелеметтв, впамшш та регуляторами росту. Найкращим для ризогенезу пагонш виявилось середовище з половинною концентращею макросолей, мкроелемент1в та впамшш. Вщсоток ризогенезу обох сортш м'яти на даному се-редовиии становив 99%.
За юлька днш до висаджуван-ня у фунтовий субстрат проб1р-ки з рослинами вщкривали \ за-лишали вщкритими, починаючи адаптацю до умов меншоТ воло-госл. Пот1м обережно виймали рослини, ретельно вщмивали кореневу систему вщ запишюв
живильного середовища, об-робляли 5% розчином перекису водню \ висаджували в горщи-ки з\ спецшльно пщготовле-ним субстратом. Як субстрат використовували сумш фунту, торфу, п1ску (2:1:1). Пюля ви-садження рослини накривали скляними ковпаками для пщ-вищення вологост1 та кращого приживания [10]. Частка при-живання рослин - регенератов сорту Прилуцька 6 на субстрат! становила 97%, С!мферополь-ська 200 - 95%. Укоршен! та адаптован! до зовышых умов рослини - регенеранти висаджували вумови вщкритого фунту.
Перев!рка рослин - регене-рант!в м'яти перцевоТ на посу-хост!йк!сть проводилась в умовах дефщиту вологи в фунт! ! за вщносно високих температур повпря. Як контроль використовували рослини сортш м'яти перцевоТ Прилуцька 6 та □мферопольська 200, створен! традицмними методами селекцм. Результати перев!р-ки рослин на посухостмкють представлен! в таблиц! 4.
Наступним етапом досл!-дженьбуловисадженнярослин-регенерант!в в умови вщкритого г'рунту ! проведения спостере-жень щодо ¡нтенсивност! росту та адаптаци рослин у пер!од вегетаци (табл. 5). 3 наведено!' таблиц! видно, що рослини -регенеранти сортш м'яти перцевоТ Прилуцька 6 та Омфе-ропольська 200 мають значно
Рис. 6. Рослини - регенеранти сорту Прилуцька 6 I (Ямферопольська 200
вищу стмкють до несприятли-вих аб!отичних фактор1в (по-сухи), ыжзвичайы рослини цих же сорт!в.
Отже, рослини - регенеранти сорту Прилуцька 6 (рис. 5) адаптувались до умов вщкритого г'рунту дещо прше сорту С!мферопольська 200 (на 2% р1вень адаптаци нижчий) (рис. 6), але рют рослин в обох варшнтах е досить ¡нтенсив-ний \ стабшьний.
Таблиця 4 Посухостммсть рослин-регенерант1в за I +30-32 "С та критичноТ вологост1 Грунту (50-55%)
Сорт Юлыаетъ джв, протягом яких не проявлялись ознаки в'янення
Прилуцька 6 (контроль) 12
Прилуцька 6 (рослини- регенеранти) 23
СЯмферопольська 200 (контроль) 9
СЯмферопольська 200(рослини-регенеранти) 16
СОРТОВИВЧеННЯ #Г гон
та охорона прав на сорти рослин
CTOPIHKA МОЛОДОГО ВЧЕНОГО
Отримання посухоспйких лУй м'яти перцевсн [Mentha piperita. L.) в умовах in vitro
Таблица 5
Результати дослщжень рослин - регенератов в умовах вщкритого фунту
Сорти Дата Висота рослин, см Результати адаптацм рослин до умов вщкритого ■'рунту
штук %
Прилуцька 6 Висад 1-шес 2-ге - 3-те - т: 30.06.09 постереження: 12.07.09 - 27.07.09 -10.08.09 10-13 16-19 25-29 35-40 26 24 24 24 94 94 94
Фмферополь-ська 200 Висад 1-шес 2-ге - 3-те - т: 30.06.09 постереження: 12.07.09 - 27.07.09 -10.08.09 9-12 15-17 23-27 33-37 18 17 17 17 96 96 96
Таблиця 6
Вмют еф1рноТолм в листках рослин м'яти перцево'Г
Сорт Прилуцька 6 (рослини-регенеранти) Прилуцька 6 (контроль) CiM0epo-польська 200 (рослини-регенеранти) С1мферополь-ська 200 (контроль)
Вмют e0ip-HoV оли, % 2,5-2,7 2,7-2,8 3,0-3,1 3,1 -3,3
Результати оцшки вмютуеф1р-ноТ оли рослин м'яти перцево!' представлен! в табл. 6.
За результатами досл1джень, у листках рослин - регенеран-т1в обох сортт спостер1галось значне зниження вмюту еф1р-ноТ оли порвняно з контроль-ними рослинами цих же сор-т\в. Тому можна зробити при-пущення, що м1ж пщвищенням посухост1йкост1 у рослин м'яти перцевоТ та вмютом в них еф1р-ноТ оли спостер1гаеться негативна кореляц1я.
Висновки. Таким чином, при вивченш сорт/в м'яти перцево/ Прилуцька 6 та С/'мферополь-ська 200 було встановлено, що обидва сорти мають високий генетичний потенциал, особливо сорт Прилуцька 6, який во-лод!е пщвищеною спиюстю до екстремальних умов середо-
вища. Отриманi данi в процеа дослщжень, в подальшому мо-жуть бути використан'! в прак-
тичны селекцп для видмення посухостмких генотитв.
ВИКОРИСТАНА Л1ТЕРАТУРА
1. Ковальов, В. М. Фармакогнозт з основами бюхЫТ рослин: гпдручник для студенев вищих фармацевтичнихустанов освп~и. / В. М. Ковальов, О. I. Павлм, Т. 1. 1сакова. -Харюв: Прапор, вид-во НФАУ, 2000. - 705 с.
2. Лебеда А. П. /Нкарсыа рослини: Енциклопедич-ний довщник. / А. П. Лебеда, Н. I. Джуренко,
О. П. 1сайюна [та ¡н.]. - К.: Вид-во Украшська енциклопед1я ¡м. М. П. Бажана, 1992. - 544 с.
3. Гирко, В. С. Нетрадиционные методы создания селекционного материала пшеницы. / В. С. Гирко. //Дис. докт. с.-х. наук: 06.01.05. - Киев, 1999. -42 с.
4. Мельничук, М. Д. Бютехнолопя рослин: пщручник. / М. Д. Мельничук, Т. В. Новак, В. А. Кунах. - К.: Пол1граф-Консалтинг, 2003. - 520 с.
5. Сидоров, В. А. Биология растений. Клеточная селекция. / В. А. Сидоров. - К.: Наукова думка, 1990.-280 с.
6. Шамина, 3. Б. Генетическая изменчивость в популяциях соматических клеток растений в культуре. / 3. Б. Шамина. //Автореф. дис. докт. биол. наук. / 03.00.15 - генетика - Ленинград, 1988. - 35 с.
7. Калинин, Ф. Л. Методы культуры тканей физиологии и биохимии растений. / Ф. Л. Калинин,
В. В.Сарнацкая, В. Е. Полищук. - К.: Наукова думка, 1980. -488 с.
8. Калинин, Ф. Л. Технология микроклонального размножения растений. /Ф. Л. Калинин,
Г. П. Кушнир, В. В. Сарнацкая. - К.: Наукова думка, 1992.-228 с.
9. Кучук, Н. В. Генетическая инженерия высших растений. / Н. В. Кучук - К.: Наук, думка, 1997. -157 с.
10. Крыськов, Е. И. О реакции мяты Mentha piperita L. на гиббереллин. / Е. И. Крыськов, Д. Ф. Шку-рат.//Ботанич.журнал, 1961.-Т. 46, 15.-С. 707-710.
еОРТОВИВЧЕННЯ #Г гон
та охорона прав на сорти рослин
