CC BY
180
УДК 668.411:674.032.14: 546.215
ПОЛУЧЕНИЕ ВЫСОКОЧИСТОГО АРАБИНОГАЛАКТАНА ЛИСТВЕННИЦЫ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЕГО ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ СВОЙСТВ
© Е.Н. Медведев^ , В.А. Бабкин1, О.А. Макаренко1, С.М. Николаев2, В.Б. Хобракова2,
А.М. Шулунова1, Т.Е. Федорова1, Л.А. Еськова1
1 Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН, г. Иркутск,
(Россия) E-mail: woodemed@irioch.irk.ru
2Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, г. Улан-Удэ,
(Россия) E-mail: smnikolaev@biol.bsc.buryatia.ru
Показана возможность очистки арабиногалактана из древесины лиственницы окислением примесей фенольной природы пероксидом водорода. Найдены оптимальные условия, позволяющие получать высокочистый АГ. Очищенный продукт охарактеризован методами ИК, УФ, 13С ЯМР спектроскопии и гель-проникающей
хроматографии. Показано, что АГ лиственницы является эффективным иммунокорригирующим средством, что позволяет рекомендовать его для дальнейшего изучения и использования в целях профилактики и лечения некоторых заболеваний, связанных с расстройством функций иммунной системы организма.
Авторы выражают благодарность Сибирскому Отделению РАН за финансовую поддержку выполненных исследований (комплексный интеграционный проект №34).
Введение
Разработанная в лаборатории химии древесины ИрИХ СО РАН технология комплексной безотходной переработки биомассы лиственниц сибирской и Гмелина позволяет получать водный экстракт, содержащий арабиногалактан (АГ) достаточно высокой степени чистоты (свыше 95%) [1], который может применяться в ряде отраслей без дополнительной очистки. Однако для применения в медицине требуется более глубокая очистка полисахарида.
В препаратах АГ, извлекаемого водой из древесины лиственницы, основными примесями являются растворимые в воде низкомолекулярные фенольные соединения, в основном флавоноид дигидрокверцетин (ДКВ). Кроме того, обнаружено [2, 3], что в арабиногалактане из древесины лиственницы в незначительном количестве присутствует лигнин. Ранее приведенный в литературе УФ спектр с максимумом при 285 нм ошибочно интерпретировался как спектр поглощения самого АГ. Автором [4] показано, что очищенные на полиамидном сорбенте образцы АГ не поглощают в указанной УФ-области, а причиной поглощения служат сопутствующие фенольные соединения. Известно, что в УФ спектре лигнина, так же, как в спектре ДКВ, имеется интенсивный максимум поглощения в области 203-208 нм, плечо при 230 нм и характерный, но менее интенсивный максимум в области 280 нм [5]. Примеси лигнинной природы не удаляются при фракционировании образцов арабиногалактана ионообменной хроматографией. Это позволило автору [4] предположить, что лигнин прочно связан с полисахаридом в лигноуглеводный комплекс.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Предложенные ранее в России и за рубежом способы очистки растворов АГ и выделения сухого продукта нетехнологичны и невыгодны как с экономической, так и с экологической точек зрения, так как основаны на использовании токсичных реагентов (CIO2), дорогостоящих полиамидных сорбентов, больших объемов ЛВЖ, и требуют высоких энергетических затрат [6].
Настоящая работа посвящена разработке метода глубокой очистки арабиногалактана из древесины лиственницы окислением присутствующих в нем примесей фенольной природы пероксидом водорода -экологически безопасным реагентом, использующимся для отбелки целлюлозы и древесных масс [7]. Известно, что под действием Н2О2 происходит частичная делигнификация лигноцеллюлозных материалов и окисление хромофорных групп в остаточном лигнине. При этом деструкция полисахарида незначительна.
Окисление лигнина под действием пероксида водорода протекает как в щелочной, так и в кислой среде [8]. Среда не только определяет механизм окисления, но и сама является реагентом. В кислой среде деструкция протекает по a-эфирным связям структурных фрагментов лигнина как со свободным, так и с алкилированным фенольным гидроксилом.
Исследования окисления арабиногалактана пероксидом водорода показали [9], что при малых начальных концентрациях Н2О2 деструкция полисахарида незначительна, а преобладают процессы окисления с образованием уроновых кислот. С увеличением в реакционной смеси начальной концентрации пероксида водорода возрастает роль деструктивных процессов, протекающих с разрывом гликозидных связей в основной цепи макромолекул полисахарида с отщеплением моносахаридных звеньев и их фрагментацией. Начальная концентрация пероксида водорода влияет не только на качественный состав продуктов реакции, но и на выход фракций. Низкомолекулярные фрагменты удаляются при переосаждении этиловым спиртом; чем меньше начальная концентрация пероксида водорода в реакционной смеси, тем больше выход полимерной фракции. По данным ИК-спектроскопии, в полимерной и олигомерной фракциях окисленного АГ появляются карбонильные группы. В олигомерной фракции содержание карбонильных групп выше, чем в полимерной [9].
Таким образом, варьируя условия реакции, можно регулировать степень функционализации олигомерных и полимерных продуктов и глубину деструкции арабиногалактана.
Задача нашего исследования - подбор условий, при которых происходит окисление примесей без деструкции полисахарида.
Экспериментальная часть
Для исследований использовали водный экстракт АГ с концентрацией сухих веществ 5%. Содержание низкомолекулярных фенольных примесей (по ДКВ) в сухих образцах определяли фотоколориметрическим методом по интенсивности поглощения комплекса ДКВ с хлоридом алюминия при 400 нм.
Экстракты АГ содержат коллоидные примеси, которые не удаляются фильтрованием и центрифугированием. Для осветления экстракта использовался предложенный нами метод флокуляции [10]. Концентрация сухих веществ в осветленном экстракте составляла 4,9%.
Концентрацию Н2О2 варьировали в пределах 0,1-0,5 моль/л, концентрацию динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) - 0,125-5,0 ммоль/л. Температуру - 25-70 оС и продолжительность процесса - 1-4 ч. Опыты с использованием ЭДТА проводили при 60 оС, концентрации Н2О2 0,2 моль/л в течение 2 ч. АГ выделяли из реакционной смеси осаждением в пятикратный объем этанола, отфильтровывали и сушили в вакууме.
Молекулярную массу макромолекул полисахарида определяли методом гель-проникающей хроматографии (ГПХ) на сефадексе G 150 с калибровкой по декстранам. В качестве растворителя и элюента использовали 1 М раствор NaCl. Отбирали фракции по 1 мл со скоростью элюирования 6-8 мл/ч. Содержание АГ во фракциях определяли фенол-сернокислотным методом [11].
ИК спектры образцов были сняты в таблетках с KBr на спектрофотометре «Specord 75 IR» в интервале 500-4000 см-1, УФ спектры - на спектрофотометре «Specord UV VIS» (толщина слоя 10 мм).
Спектры ЯМР 13С образцов регистрировали на спектрометре «Varian VXR 500 S» с рабочей частотой 125,1 МГц, растворитель - D20. Внутренним стандартом служил дейтероацетон.
Эксперименты по определению иммуномодулирующих свойств АГ проведены на мышах-самцах линий СВА и Fi (СВАхС57В1/6) массой 18-20 г.
Контролем служила группа мышей, которым вводили иммунодепрессант - цитостатик азатиоприн перорально ежедневно в дозе 50 мг/кг в течение 5 дней [12]. Арабиногалактан вводили опытной группе животных на фоне азатиоприна перорально в виде водного раствора в дозе 200 мг/кг 1 раз в сутки в течение 14 дней [13]. Интактная группа животных получала дистиллированную воду по аналогичной схеме.
Состояние клеточного иммунитета оценивали в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) согласно стандартной методике локальной ГЗТ [14, 15]. Мышей сенсибилизировали внутрибрюшинным введением 0,1%-й взвеси эритроцитов барана (ЭБ) в физиологическом растворе. На 4-е сутки под подошвенный апоневроз задней лапки вводили разрешающую дозу антигена - 50 мкл 50%-й взвеси ЭБ. В контрлатеральную лапку инъецировали физиологический раствор в том же объеме. Оценку реакции ГЗТ проводили спустя 24 ч по разнице массы опытной (Ро) и контрольной (Рк) лапок. Индекс реакции (ИР) вычисляли по формуле:
Р - Р ИР = -°------^ 100%.
Рк
Состояние гуморального иммунитета оценивали по количеству антителообразующих клеток (АОК), определяемых методом локального гемолиза [16]. Мышей иммунизировали внутрибрюшинно ЭБ в дозе 2x108 клеток/мышь. Величину иммунного ответа оценивали по числу АОК на селезенку и на 106 клеток с ядрами на 5-е сутки после иммунизации. Достоверность экспериментальных данных определяли с помощью критерия Стьюдента [17].
Обсуждение результатов
Условия окисления примесей были исследованы как в исходном неосветленном, так и в обработанном флокулянтом экстракте арабиногалактана. Содержание ДКВ в сухом остатке исходного экстракта составляло 2,2 %. После обработки экстракта АГ флокулянтом эта величина не изменяется. Как видно из таблиц 1 и 2, основная доля ДКВ (~82%) удаляется при высаживании АГ из исходного экстракта (опыт 1), окисление позволяет дополнительно снизить его содержание.
Приведенные в таблицах 1, 2 результаты свидетельствуют о накоплении в ходе реакции продуктов кислотного характера. С увеличением концентрации Н202 и продолжительности процесса кислотность реакционной смеси повышается.
Установлено, что окисление при комнатной температуре неэффективно. Выходы продукта после окисления при 40-60 оС неосветленного (табл. 1) и осветленного экстракта (табл. 2) достаточно высоки и различаются мало. Под воздействием пероксида водорода в них не происходит образования новых функциональных групп, о чем свидетельствует идентичность их ИК- и ЯМР 13С-спектров со спектрами исходного АГ. Однако при окислении экстракта без предварительного осветления выделенный конечный продукт имеет кремовый оттенок, а окисление осветленных экстрактов при 60-70 оС позволяет получить порошок белого цвета.
Выход продукта после окисления при 70 °С в течение 4 ч. снижается, что свидетельствует о протекании деструктивных процессов. Это подтверждает детальное исследование образцов АГ, полученных в жестких условиях, методами ИК-спектроскопии и ГПХ. ИК-спектры выделенных осаждением после реакции в жестких условиях полимерных фракций АГ (табл. 2, опыты 12,13) идентичны спектрам исходного продукта, полученного высушиванием неочищенного экстракта. Однако данные ГПХ свидетельствуют о том, что окисление в указанных условиях приводит к деструкции макромолекул полисахарида. Наряду с фракциями, имеющими м.м. ~ 20000, присутствуют фракции с м.м. ~ 8000, 8000, 6000 и 4000.
В спектре ЯМР 13С этого продукта наряду с сигналами, характерными для звеньев арабинозы и галактозы, наблюдаются малоинтенсивные сигналы в области 220 м.д., относящиеся к кетонным или альдегидным карбонильным группам, и в области 170-180 м.д. (карбоксильные или лактонные группы). Количественное содержание этих групп, определенное по интегральным интенсивностям сигналов, невелико и составляет 0,2 % и 0,61 % соответственно.
Таблица 1. Влияние условий реакции на выход продукта и содержание в нем ДКВ после обработки пероксидом водорода неосветленного экстракта
№ опыта t, °С т, ч Конц. Н2О2, моль/л рН раствора Выход АГ после осаждения, % Содержание ДКВ в сухом АГ, %
1 - - - 4,8 100 0,40
(без окисления) 2 40 1 0,1 4,8 95,4 0,31
3 40 1 0,2 4,8 95,0 0,26
4 40 1 0,5 4,7 94,1 0,20
5 40 2 0,1 4,8 91,2 0,29
6 40 2 0,2 4,7 91,0 0,12
7 40 2 0,5 4,5 91,6 0,11
8 60 1 0,1 4,8 89,9 0,26
9 60 1 0,2 4,7 87,7 0,16
10 60 1 0,5 4,6 82,8 0,22
11 60 2 0,2 4,7 86,2 0,12
12 60 2 0,5 4,3 81,3 0,20
13 60 3 0,2 4,6 85,1 0,09
14 60 4 0,2 4,4 84,3 0,15
Таблица 2. Влияние условий реакции на выход продукта и содержание в нем ДКВ при окислении осветленного экстракта АГ
№ п/п t, °С т, ч. конц. Н2О2, моль/л рН в конце реакции Выход АГ после осаждения, % Содержание ДКВ в сухом АГ, %
1 - - - 4,8 100 0,37
(без окисления) 2 40 2 0,1 90,3 0,13
3 40 2 0,2 - 90,3 0,06
4 40 2 0,5 4,5 89,0 0,07
5 40 4 0,1 - 92,0 0,25
6 40 4 0,2 4,5 90,0 0,16
7 40 4 0,5 4,4 90,0 0,16
8 60 2 0,2 4,5 89,7 0,08
9 60 2 0,5 4,3 83,0 0,18
10 70 2 0,2 4,3 84,1 0,14
11 70 2 0,5 4,0 81,0 0,12
12 70 4 0,2 4,0 81,9 0,11
13 70 4 0,5 3,7 80,7 0,14
Нами были исследованы низкомолекулярные продукты, удаляемые при переосаждении АГ этиловым спиртом. Растворимые в спирте продукты окисления при 70 °С (олигомерные фракции) были выделены выпариванием маточных растворов, полученных после отделения полимерных фракций. Выходы их зависят от условий окисления и составляют 5,2-10,6 %. В ИК-спектрах этих продуктов наблюдаются интенсивные полосы поглощения в области 1726-1791 см-1, характерные для валентных колебаний карбонильных групп. При этом полосы, характеризующие галактозные и арабинозные структурные фрагменты АГ (1050, 1075, 915, 775 см-1), в спектрах сохраняются.
Следовательно, в более жестких условиях под воздействием пероксида водорода происходит деструкция макромолекул АГ и функционализация олигомерных продуктов.
Известно, что эффективность пероксидной отбелки лигноцеллюлозных материалов существенно повышается при использовании хелатирующих агентов [7]. Кроме того, комплексообразователи предотвращают деструкцию макромолекул полисахарида. Наиболее доступным хелатором является ЭДТА. Исследования [9] показали, что эффективная константа скорости окисления арабиногалактана в присутствии ЭДТА снижается в 30 раз, и практически не накапливаются кислоты. Сама ЭДТА проявляет высокую устойчивость к окислению пероксидом водорода. Степень ее окисления зависит от основности среды; с повышением щелочности она увеличивается [18].
В настоящей работе была исследована возможность повышения эффективности очистки арабиногалактана пероксидным окислением в присутствии ЭДТА. Установлено, что добавки в реакционную смесь 0,125-5,0 ммоль/л комплексообразователя мало влияют на выход АГ и содержание в нем примеси ДКВ.
О степени удаления примесей фенольной природы судили по изменениям в УФ спектрах 0,2 %-ных водных растворов выделенных образцов АГ. Сравнение проводили с образцом АГ, выделенным осаждением из исходного экстракта (табл. 3, опыт 1). В УФ-спектрах полученных продуктов наблюдается интенсивный максимум поглощения в области 202-206 нм, плечо в области 230 нм и менее интенсивный максимум при 285 нм, характеризующие присутствие в АГ примесей не только ДКВ, но и лигнина. Это подтверждается наличием указанных полос в УФ-спектрах образцов АГ, полностью освобожденных от ДКВ ультрафильтрацией или диализом.
Полученные результаты свидетельствуют о высокой степени удаления хромофорных групп при окислении неосветленного экстракта (табл. 3). Предварительная обработка экстракта флокулянтом позволяет существенно снизить поглощение в указанных областях УФ спектра (табл. 4, опыт 2). Так как при флокуляции ДКВ не удаляется, то это снижение в основном обусловлено удалением лигнина. При сравнении данных, приведенных в таблицах 3 и 4, очевидно, что более эффективна очистка АГ при окислении осветленного экстракта. Окисление его в присутствии 0,25-0,5 ммоль/л ЭДТА (оптимальные условия) позволяет получить продукт со степенью чистоты 99,0 % (по данным ВЭЖХ).
Образцы АГ, полученные окислением в оптимальных условиях, имеют такое же молекулярно-массовое распределение, как исходный продукт; данные их ИК-спектров соответствуют литературным [4].
Таким образом, нами разработан эффективный, экологически безопасный метод, позволяющий получать арабиногалактан высокой степени чистоты без деструкции его макромолекул.
Исследование иммуномодулирующих свойств
Результаты исследования показали, что введение азатиоприна контрольной группе мышей угнетает развитие ГЗТ, что проявляется в достоверном снижении индекса реакции ГЗТ на 34% по сравнению с данными в интактной группе (табл. 5). После введения животным арабиногалактана на фоне азатиоприна отмечалось увеличение индекса реакции ГЗТ по отношению к контролю в 1,7 раза.
При исследовании влияния арабиногалактана на процессы антителообразования установлено, что АГ восстанавливает показатели гуморального иммунного ответа в условиях азатиоприновой иммуносупрессии. Введение азатиоприна приводило к снижению как абсолютного, так и относительного числа АОК на 56 и 57%, соответственно, по сравнению с теми же показателями в интактной группе (табл. 6).
При введении исследуемого вещества на фоне иммунодепрессии наблюдали достоверное увеличение количества АОК как в абсолютных значениях, так и при расчете на 106 спленоцитов; при этом первый показатель превышал уровень азатиоприновой супрессии в 2,12 раза, а второй - в 2,18 раза.
Таблица 3. Зависимость снижения оптической плотности УФ-поглощения 0,2%-х водных растворов выделенных образцов АГ от условий реакции при окислении неосветленного экстракта
№ опыта Условия эксперимента Оптическая плотность (Б) Снижение Б, %
т, ч 1, оС СН2О2, моль/л СЭДТА; ммоль/л 202-206 нм 230 нм 285 нм 206 нм 230 нм 285 нм
1 исходный АГ — — — — 1,03* 0,44* 0,261* 0 0 0
2 1 40 0,2 1,60 0,83 0,41 84,5 81,1 84,3
3 1 60 0,2 - 1,12 0,59 0,29 89,1 86,6 88,9
4 2 60 0,5 - 1,70 0,94 0,44 83,5 78,6 83,1
5 2 60 0,2 - 1,66 0,90 0,42 83,9 79,5 83,9
6 2 60 0,2 0,125 0,84 0,24 0,18 91,8 94,5 93,1
7 2 60 0,2 0,25 1,38 0,66 0,30 86,6 85,0 88,5
8 2 60 0,2 0,5 0,74 0,32 0,15 92,8 92, 7 94,3
* Измерено при концентрации 0,02 %.
Таблица 4. Влияние условий реакции окисления осветленного экстракта на снижение оптической
плотности поглощения в УФ-спектрах 0,2 %-х водных растворов выделенных образцов АГ
№ Условия эксперимента Оптическая плотность (D) Cнижение D, %
п/п t, °C C(H2O2), моль/л C ЭДТА, ммоль/л 206 нм 230 нм 285 нм 206 нм 230 нм 285 нм
1 - - - 1,03* 0,44* 0,261* 0 0 0
исходный АГ
2 - - - 1,24 0,62 0,31 88,0 85,9 88,1
после флокуляции
3 40 0,2 - 0,92 0,43 0,22 91,8 90,2 91,6
4 60 0,1 - 1,02 0,48 0,24 90,1 89,1 90,8
5 60 0,2 - 0,66 0,31 0,17 93,6 93,0 93,5
6 60 0,5 - 0,92 0,39 0,21 91,1 91,1 92,0
7 60 0,2 0,125 0,92 0,42 0,20 91,1 90,5 92,3
8 60 0,2 0,25 0,50 0,20 0,10 95,1 95,5 96,2
9 60 0,2 0,5 0,40 0,17 0,08 96,1 96,1 96,9
10 60 0,2 1,0 0,91 0,38 0,19 91,2 91,4 92,7
11 60 0,2 2,0 0,64 0,25 0,12 93,8 94,3 95,4
12 60 0,2 5,0 0,58 0,18 0,10 94,4 95,9 96,2
* Измерено при концентрации 0,02 %.
Таблица 5. Влияние арабиногалактана на выраженность гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ)
Группы животных Доза, мг/кг Индекс реакции ГЗТ,%
Интактная (n=10) - 21,5+1,64
Контрольная (азатиоприн-Аз) (n=8) 50 14,2±0,91
Опытная (Аз+арабиногалактан) (n=8) 200 24,З±1,98*
Примечание. Здесь и далее п - количество животных в группе, * - означает, что разница существенна (р<0,05) по сравнению с контролем.
Таблица 6. Влияние арабиногалактана на антителообразование
Группы животных Доза, мг/кг Количество АОК
на селезенку на 106 спленоцитов
Интактная (n=8) - 97559±7256 752±56
Контрольная (азатиоприн -Аз) (n=8) 50 42948±285З З2З±З0
Опытная (Аз+арабиногалактан) (n=8) 200 90891±4576* 704±З0*
Полученные данные свидетельствуют о том, что арабиногалактан лиственницы сибирской является достаточно эффективным иммунокорригирующим средством. Это позволяет рекомендовать его для дальнейшего изучения и использования в целях профилактики и лечения некоторых заболеваний, связанных с расстройством функций иммунной системы организма.
Таким образом, исследование иммуномодулирующих свойств арабиногалактана, выделенного из древесины лиственницы сибирской, выявило эффективность его по отношению к реакциям клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа. Арабиногалактан в использованной дозе способен ослаблять супрессивное действие азатиоприна на клеточно-опосредованную иммунную реакцию и антителогенез, что выражается в стимуляции восстановления показателей иммунитета.
Список литературы
1. Бабкин В.А., Остроухова Л.А., Дьячкова C.R, Cвяткин Ю.К. и др. Безотходная комплексная переработка биомассы лиственниц сибирской и даурской // Химия в интересах устойчивого развития. 1997. Т. 5. C. 105-115.
2. Антонова Г.Ф. Исследования фракционного состава полисахарида арабиногалактана древесины лиственницы сибирской // Химия древесины. 1977. №4. C. 97-100.
3. Ettling B. V.,Adams M.F. Gel filtration of arabinogalactan from Western Larch // TAPPI. 1968. V. 51. №3. P. 116-118.
4. Антонова Г.Ф., Тюкавкина Н.А. Получение высокочистого арабиногалактана из древесины лиственницы // Химия древесины. 1976. №4. С. 60-62.
5. Оболенская А.В., Ельницкая З.П., Леонович А.А. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы. М., 1991. 320 с.
6. Медведева Е.Н., Бабкин В..А., Остроухова Л.А. Арабиногалактан лиственницы - свойства и перспективы использования (Обзор) // Химия растительного сырья. 2003. №1. С. 27-37.
7. Медведева Е.Н., Вершаль В.В., Бабкин В.А. Пероксид водорода - перспективный реагент для создания экологически чистой технологии производства целлюлозы // Химия в интересах устойчивого развития. 1996. Т. 4. №4-5. С. 343-354.
8. Резников В.М. Превращение лигнина при окислении пероксидом водорода и молекулярным кислородом // Химия древесины. 1991. №2. С. 3-11.
9. Широкова Е.Н. Окисление арабиногалактана под действием пероксида водорода и персульфата калия в водной среде: Автореф. дис. ... канд. хим. наук: Уфа, 2003. 22 с.
10. Бабкин В.А., Медведева Е.Н., Остроухова Л.А., Онучина Н.А., Малков Ю.А. Эффективный способ очистки арабиногалактана из древесины лиственницы // Сб. статей по материалам Всеросс. науч.-практич. конф. «Химико-лесной комплекс - проблемы и решения». Красноярск, 11-12 апр. 2002. Т. 3. С. 102-104.
11. Dubous M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Pebers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // J. Analyt. Chem. 1956. V. 28. №.3. P. 350-356.
12. Лазарева Д.Н., Алехин Е.К. Стимуляторы иммунитета. М., 1985. 256 с.
13. Дубровина В.И., Медведева С.А., Александрова Г.П., Тюкавкина Н.А. и др. Иммуномодулирующие свойства арабиногалактана лиственницы сибирской (Larix sibirica L.) // Фармация. 2001. №5. С. 26-27.
14. Петров Р.В., Хаитов Р.М., Чередеев А.Н. и др. Иммунофармакологические подходы к оценке иммуномодуляторов // Иммуномодуляторы. М., 1987. С. 9-10.
15. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М., 2000. 398 с.
16. Cunningham A.J. A method of increased sensitivity for detecting single antibodyforming cells // Nature. 1965. V. 207. №5001. P. 1106-1107.
17. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологическогоэффекта. Л., 1963. С. 81-107.
18. Virtapohja J., Alen R. Fate of EDTA and DTPA in the pulp and paper industries // Proc. 10th Int. Symp. Wood Pulp. Chem., Yokohoma, Yapan, 7-10 June 1999. V.1. Р. 280-285.
Поступило в редакцию 7 декабря 2004 г.
После переработки 27 февраля 2005 г.
