CC BY
0
Лаптева Ю.С., Быков В.В., Трунилина М.В., Болдаевский И.С., Кудряшов Т.А., Вологжанникова А.А., Соколов А.С. «Получение сверхстабильной метионинаминопептидазы для удаления метионина из рекомбинантных белков»
https://doi.org/10.33647/2713-0428-19-3E-47-51
(ССУ
BY 4.0
ПОЛУЧЕНИЕ СВЕРХСТАБИЛЬНОИ МЕТИОНИНАМИНОПЕПТИДАЗЫ ДЛЯ УДАЛЕНИЯ МЕТИОНИНА ИЗ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ
Ю.С. Лаптева, В.В. Быков, М.В. Трунилина, И.С. Болдаевский, Т.А. Кудряшов*, А.А. Вологжанникова, А.С. Соколов
Институт биологического приборостроения ФГБУН ФИЦ «Пущинский научный центр биологических исследований» РАН 142290, Российская Федерация, Московская обл., Пущино, просп. Науки, 3
Отщепление N-концевого инициирующего метионина (Мет1) является критически значимой кои посттрансляционной модификацией, затрагивающей 50-70% клеточных белков. При наработке рекомбинантных белков в гетерологичной системе экспрессии E. rnli отщепление Мет1 часто не происходит, что приводит к гетерогенности получаемых препаратов, изменению их активности и стабильности. Решают эту проблему обработкой рекомбинантных белков in vitro специфическим ферментом — метионинаминопептидазой (МАП). Имеющиеся в настоящее время МАП обладают ограниченными специфичностями и условиями проведения реакций. Нами клонирована МАП из гипертермофильной бактерии, разработана методика очистки фермента, исследован ряд физико-химических свойств. Новый фермент МАП обладает устойчивостью к высоким температурам. МАП сохраняет стабильное нативное состояние в диапазоне рН от 3 до 11 единиц. Новый фермент МАП может быть использования для удаления N-концевого Мет1 из рекомбинантных белков in vitro в широком диапазоне рН и в условиях повышенных температур.
Ключевые слова: метионинаминопептидаза, Thermus thermophilus, гетерологичная экспрессия, удаление N-концевого метионина
Конфликт интересов: авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование: исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда, грант № 23-24-00563.
Для цитирования: Лаптева Ю.С., Быков В.В., Трунилина М.В., Болдаевский И.С., Кудряшов Т.А., Вологжанникова А.А., Соколов А.С. Получение сверхстабильной метионинаминопептидазы для удаления метионина из рекомбинантных белков. Биомедицина. 2023;19(3Е):47-51. https://doi.org/ 10.33647/2713-0428-19-3Е-47-51
Поступила 20.04.2023
Принята после доработки 16.05.2023
Опубликована 06.11.2023
OBTAINING OVERSTABLE METHIONINE AMINOPEPTIDASE FOR THE REMOVAL OF METHIONINE FROM RECOMBINANT PROTEINS
Yulia S. Lapteva, Vyacheslav V. Bykov, Maria V. Trunilina, Igor S. Boldaevsky, Timofey A. Kudryashov*, Alisa A. Vologzhannikova, Andrey S. Sokolov
Institute for Biological Instrumentation of the Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences 142290, Russian Federation, Moscow Region, Pushchino, Nauki Ave., 3
Cleavage of the N-terminal initiating methionine (Metl) is a critical co- and post-translational modification affecting 50-70% of cellular proteins. During the production of recombinant proteins in the heterologous system of E. coli expression, Metl cleavage often fails to occur, which leads to heterogeneity of the preparations obtained, changes in their activity and stability. This problem can be solved by treating recombinant proteins in vitro with a specific enzyme, methionine aminopeptidase (MAP). Currently available MAPs exhibit limited specificities and reaction conditions. We cloned a MAP from a hyperthermophilic bacterium, developed a method for enzyme purification, and studied a number of physicochemical properties. The new MAP enzyme is resistant to elevated temperatures. The MAP maintains a stable native state in a pH range from 3 to 11 units. The novel MAP enzyme can be used to remove N-terminal Metl from recombinant proteins in vitro over a wide pH range and at elevated temperatures.
Keywords: methionine aminopeptidase, Thermus thermophilus, heterologous expression, N-terminal methi-onine excision
Conflict of interest: the authors declare no conflict of interest.
Funding: the research was supported by a grant from the Russian Science Foundation, No. 23-24-00563. For citation: Lapteva Yu.S., Bykov V.V., Trunilina M.V., Boldaevsky I.S., Kudryashov T.A., Vologzhan-nikova A.A., Sokolov A.S. Obtaining Overstable Methionine Aminopeptidase for the Removal of Methionine From Recombinant Proteins. EuoMed^ma. 2023;19(3E):47-51. https://doi.org/10.33647/2713-0428-19-3E-47-51
Submitted 20.04.2023 Revised 16.05.2023 Published 06.11.2023
Введение
Биосинтез полипептидной цепи в клетках начинается с инициирующего метионина (Мет1), который затем удаляется специфическим ферментом клеток — метионинами-нопептидазой (МАП). Удаление Мет1 является крайне консервативной и критически значимой ко- и посттрансляционной модификацией, затрагивающей 50-70% клеточных белков [6]. Модификация необходима для правильной субклеточной локализации белков [9], осуществляет контроль продолжительности жизни белков [7], предшествует другим посттрансляционным модификациям [3, 4]. При сверхэкспрессии рекомбинантных белков в Е. соН отщепление Мет1 либо совсем не происходит, либо происходит частично. В результате получаются препараты смеси белков с Мет1 и без него. При сравнении двух форм рекомбинантно-го рибосомального белка S6 Т. ЛегторИш' (с ^концевым Мет1 и без него) были показаны существенные различия в структурных свойствах белка и его конформа-ционной стабильности [11]. Две формы
человеческого сывороточного амилоида А отличаются по способу фибриллообразо-вания и патогенеза [10]. Отщепление Мет1 критично для ферментативной активности и цитотоксичности онконазы [8], а также необходимо для ряда биотехнологически значимых белков — гемоглобина человека [1], интерлейкина-2 [5], интерлейкина-36 альфа, гормона роста, рибонуклеаз лягушки и человека [2]. Поскольку удаление Мет1 из реком-бинантного белка часто имеет решающее значение в поддержании его стабильности и функции, проводят либо коэкспрессию целевых белков с МАП из разных организмов, либо обработку рекомбинантных белков МАП in vitro. Имеющиеся в настоящее время коммерчески доступные МАП E. coli и человека обладают ограниченной субстратной специфичностью и условиями проведения реакций (температура и рН оптимум) in vitro. В этой связи актуален поиск новых МАП, особенно способных работать в условиях повышенных температур и широкого диапазона рН.
Лаптева Ю.С., Быков В.В., Трунилина М.В., Болдаевский И.С., Кудряшов Т.А., Вологжанникова А.А., Соколов А.С. «Получение сверхстабильной метионинаминопептидазы для удаления метионина из рекомбинантных белков»
Целью данной работы является изучение тепловой и рН стабильности метиони-наминопептидазы из гипертермофильной бактерии Thermus thermophilus.
Материалы и методы
Ген (GenBank: TTH_RS08450) метиони-наминопептидазы Thermus thermophilus HB8 (ВКМ В-1605) клонирован в вектор под контроль гибридного T7lac промотора. Рекомбинантный фермент МАП нарабатывали в клетках E. coli штамма BL21(DE3). Очистку фермента проводили при помощи металл-хелатной, ионнообменной и экс-клюзионной хроматографии. Гомогенность препарата оценивали при помощи электрофореза в 15% ПААГ и методом масс-спект-рометрии. С использованием метода собственной флюоресценции белка исследовали тепловую стабильность и рН-стабильность фермента. Поскольку МАП является кобальт-зависимой протеазой, проводилось исследование двух форм белков: апоформы (без металла) и кобальт-связанной формы (0,1 мМ Со2+).
Результаты и их обсуждение
Ген МАП успешно амплифицирован нами из геномной ДНК Thermus thermophilus HB8 и клонирован в вектор pHUE. При индукции экспрессии МАП в клетках E. coli наблюдается наработка белка, соответствующего расчетной молекулярной массе фермента. Нами разработана методика очистки фермента, позволяющая получать его в гомогенном состоянии. При этом вы-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ | REFERENCES
1. Adachi K., et al. Expression of functional soluble human alpha-globin chains of hemoglobin in bacteria. Protein Expr. Purif. 2000;20(1):37-44.
2. Boix E., et al. Role of the N terminus in RNase A homologues: differences in catalytic activity, ribonucle-ase inhibitor interaction and cytotoxicity. J. Mol. Biol. 1996;257(5):992-1007.
ход фермента составляет примерно 20 мг/Л культуры. Фермент МАП содержит четыре остатка триптофана и шесть остатков тирозина, что позволяет использовать метод собственной флуоресценции белка для изучения конформационных переходов в белке. С использованием этого метода провели исследование изменения конформации фермента при его нагревании от 20 до 98°С в буфере 50 мМ Hepes pH=7,5, 150 мМ KCl, 14 мкМ DTT. Нами показано, что середина теплового перехода белка из нативного в денатурированное состояние составляет 65°С для апоформы и 79°С — для кобальт-связанной формы. Это свидетельствует о том, что термостабильность фермента в апоформе составляет 65°С, а связывание ферментом ионов кобальта приводит к увеличению его термостабильности до 79°С. Методом собственной флуоресценции нами также исследована стабильность фермента в диапазоне рН 2-12. Нами установлено, что фермент сохраняет свою конфор-мационную стабильность при рН от 3 до 11 единиц как в апоформе, так и в кобальт-связанном состоянии.
Выводы
Проведенные нами исследования свидетельствуют о том, что новый фермент МАП из гипертермофильной бактерии Thermus thermophilus может применяться в биотехнологии для удаления N-концевого инициирующего метионина из рекомбинантных белков in vitro в условиях высоких температур и в широком диапазоне рН среды.
3. Bradshaw R.A., Brickey W.W., Walker K.W. N-terminal processing: the methionine aminopepti-dase and N alpha-acetyl transferase families. Trends Biochem. Sci. 1998;23(7):263-267.
4. Chen L., Kashina A. Post-translational Modifications of the Protein Termini. Front. Cell Dev. Biol. 2021;9:719590.
5. Endo S., et al. The additional methionine residue at the N-terminus of bacterially expressed human inter-
leukin-2 affects the interaction between the N- and C-termini. Biochemistry. 2001;40(4):914-919.
6. Giglione C., Boularot A., Meinnel T. Protein N-terminal methionine excision. Cell Mol. Life Sci. 2004;61(12):1455-1474.
7. Giglione C., Vallon O., Meinnel T. Control of protein life-span by N-terminal methionine excision. EMBO J. 2003;22(1):13-23.
8. Liao Y.D., et al. The structural integrity exerted by N-terminal pyroglutamate is crucial for the cytotoxicity of frog ribonuclease from Rana pipiens. Nucleic Acids Res. 2003;31(18):5247-5255.
9. Meinnel T., Mechulam Y., Blanquet S. Methionine as translation start signal: a review of the enzymes of the pathway in Escherichia coli. Biochimie. 1993;75(12):1061-1075.
10. Patke S., et al. Characterization of the oligomerization and aggregation of human Serum Amyloid A. PLoS One. 2013;8(6):e64974.
11. Uversky V.N., et al. Structure and stability of recombinant protein depend on the extra N-terminal methionine residue: S6 permutein from direct and fusion expression systems. Biochem. Biophys. Acta. 1999;1432(2):324-332.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ | INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Лаптева Юлия Сергеевна, к.б.н., Институт биологического приборостроения ФГБУН ФИЦ «Пущинский научный центр биологических исследований» РАН; e-mail: [email protected]
Быков Вячеслав Владимирович, Институт биологического приборостроения ФГБУН ФИЦ «Пущинский научный центр биологических исследований» РАН; e-mail: [email protected]
Трунилина Мария Викторовна, Институт биологического приборостроения ФГБУН ФИЦ «Пущинский научный центр биологических исследований» РАН; e-mail: [email protected]
Болдаевский Игорь Сергеевич, Институт биологического приборостроения ФГБУН ФИЦ «Пущинский научный центр биологических исследований» РАН; e-mail: [email protected]
Yulia S. Lapteva, Cand. Sci. (Biol.), Institute for Biological Instrumentation of the Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences; e-mail: [email protected]
Vyacheslav V. Bykov, Institute for Biological Instrumentation of the Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences;
e-mail: [email protected]
Maria V. Trunilina, Institute for Biological Instrumentation of the Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences;
e-mail: [email protected]
Igor S. Boldaevsky, Institute for Biological Instrumentation of the Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences;
e-mail: [email protected]
Кудряшов Тимофей Андреевич*, Институт биологического приборостроения ФГБУН ФИЦ «Пущинский научный центр биологических исследований» РАН; e-mail: [email protected]
Timofey A. Kudryashov*, Institute for Biological Instrumentation of the Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences;
e-mail: [email protected]
Лаптева Ю.С., Быков В.В., Трунилина М.В., Болдаевский И.С., Кудряшов Т.А., Вологжанникова А.А., Соколов А.С. «Получение сверхстабильной метионинаминопептидазы для удаления метионина из рекомбинантных белков»
Вологжанникова Алиса Андреевна, к.б.н., Институт биологического приборостроения ФГБУН ФИЦ «Пущинский научный центр биологических исследований» РАН; e-mail: [email protected]
Соколов Андрей Сергеевич, к.б.н., Институт биологического приборостроения ФГБУН ФИЦ «Пущинский научный центр биологических исследований» РАН; e-mail: [email protected]
Alisa A. Vologzhannikova, Cand. Sci. (Biol ), Institute for Biological Instrumentation, Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences; e-mail: [email protected]
Andrey S. Sokolov, Cand. Sci. (Biol.), Institute for Biological Instrumentation of the Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences; e-mail: [email protected]
* Автор, ответственный за переписку / Corresponding author
