CC BY
13ЛИТЕРАТУРА
1. Деев С.М., Лебеденко Е.Н. Современные технологии создания неприродных антител для клинического применения. Acta Naturae. 2009, 1: 32-50.
2. Деев С.М., Лебеденко Е.Н., Петровская Л.Е., Долгих Д.А., Габибов А.Г., Кирпичников М.П. Неприродные антитела и иммуноконъюгаты с заданными свойствами: оптимизация функций через направленное изменение структуры. Успехи химии. 2015, 84 (1): 1-26.
3. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М., Мир, 2000.
4. Imai S., Mukai Y., Nagano К. et al. Quality enhancement of the non-immune phage scFv library to isolate effective antibodies. Biol. Pharm. Bull. 2006, 29 (7): 1325-1330.
5. Kreitman R.J. Immunotoxins for targeted cancer therapy. AAPS J. 2006, 8 (3): 532-551.
6. Pai L.H., Wittes R., Setser A. et al. Treatment of advanced solid tumors with immunotoxin LMB-1: an antibody linked to Pseudomonas exotoxin. Nat. Med. 1996, 2: 350-353.
7. Redwan R.M. Animal-derived pharmaceutical proteins. J. Immunoassay Immunochem. 2009, 30 (3): 262-290.
8. Teicher B.A., Chari R.V. Antibody conjugate therapeutics: challenges and potential. Clin. Cancer. Res. 2011, 17 (20): 6389-6397.
9. Witzig Т.Е. Radioimmunotherapy for B-cell non-Hodgkin lymphoma. Best Pract. Res. Clin. Haematol. 2006,19: 655-668.
Поступила 10.07.17
Контактная информация: Оксанич А.С.,
105064, Москва, М. Казенный пер., 5а, р.т. (495)917-49-00
© коллектив авторов, 2017
Г.И.Алаторцева1, А.В.Сидоров1, Л.Н.Нестеренко', Л.Н.Лухверчик', М.В.Жукина1, И.И.Амиантова', А.В.Милованова', Д.С.Воробьев1, Ю.И.Аммур1, М.И.Михайлов'-2, К.К.Кюрегян1'2, В.С.Кичатова1-2, И.А.Потемкин1-2, О.В.Исаева12, Е.Ю.Малинникова1'2, А.А.Карлсен''2, В.М.Блинов1, З.Ш.Нурматов3, А.З.Нурматов3, О.Т.Касымов3, С.В.Жаворонок4, В.В.Зверев'
ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ORF3 ВИРУСА ГЕПАТИТА Е 1 ГЕНОТИПА С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕТОДА ОПТИМИЗАЦИИ КОДОНОВ
'НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования, Москва, Россия; 3НПО «Профилактическая медицина», Бишкек, Кыргызская Республика; белорусский государственный медицинский университет, Минск, Республика Беларусь
Цель. Получение рекомбинантного аналога полноразмерного белка ORF3 вируса гепатита Е (ВГЕ) 1 генотипа. Материалы и методы. Штаммы Escherichia coli, плазмидные векторы, серологический и клинический материал, иммуноферментные тест-системы. Молекулярно-биологические, биоинформационные, биотехнологические, биохимические и серологические методы. Результаты. Из препарата РНК ВГЕ 1 генотипа, выделенного от больного из Киргизии, получена рекомбинантная плазмида, содержащая ДНК копию субгеномной вирусной РНК. С использованием данной плазмиды получены штаммы E.coli — продуценты рекомбинантного антигена ORF3 ВГЕ 1 генотипа в виде слитного с Р-галактозидазой E.coli полипептида, содержащего полноразмерную копию белка ORF3. Для повышения уровня экспрессии рекомбинантного белка проведена оптимизация ко-донов клонированного фрагмента кДНК. Рекомбинантный белок ORF3 выделен из телец-включений биомассы штамма-продуцента и очищен методом эксклюзионной хроматографии. Антигенная специфичность полученного полипептида подтверждена методами иммуноферментного анализа и вестерн-блотгинга со специфическими сыворотками. Заключение. Разработан рекомбинантный антиген ORF3 ВГЕ 1 генотипа и экспериментально показана возможность его применения в диагностических тестах.
Журн. микробиол., 2017, № 6, С. 63-72
Ключевые слова: вирус гепатита Е, ВГЕ 1 генотипа, ген огО, рекомбинантный антиген ORF3, ИФА, вестерн-блотгинг
G.LAlatortseva', A.V.Sidorov1, L.N.Nesterenko', L.N.Luhverchik', M.V.Zhukina1,1.I.Amiantova', A.V.Milovanova', D.S.Vorobev' Yu.LAmmur1, MJ.Mikhailov'-2, K.K.Kyuregyan'-2, V.S.Kichatova'-2, I.A.Potemkin'-2, O.V.lsaeva1-2, E.Yu.Malinnikova1,2, AA.Karlsen1-2, V.M.Blinov', Z.Sh.Nurmatov3, A.Z.Nurmatov3, O.T.Kasymov3, S.V.Zhavoronolc4, V.V.Zverev'
DESIGN OF HEPATITIS E VIRUS GENOTYPE 1 RECOMBINANT ORF3 PROTEIN BY CODON OPTIMIZATION METHOD
'Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, 2Russian Medical Academy of Continuous Professional Education, Moscow, Russia; Scientific Production Association «Preventive Medicine», Bishkek, Kyrgyz Republic; 4Belarusian State Medical University, Minsk, Republic of Belarus
Aim. The development of the hepatitis E virus (HEV) genotype 1 full-size ORF3 recombinant polypeptide. Materials and methods. Escherichia coli strains, plasmid vectors, serological and clinical samples, ELISA reagent kits, molecular biological, bioinformatic, biotechnological, biochemical and serological methods. Results. HEV genotype 1 RNA had been isolated from clinical samples collected in Kyrgyzstan. DNA copy of subgenomic virus RNA had been cloned and used for further development of E.coli strains producing full-size recombinant protein ORF3 fused to E.coli beta-galactosidase. Codons optimization method was used in aim to increase expression level of recombinant protein. Recombinant protein ORF3 had been isolated from the inclusion bodies of the E.coli biomass and purified by size exclusion chromatography. Antigenic specificity of recombinant polypeptide had been confirmed by enzyme-linked immunosorbent assay and Western blotting with the specific sera. Conclusion. HEV genotype 1ORF3 recombinant antigen had been designed, and it's applicability in diagnostic tests had been experimentally confirmed.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2017, No. 6, P. 63-72
Key words: hepatitis E virus, genotype 1 HEV, orf3 gene, recombinant ORF3 antigen, ELISA, Western blotting
ВВЕДЕНИЕ
Основным лабораторным показателем инфицирования вирусом гепатита Е (ВГЕ) является выявление в сыворотке крови больных специфических антител методом иммуноферментного анализа. Из-за трудностей, связанных с культивированием ВГЕ, известные к настоящему времени диагностические тест-системы основаны главным образом на использовании рекомбинантных антигенов.
Геном ВГЕ представляет собой одноцепочечную полиаденилированную РНК положительной полярности размером 7,3 тысяч нуклеотидных остатков (т.н.о.), содержит три открытых рамки считывания огП, огО и огВ, а также недавно обнаруженную четвертую открытую рамку считывания о114 [17], трансляция которой происходит через внутренний сайт связывания рибосом. В процессе репликации синтезируется кодирующая основные антигенно значимые белки ОЯР2 и ОЯРЗ субгеномная бицистронная РНК размером 2,2 т.н.о. [9]. Одним из диагностически значимых антигенов является продукт
гена orß — белок ORF3, или VP13, с молекулярной массой 13 kDa и протяженностью 113—114 аминокислотных остатков (а.о.). ORF3 — мультифунк-циональный регуляторный белок, отвечающий за уклонение вируса от иммунного ответа хозяина, регуляцию репликации вируса, сборку и созревание вирионов, выход вируса из инфицированной клетки [23]. Установлено, что в составе белка ORF3 имеется 3 антигенных домена в области 31—40 а.о., 63 — 76 а.о. и С-концевого участка, который содержит основные иммунодоми-нантные эпитопы [11,21]. Известно также, что в положении 63 — 76 а.о. присутствует обогащенный пролином мотив «РХХР», содержащий линейные и поверхностно-ориентированные генотип-специфические антигенные сайты [22]. Диагностически важная особенность белка ORF3 — его способность взаимодействовать с сыворотками крови больных на поздних сроках острой фазы инфекции и в ранней фазе реконвалесценции [16].
Применение антигенов, в полной мере содержащих иммунодоминантные участки данного белка, представляется перспективным не только с точки зрения возможности выявления генотип-специфических антител, но и для определения давности инфицирования и стадии заболевания гепатитом Е (ГЕ). Заболевание, вызываемое ВГЕ 1 генотипа, является строгим антропоно-зом и распространено на территории стран постсоветского пространства Центральной Азии. В данной работе была поставлена задача получения ре-комбинантного аналога полноразмерного белка VP 13 ВГЕ 1 генотипа штамма, циркулирующего в странах СНГ и имеющего эпидемиологическую значимость с точки зрения возможного завоза в Россию в связи с увеличением международной трудовой миграции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Праймеры и пробы для ПЦР и секвенирования синтезировали в Институте биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова. Получение фекальных экстрактов, выделение из них нуклеиновых кислот и подтверждение наличия РНК ВГЕ методом вложенной ПЦР проводили по ранее разработанным методикам [7].
ДНК-копию вирусной РНК (кДНК) получали на матрице очищенной из фекальных экстрактов РНК, содержащих РНК ВГЕ 1 генотипа, с использованием 18-членных олиго-сГГ-праймеров и обратной транскриптазы SuperScript III («Life Technologies», США). Вирусную кДНКамплифицировали с помощью высокоточной ДНК-полимеразы «Phusion» («Finnzymes», Финляндия) в соответствии с рекомендациями производителя. Реакции проводили на термо-циклере «TProfessional Gradient» («Biometra», Германия).
ПЦР-продукты необходимого размера выделяли из агарозных гелей после электрофоретического разделения ампликонов, затем проводили еще один цикл ПЦР-амплификации с Taq-полимеразой, полученные ПЦР-продукты очищали на спин-колонках «Micro Bio-SpinBio-Gel Р-30» («BioRad», США) и использовали в А/Т-клонировании. Лигирование полученных ДНК-вставок в плазмидные векторы pGEM-Teasy («Promega», США) и pEL5a [1] и трансформацию компетентных клеток E.coli СС001 генотипа XL-Blue (ООО «Евроген», Россия) и штамма E.coli PLT90 (F-, lon::TnlO(TetR), endAl, malPpa::[PR, C1857](Mal-, Ximm) thi, hsdR17) [2] лигазной смесью осуществляли по общепринятому методу [6].
Определение нуклеотидной последовательности ДНК после очистки проводили в Институте биоорганической химии. Для анализа и обработки ну-клеотидных и аминокислотных последовательностей, дизайна праймеров
использовали пакеты программ «Vector NTI», AS [19] и MEGA [14]. Потенциальные иммунодоминантные участки вирусных белков определяли по результатам расчета гидрофильных и гидрофобных профилей [15]. Анализ коротких пептидных гомологий между ВГЕ 1 генотипа и герпесвирусами человека 1 — 8 типов проводили, используя ранее описанные алгоритмы [13].
Получение биомасс культур клеток E.coli PLT90, трансформированных векторной или рекомбинантными плазмидами, выделение и очистку реком-бинантных полипептидов проводили по ранее опубликованным методикам [4, 5].
В работе использовали сыворотки крови и фекалии больных гепатитом из инфекционных больниц г. Ош (Киргизия) и сыворотки крови больных гепатитом, предоставленные БГМУ (Минск, Беларусь). Сыворотки крови условно здоровых лиц и контрольной группы (содержащие серологические маркеры инфицирования вирусами гепатитов А, В, С и инфекционных патологий печени иной этиологии: инфекционный мононуклеоз, цитомегаловирусная инфекция, ВИЧ-инфекция) были получены из МОНИКИ им. М.Ф.Влади-мирского и Клинико-диагностического центра НИИВС им. И.И.Мечникова (Москва). В качестве положительного контрольного образца использовали рекомбинантный полипептид ORF3 ВГЕ штамма Бирма из коллекции Лаборатории клонирования вирусных геномов НИИВС им. И.И.Мечникова [3]. IgG к ВГЕ в образцах сывороток крови выявляли с помощью иммунофер-ментной тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-HEV-G» (НПО «Диагностические системы»). Серологические маркеры инфицирования вирусами гепатитов А, В, С и возбудителями инфекционной патологии печени иной этиологии определяли с помощью коммерческих иммуноферментных тест-систем «ДС-HOA-AHTH-HAV-G-PEKOMB», «ДС-ИФА-НВвАв-подтверждающий тест», «ДС-ИФА-ВИЧ-АГ/АТ Скрин» (НПО «Диагностические системы»), «Вектогеп B-HBs-aHTHreH-2», «ГепаБест анти-HBc-IgG», «Бест анти-ВГС-авто», «Бест анти-ВГС-подтверждающий тест», «Бест анти-ВГС-подтверждающий тест», «BeKTOÜ,MB-IgG-aBHflHOCTb», «ВектоВЭБ-EA-IgG», «ВектоВЭБ-NA-IgG» (ЗАО «Вектор-Бест»), «БЛОТ ВИЧ У2+0» (ЗАО БТК «Биосервис»). Иммуноферментный анализ выполняли в соответствии с инструкциями производителей соответствующих тест-систем.
Вестерн-блоттинг и твердофазный непрямой иммуноферментный анализ проводили с помощью ранее описанных методик [4, 20].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Из образцов фекалий пациентов из Киргизии с клиническими признаками гепатита, содержащих РНК ВГЕ 1 генотипа, выделили тотальную РНК, которую использовали для получения кДНК в реакциях обратной транскрипции с применением олиго-с1Т-праймеров. Для клонирования фрагментов субгеномной РНК использовали 5 полученных образцов кДНК и 5 пар специфических праймеров, рассчитанных на основе последовательности генома вируса ВГЕ 1 генотипа (NCBIАВ369689), выбранного в качестве консенсуса поданным биоинформационного анализа. С целью получения необходимого ПЦР-продукта отработали условия проведения реакции: состав буфера, концентрация реагентов, продолжительность элонгации, температура отжига матрицы. После оптимизации условия ПЦР были следующими: 40 сек. при +98°С , затем 30 циклов амплификации (денатурация в течение 5 сек при +98°С, отжиг матрицы в течение 20 сек при +67,5°С, синтез второй цепи в течение 2
к».. J
1 :Jm«4
vihh при +72°C) и финальная элонгация 5 мин при +72"С. В результате были получены ЛЦР-продукты размером от 2200 до 2300 п.н. в количестве, достаточном для клонирования в векторе pGEM-Teasy («Promega», США) (рис. ! .
При последующем А/Т-клонировании получили клоны E.coli CCOOl (XL-Blue), содержащие в составе рекомбинантной плаз-миды pGEMeasy-HEl фрагменты ДНК размером 2,3 т.п.н., соответствующие субгеномной РНК вируса, что было подтверждено секвенированием. Сравнительный анализ показал совпадение аминокислотной последовательности белка, кодируемого клонированным фрагментом ДНК, с белком ORF3 референсного штамма вируса за исключением одной аминокислотной замены (А1аз4 на УаЫ).
Последовательность белка ORF3 дополнительно проанализировали с помощью исследования профиля его гидрофобности/ гидрофильности, рассчитанного по индексу гидропатичности [15], где более высокие значения индекса соответствуют более гидрофобным участкам полипептидов. Про-
1
3
4
Рис. 1. Электрофорез ПЦР-продуктов в 0,8% агарозном геле в присутствии бромистого этидия.
Дорожки: 1,2 — ПЦР-продукты, 3 — отрицательный контроль (ПЦР без ДНК), 4 — маркеры молекулярных масс (сверху вниз: 10 000, 8001 <, 6000, 5000, 4000. 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 500 пар нуклеотидных остатков).
вели анализ kodotkhx пептидных гомологии
— мотивов потенциальных линейных эпитопов — между белком ORF3 ВГЕ 1 генотипа и белками семейства герпесвирусов человека 1 — 8 типов с использованием доступных в базах данных аминокислотных последовательностей. В аминокислотной последовательности полученного белка ORF3 не было обнар>жено совпадений с последовательностями структурных белков герпес-вирусов, за исключением фрагмента Gln63-Pro69, подобного участку ядерного белка EBNA-2 вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ), однако большая часть этой последовательности находится вне экспериментально картированной иммуно-доминантной области Ser6?-Gly-6 [4], совпадая лишь потрем аминокислотным остаткам Ser67-Pro69-Pr069.
Фрагмент кДНК гена orf3 из рекомбинантной плазмиды pGLMeasy-HEl переклонировали в экспрессирующий вектор pEL5a с помощью ПЦР по сайтам рестрикции BamHI и Pstl. Таким образом, были получены плазмиды, кодирующие полноразмерную копию белка ORF3 в виде слитного с ß-галактозидазой E.coli полипептида. Наличие вставки и рамки считывания слитного белка подтверждали секвенированием. Белковый состав лизатов клонов рекомбинанчного шта лма-продуцента E.coli PLT^O исследовали методами электрофореза в SDS-полиакриламидном геле и вестерн-блоттинга с пулом образцов сывороток крови, содержащих IgG к ВГЕ (рис. 2). В качестве положительного контрольного образца использовали ранее полученный [3] рекомбинантный белок, содержащий С-концевой фрагмент белка ORF3 ВГЕ 1 генотипа (штамм Бирма), в качестве контроля специфичности реакции — лизат биомассы штамма E.coli PLT90, трансформированного векторной плаз-мидой без вставки вирусоспецифической ДНК. Несмотря на специфическое
взаимодействие с положительными сыворотками в реакции вестерн-блот-тинга, в лизате биомассы полученного штамма-продуцента рекомбинантный антиген присутствовал в недостаточном для препаративного выделения количестве.
Для увеличения продукции рекомбинантных белков в бактериальных системах экспрессии в настоящее время широко применяется метод оптимизации коцонов, в котором используется подход синонимичных (без изменения кодируемой аминокислоты) замен соответствующих триплетов [8]. С целью повышения уровня синтеза слитного белка в клонированном фрагменте гена orf3 была проведена замена 51 триплета нуклеотидов на более часто встречающиеся в бактериях Е. coli синонимичные кодоны. Фрагмент ДНК с оптимизированными кодонами orßs, синтезированный в Институте биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова, переклонировали в экспрессирующий вектор pEL5a по схеме, аналогичной примененной для клонирования фрагмента гена orf3 дикого штамма вируса. Наличие вставки и рамки считывания слитного белка было подтверждено секвенированием.
Рекомбинантные клоны E.coli, полученные после проведения оптимизации кодонов, были вновь протестированы на способность синтезировать целевой белок. На рис. 2 представлены результаты электрофопетического анали за белкового состава лизатов биомасс рекомбинантных штаммов E.coli до и после оптимизации кодонов и результаты исследования методом вестерн-блотгинга взаимодействия рекомбинантного белка в составе лизатов с пулом сывороток больных ГЕ.
Степень очистки рекомбинантного антигена ORF3 и ß-гатктозидазы E.coli контролировалась на отдельных стадиях процесса выделения с помощью электрофореза в 10% SDS-полиакриламидном геле. Исследование фракций
белка после хроматографи-ческой очистки подтвердило отделение рекомбинантных полипептидов от основной массы примесных белков (рис. ЗА). Тестирование антигенной активности полученных фракций белка методом ИФА показало снижение оптической плотности в лунках с иммобилизованным рекомбинантным белком ORF3 в реакциях с пулом положительных по ВГЕ сывороток и рост неспецифическою сигнала с пулом отрицательных (донорских) сывороток в 11 — 13 фракциях (рис. ЗВ). Для дальнейшей работы использовали лучшие по показателям двух методов фракции.
Молекулярная масса полученного рекомбинантного белка, определенная по ре-
А В
12345 12345
Рис. 2. Электрофорез в 10% вОв-полиакриламидном геле (А) и вестерн-блоттинг с пулом сывороток крови больных ГЕ (В).
1,2 — лизаты культур клонов Е.соН РОР2136, экспресси-рующих рекомбинантный полипептил СЖРЗ после (1) и до (2) оптимизации кодонов; 3 — ранее полученный рекомбинантный полипептид (ЖРЗ ВГЕ штамма Бирма (92 — 123 а.о.); 4 — лизат клеток РОР2136, трансформированных плазмиюй рЕХ1 без вставки; 5 — маркеры молекулярных масс (193, 12, 64, 30, 26, 12 6,5
А
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
оп4 2
1,81,61,4
1,2 1
0,80,60,40,2 0
га
к+
9 11 13 № фракции
14
15
16
17
Исследование рекомбинантного антигена СЖЕЗ ВГЕ 1 генотипа методом ИФА
Рис. 3. Результаты тестирования методами электрофореза в ВЙв-полиакриламидном геле (А) и иммуноферментного анализа (В) фракций рекомбинантного белка ОКРЗ ВГЕ 1 генотипа после хро-матографической очистки.
К+ пул сывороток крови больных ГЕ; К- пул сывороток крови здоровых доноров.
зультатам электрофоретического профиля лизатов штамма-продуцента и препаратов выделяемого из них целевого продукта, составила 128,5 кДа, что соответствует расчетной величине. Продуктивность штамма составила не менее 500 мкг рекомбинантного белка на 1 мл клеточной суспензии при плотности культуры 5х108 кл/мл, степень очистки белка по данным электрофореза — 95%.
Для оценки антигенной специфичности полученного рекомбинантного бетка (ЖРЗ ВГЕ 1 генотипа были сформированы контрольные панели образцов сывороток крови, протестированных с помощью коммерческих
Серологические маркеры инфекционной патологии печени в обследуемых образцах сывороток Количество исследованных образцов Средняя величина оптической платности при >.=^50 нм, •ЭЛ,,« (М + Ш)
к ВГЕ 50 0,334±0,02
ДО к В ГД 15 0,030+0,003
НВяАь ДО к НВсАе 18 0,027±0,001
ДО к ВГС 15 0,027+0,002
ДО к ВИЧ-1 20 0,068+0,004
ДО к ВЭБ 15 0,052+0,004
ДО к ЦМВ 15 0,072±0,006
тест-систем на содержание серологических маркеров инфицирования вирусами гепатитов А, В, С, Е, ВЭБ, ВИЧ '/2 и ЦМВ. Средние значения оптической плотности в обследованных методом ИФА группах образцов при использовании в качестве антигена рекомбинантного белка ОЯРЗ, иммобилизованного в лунках полистироловых планшетов, представлены в табл.
84% обследованных образцов сывороток крови, по результатам предварительного тестирования содержащих к ВГЕ, положительно прореагировали с полученным рекомбинантным белком (ЖРЗ. Относительно невысокую оптическую плотность (от 0,210 до 0,763 о.е./мл) можно объяснять тем, что белок ОИРЗ индуцирует преимущественно образование ^М и ранних а отбор образцов опытной группы проводился на тест-системах, содержащих в составе антигенной основы белок ОЯБ2 ВГЕ и предназначенных для выявления ^О [18]. Исследование образцов от здоровых доноров (п=120) и групп сравнения не выявило ложноположительных результатов, что свидетельствует о строгой специфичности полученного рекомбинантного антигена и отсутствии перекрестной реактивности с маркерами инфицирования возбудителями других вирусных гепатитов и инфекционной патологии печени иной этиологии (ЦМВ, ВЭБ, ВИЧ). При использовании в качестве антигена препарата Р-галактозидазы, выделенной из биомассы клеток штамма Е.соН РШЮ, трансформированных плазмидой рЕЬ5а без вставки вирусоспецифической ДНК, положительных реакций с образцами сывороток опытной и контрольных групп не выявлено.
ОБСУЖДЕНИЕ
Рекомбинантные антигены, на основе которых созданы имеющиеся к настоящему времени коммерческие тест-системы отечественного и зарубежного производства, содержат фрагменты белка ОИРЗ ВГЕ различной длины. Учитывая короткий размер и уникальную первичную структуру (отсутствие заметных гомологий с доступными в базах данных аминокислотными последовательностями) белка ОЙРЗ и наличие трех иммунореактивных доменов в его составе, в данной работе была поставлена и решена задача получения рекомбинантного аналога полноразмерного белка ОИРЗ ВГЕ 1 генотипа. По результатам анализа профиля гидропатичности гидрофобный участок ОИРЗ, а именно его М-концевая область, должен содержать основную часть антигенных детерминант, однако прогноз, сделанный с помощью данного метода, не совсем совпадает с результатами экспериментов по картированию эпитопов, согласно которым именно в С-концевой области данного белка локализован основной иммунодоминантный домен [21]. Несоответствие литературных данных и результатов биоинформационного анализа служит дополнительным аргументом в пользу важности и необходимости получения полноразмерного рекомбинантного антигена ОИРЗ. Предполагаемая некоторыми авторами возможность конформационной «маскировки» эпитопов в составе рекомби-нантных аналогов полноразмерного белка ОИРЗ [12] в данном случае не должна иметь места, поскольку применяемая процедура очистки белка из нерастворимых телец-включений содержит этапы денатурации. В первичной структуре полученного рекомбинантного белка выявлена одна аминокислотная замена, затрагивающая И-концевой иммунодоминантный домен, что может приводить к штаммоспецифичной вариабельности антигенных свойств ВГЕ и свидетельствовать об уникальности антигена, полученного на основе природного изолята вируса. Поскольку в научной литературе имеются сообщения о перекрестной иммунореактивности при выявлении антител к ВГЕ и
некоторым герпесвирусам (ВЭБ, ЦМВ), осложняющей интерпретацию результатов серодиагностики ГЕ [10], проведено сравнение аминокислотных последовательностей полученного белка и белков герпесвирусов, показавшее отсутствие протяженных гомологичных участков. Методами иммуноблоттин-га и ИФА в реакциях с сыворотками крови больных ГЕ и групп сравнения, включающими образцы с маркерами инфицирования ЦМВ и ВЭБ, показана антигенная специфичность полученного рекомбинантного полипептида. Однако для более надежного обоснования возможности применения в диагностических тестах требуется дополнительное расширенное и более детальное исследование его иммунореактивных свойств.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (Соглашение N9 14.613.21.0057от 28.07.2016, уникальный идентификатор проекта RFMEFI61316X0057).
ЛИТЕРАТУРА
1. Алаторцев В.Е., Алаторцева Г.И. Патент РФ, 1992, № 2071501 на изобретение «Вектор pEL5a, предназначенный для экспрессии чужеродной ДНК».
2. Алаторцев В.Е., Алаторцева Г.И. Патент РФ, 1992, № 2043409 на изобретение «Штамм бактерий Escherichia coli, используемый для получения рекомбинантных белков».
3. Алаторцева Г.И. Получение рекомбинантных белков, содержащих антигенные детерминанты вируса гепатита Е, и создание на их основе диагностических тест-систем: Автореф. дисс. канд. биол. наук. М., 2000.
4. Алаторцева Г.И., Сидоров А.В., Нестеренко JI.H. и др. Получение рекомбинантного аналога гликопротеина е вируса Varicella zoster: клонирование, экспрессия и исследование антигенных свойств. Эпидемиология и вакдинопрофилактика. 2016, 15, 1 (86): 77-85.
5. Гловер Д. Новое в клонировании ДНК. Методы. М., 1989.
6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984.
7. Солонин С.А., Мальцева Н.С., Троценко О.Е. и др. Циркуляция вируса гепатита Е на территории Хабаровского края. Дальневосточный журнал инфекционной патологии. 2010, 16: 31-36.
8. Claudia P., Ravasi М.Е. et al. Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives. Front. Microbiol. 2014, 5: 2-8.
9. Graff J., Torian U. et al. A bicistronic subgenomic mRNA encodes both the ORF2 and ORF3 proteins of hepatitis E virus. J. Virol. 2006, 80: 5919-5926.
10. Hyams C., Mabayoje D.A., Copping R. et al. Serological cross reactivity to CMVand EBV causes problems in the diagnosis of acute hepatitis E virus infection. J. Med. Virol. 2014, 86 (3): 478-483.
11. Khudyakov Y.E., Khudyakova N.S., Fields H.A. et al. Epitope mapping in proteins of hepatitis E virus. Virology. 1993, 194 (1): 89-96.
12. Khudyakov Y.E., Khudyakova N.S., Jue D.L. et al. Comparative characterization of antigenic epitopes in the immunodominant region of the protein encoded by open reading frame 3 in burmese and mexican strains of hepatitis E virus. J. Gen. Virol. 1994, 75 (3): 641-646.
13. Koonin E.V., Gorbalenya A.E., Purdy M.A. et al. Computer-assisted assignment of functional domains in the nonstructural polyprotein of hepatitis E virus: delineation of an additional group of positive-strand RNA plant and animal viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992, 89 (17): 8259-8263.
14. Kumar S.,TamuraK., Nei M. MEGA3: Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Briefings Bioinformatics. 2004, 5: 150-163.
15. Kyte J., Doolittle R.F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol. 1983,157 (1): 105-132.
16. Ma H., SongX., LiZ. etal. Varying abilities ofrecombinant polypeptides from different regions of hepatitis E virus ORF2 and ORF3 to detect anti-HEV immunoglobulin M. J. Med. Virol. 2009, 81 (6):1052-1061.
17. Nair V.P., Anang S., Subramani C. et al. Endoplastic reticulum stress induced synthesis of a
novel viral factor mediates efficient replication of genotype-1 hepatitis E. PLoS Pathol. 2016, 12 (4): el005521.
18. Obriadina A., Meng J.H., Ulanova T. et al. A new enzyme immunoassay for the detection of antibody to hepatitis E virus. J. Gastroenterol Hepatol. 2002, Suppl 3: 360-364.
19. Resenchuk S.M., Blinov V.M. Alignment service: creation and processing of alignments of sequences of unlimited length. Comput. Appl. Biosci. (CABIOS). 1995, 11 (1): 7-11.
20.Towbin H., StaehlinT., Gordon Y. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979, 76 (9): 4350-4359.
21. Yarbough P.O., Tarn A.W., Fry K.E. et al. Hepatitis E virus: identification of type-common epitopes. J. Virol. 1991, 65 (11): 5790-5797.
22. Yonglin Yang, Shaoli Lin, Yuchen Nan et al. A linear surface epitope in a proline-rich region of ORF3 product of genotype 1 hepatitis E virus. Viruses. 2016, Aug 18;8 (8): pii: E227.
23. Zhou Y., Zhao C., Tian Y. et al. Characteristics and functions of HEV proteins. Adv. Exp. Med. Biol. 2016, 948:17-38.
Поступила 05.07.17
Контактная информация: Алаторцева Галина Ивановна, к.б.н.,
105064, Москва, М. Казенный пер., 5а, р.т. (495)674-77-95
© коллектив авторов, 2017
Г.И.Алаторцева', А.В.Сидоров', Л.Н.Нестеренко', Л.Н.Лухверчик1, В.В.Доценко', И.И.Амиантова', В.Ю.Кабаргина', А.В.Милованова', Д.С.Воробьев', Ю.И.Аммур', В.М.Блинов', А.З.Нурматов3, З.Ш.Нурматов3, Д.А.Байызбекова3, О.Т.Касымов3, К.К.Кюрегян'-2, М.И.Михайлов'-2, С.В.Жаворонок4, В.В.Зверев1
ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА КАПСИДНОГО БЕЛКА ВИРУСА ГЕПАТИТА Е 1 ГЕНОТИПА: КЛОНИРОВАНИЕ, ЭКСПРЕССИЯ, ОЧИСТКА, ОЦЕНКА АНТИГЕННЫХ СВОЙСТВ
'НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования, Москва, Россия; 3НПО «Профилактическая медицина», Бишкек, Кыргызская Республика; 4Белорусский государственный медицинский университет, Минск, Беларусь
Цель. Разработка рекомбинантного аналога капсидного белка вируса гепатита Е (ВГЕ) 1 генотипа и исследование его антигенных свойств. Материалы и методы. Штаммы Escherichia coli, плазмидные векторы, серологический и клинический материал, имму-ноферментные тест-системы. Молекулярно-биологические, биоинформационные, биотехнологические, биохимические и серологические методы. Результаты. С использованием рекомбинантной плазмиды, содержащей ДНК-копию субгеномной бици-стронной РНК ВГЕ 1 генотипа, получен штамм E.coli — продуцент рекомбинантного антигена ORF2, содержащего С-концевой фрагмент капсидного белка ВГЕ в виде слитного с Р-галактозидазой E.coli полипептида. Рекомбинантный белок выделен из телец включений биомассы штамма-продуцента и очищен методом эксклюзионной хроматографии. С помощью вестерн-блотгинга показано взаимодействие полученного полипептида с пулом сывороток крови больных гепатитом Е (ГЕ). Антигенная специфичность белка подтверждена методом иммуноферментного анализа с сыворотками крови больных ГЕ и реконвалесцентов и групп сравнения: здоровых доноров, больных гепатитами А, В, С, ВИЧ-инфицированных, больных инфекционным мононуклеозом и цитомега-ловирусной инфекцией. Заключение. Разработан рекомбинантный антиген ORF2 ВГЕ 1 генотипа и экспериментально показана возможность его применения в диагностических тестах.
Журн. микробиол., 2017, № 6, С. 72—80 72
