CC BY
30
УДК 612.39:579.864:579.67 DOI 10.52231/2225-4269_2021_2_107
Получение пробиотического
консорциума на основе выделенных из
>к
коровьего молока штаммов
Веснина Анна Дмитриевна, аспирант, лаборант-исследователь e-mail: koledockop1@mail.ru
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кемеровский государственный университет»
Фотина Наталья Вячеславовна, магистрант, лаборант-исследователь e-mail: fotina.natashenka@mail.ru
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кемеровский государственный университет»
Просеков Александр Юрьевич, д.т.н., профессор, заведующий кафедрой e-mail: aprosekov@rambler.ru
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кемеровский государственный университет»
Козлова Оксана Васильевна, д.т.н., доцент e-mail: ms.okvk@mail.ru
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кемеровский государственный университет»
Дышлюк Любовь Сергеевна, к.б.н., доцент e-mail: soldatovals1984@mail.ru
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кемеровский государственный университет»
Ключевые слова: микрофлора кишечника, молочнокислые бактерии, проби-отик, биосовместимость, антагонистическая активность, антибиотикоустойчивость, идентификация.
Аннотация. Для профилактики и нормализации работы микробиоты, дисбаланс которой приводит к нарушению здорового состояния организма, перспективно употребление пробиотиков, следовательно, и их разработка. Данная работа направлена на создание пробиотического консорциума. В ходе исследования выделены штаммы L. acidophilus, L. plantarum и L. casei, на основании которых собраны различные консорциумы. Результаты показали, что консорциум, состоящий из L. plantarum, L. casei, L. acidophilus в соотношении 3:1:1, обладал максимальным
* Работа выполнена в рамках гранта Президента РФ при государственной поддержке ведущих научных школ (НШ-
2694.2020.4).
накоплением клеточной биомассы за установленное время, проявлял антибиотическую активность к ряду патогенных и условно-патогенных штаммов, устойчивость к действию антибиотиков и к неблагоприятным условиям желудочно-кишечного тракта. Для использования консорциума в качестве пробиотика и применения его в пищевой промышленности в дальнейшем планируется изучение природы и активности его клеточных метаболитов, изучение его технологических свойств.
Введение
Микробиота желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) - это совокупность непатогенных микроорганизмов, населяющих ЖКТ [1]. Факторы окружающей среды (неправильное питание, употребление антибиотиков, вредные привычки и т.п.) являются основными причинами изменения ее нормального функционирования [2], приводящими к развитию ряда хронических заболеваний (ожирению, атеросклерозу, метаболическому синдрому, сердечно-сосудистым заболеваниям и т.д.), нарушению гомеостаза и нормальной работы иммунитета организма [3]. По данным научных исследований пробиотики играют важную роль в нормализации работы микробиоты ЖКТ и, как следствие, в поддержании здорового состояния организма [4].
Пробиотики - это живые микроорганизмы (бактерии и дрожжи), употребление которых оказывает положительное воздействие на здоровье организма [1; 2]. Чаще всего в качестве пробиотиков используют бактерии рода Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp., а также дрожжи рода Saccharomyces spp. Богатыми источниками пробиотиков являются молоко и кисломолочные продукты [5]. Выделяют две основные функции пробиотиков: поддержание жизнеспособности штаммов нормальной микрофлоры за счет продуцирования ряда биологически активных веществ (БАВ) [6]; подавление активности патогенной и условно-патогенной кишечной микрофлоры за счет создания конкуренции за адгезию на эпителии ЖКТ и продуцирования антибиотических БАВ [7]. Клинический эффект от употребления пробиотиков зависит от вида штаммов, их комбинации и дозировки и т.п. [2; 8]. Таким образом, выделение и идентификация штаммов, подбор консорциума на их основе и изучение его пробиотических свойств является перспективным направлением в профилактическом и лечебном питании.
Цель данной работы заключается в получении пробиотического консорциума из сырого коровьего молока с целью его дальнейшего применения в пищевой промышленности.
Материалы и методы
Исследования проводились на базе Лаборатории биотестирования природных нутрицевтиков НИУ ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный университет» (Россия). Сырьем для выделения бактерий являлось сырое коровье молоко («Крестьянское хозяйство А.П. Волкова», Россия). Объектами исследования стали штаммы молочнокислых бактерий, выделенные из данного сырья, и консорциумы на их основе. Основной алгоритм реализации исследовательской работы включал в себя следующие стадии:
1. Выделение чистых культур из сырого молока и их идентификация. Выделение штаммов осуществляли по методике, описанной в работе I.A. Kassaa [10]. Для идентификации использовали стандартные и общепринятые методы микробиологического анализа [11]. Вид микроорганизмов определяли согласно ГОСТ
10444.11-89 [12], а также по показателям, представленным в Определителе Бер-джи (Берге) [13]. Идентификацию рода и определение некоторых физиолого-био-логических признаков реализовали с помощью микробиологического анализатора Vitek 2 Compact («BioMerieux», Франция).
2. Анализ биологических свойств выделенных из молока штаммов in vitro осуществляли в соответствии с МУ 2.3.2.2789-10 [14].
2.1 Определение антибиотикорезистентности к ряду антибиотиков (стрептомицину, хлорамфениколу, тетрациклину, ванкомицину, гентамицину, эритромицину, цефалотину и доксициклину). Использовали диско-диффузионный метод, описанный в работе Y. Yang [15].
2.2 Определение антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным штаммам. Активность определяли диффузионным методом в лунках агара, описанным в работе M. Pazhoohan [16], к Escherichia coli B-6645, Bacillus subtilis B-110, Candida albicans Y-3108, Klebsiella pneumonia K1 5054, Pseudomonas aeruginosa B-6643.
2.3 Определение устойчивость к условиям ЖКТ. Все методики по определению устойчивости к желчи (0,5, 20, 40 %), фенолу (0,4 %) и критическим значениям кислотности (рН = 2,0; 3,0; 9,2.) среды описаны в работе С.В. Китаевской [17].
3. Подбор оптимального соотношения микроорганизмов в консорциуме и подбор питательной среды для максимального накопления биомассы. Проверку биосовместимости выделенных штаммов осуществляли капельным способом по методике, описанной в работе Г.С. Волковой [18]. Для выбора оптимального консорциума составлены 7 образцов консорциумов различных по соотношению L. plantarum, L. casei, и L. casei (табл. 1). Методика представлена в работе А.И. Нетрусова [19].
Таблица 1 - Перечень образцов консорциумов, составленных из штаммов, выделенных из сырого коровьего молока
Соотношение штаммов
№ Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus
plantarum casei acidophilus
1 1 1 1
2 1 2 1
3 2 1 1
4 1 1 2
5 1 3 1
6 1 1 3
7 3 1 1
Для выбранного консорциума подобрана питательная среда для накопления наибольшего количества биомассы. В работе рассматривались следующие питательные среды (табл. 2): для выращивания лактобактерий - среда MRS (ФБУН ГНЦ ПМБ, Россия), среда Рогоза (HiMedia Laboratories, Индия), Лактобакагар (ФБУН ГНЦ ПМБ, Россия) [12] и среда, разработанная авторами.
Таблица 2 - Состав используемых в исследовании питательных сред
Компонентный Питательные среды
состав, г/л MRS Среда Рогоза Лактобак-агар Авторская среда
Ферментативный пептон - 10,000 - 5,000
Компонентный Питательные среды
состав, г/л MRS Среда Рогоза Лактобак-агар Авторская среда
Гидролизат казеина - 5,000 - 4,000
Протеозопептон 10,000 - - -
Панкреатический гидролизат рыбной муки - - 20,00 12,000
Экстракт пекарных дрожжей 5,000 10,000 5,00 8,000
Твин-80 1,000 мл 1,000 1,000 мл 1,000
Мясной экстракт 10,000 10,000 5,000 11,500
Глюкоза 20,000 20,000 20,000 20,000
Калий фосфорнокислый однозаме-щенный - 6,000 2,00 4,00
Натрий фосфорнокислый двузаме-щенный 2,000 - - -
Натрий уксуснокислый 3-водный 5,000 15,000 5,000 10,000
Натрий лимоннокислый - 2,800 - -
Аммоний лимоннокислый однозаме-щенный 2,000 2,000 2,000 2,500
Магний сернокислый 7-водный 0,100 0,574 0,100 0,825
Марганец хлористый 4-водный 0,050 - 0,050 -
Сульфат марганца 4-водный - - 0,120 0,950
Сернокислое железо - 0,034 - -
рН среды 6,3 5,5 5,5 5,5
4. Анализ биологических свойств составленного консорциума осуществляли по ранее описанным методикам, представленным в пунктах 2.1-2.3. Дополнительно изучали наличие ингибирующего действия консорциума на ряд представителей нормофлоры кишечника в условиях in vitro по методу натекания бляшек, описанному в МУ 2.3.2.2789-10 [14].
5. Сохранение консорциума. Биомассу консорциума сохраняли по методике, описанной в работе В.А. Несчисляева [20].
Результаты и обсуждение
1. Выделение и идентификация штаммов из сырого коровьего молока.
В ходе работы выделены три колонии, анализ морфолого-цитологических и культуральных признаков которых установил, что данные штаммы относятся к роду Lactobacillus spp. Определение вида с помощью микробиологического анализатора Vitek 2 Compact позволило с 90%-ной достоверностью установить, что три выделенные колонии относятся к Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei и Lactobacillus acidophilus.
2. Анализ биологических свойств выделенных из молока штаммов in vitro. 2.1 Оценка устойчивости выделенных штаммов к действию антибиотиков. Идентифицированные штаммы молочнокислых бактерий анализировали на
наличие антибиотикорезистентности. Результаты исследования представлены в таблице 3.
Таблица 3 - Результаты антибиотикорезистентности выделенных и идентифицированных чистых культур из сырого коровьего молока
№ Название антибио- Концентрация, Lactobacillus plantarum Lactobacillus casei Lactobacillus acidophilus
тика мкг Размер зоны задержки роста, мм
1 Стрептомицин 10,00 7,4±0,04 7,1±0,03 7,6±0,03
2 Хлорам-феникол 30,00 32,5±1,61 34,0±1,81 10,5±0,06
3 Тетрациклин 30,00 17,9±1,08 29,8±1,59 19,8±1,28
4 Ванкоми-цин 30,00 7,1±0,02 7,1±0,02 18,6±1,26
5 Гентами-цин 10,00 8,3±0,02 11,6±0,08 9,6±0,05
6 Эритромицин 15,00 30,5±1,54 34,1±1,84 25,8±1,29
7 Цефало-тин 30,00 20,3±1,11 30,5±1,58 22,3±1,18
8 Доксици-клин 30,00 26,4±1,30 42,7±2,39 23,9±1,26
Примечание: полученные размеры зон задержки роста сравнивали с установленными значениями, приведенными в МУ 2.3.2.2789-10 [14].
Результаты изучения антибиотических свойств показали, что:
1) Штамм Lactobacillus plantarum характеризовался устойчивостью к трем антибиотикам (стрептомицину, ванкомицину и гентамицину) и промежуточной устойчивостью к действию тетрациклина, обладал чувствительностью по отношению к остальным антибиотикам.
2) Штамм Lactobacillus acidophilus характеризовался устойчивостью к действию трех антибиотиков (стрептомицину, ванкомицину и гентамицину), по отношению к остальным антибиотикам является чувствительным.
3) Штамм Lactobacillus casei обладал устойчивостью к действию двух антибиотиков (стрептомицину и гентамицину), промежуточной устойчивостью к действию трех антибиотиков (хлорамфениколу, тетрациклину и ванкомицину), а по отношению к остальным антибиотикам являлся чувствительным.
2.2 Оценка антимикробной активности штаммов к ряду патогенных и условно-
патогенных тест-культур.
В таблице 4 представлены результаты исследования антагонистической активности трех выделенных штаммов к тест-культурам патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.
Таблица 4 - Результаты антимикробной активности выделенных и идентифицированных чистых культур
Диаметр зон подавления роста тест-культур, мм Lactobacillus plantarum Lactobacillus casei Lactobacillus acidophilus
Escherichia coli B-6645 27,9±1,35 27,4±1,46 27,1±1,21
Bacillus subtilis B-110 23,1±1,11 23,6±1,16 19,5±0,83
Candida albicans Y-3108 28,2±1,51 28,5±1,62 26,4±1,38
Klebsiella pneumonia K1 5054 25,6±1,30 20,1±1,03 13,6±0,42
Pseudomonas aeruginosa B-6643 27,3±1,23 22,9±1,08 24,1±1,30
Примечание: полученные значения зон ингибирования сравнивали с установленными значениями, приведенными в МУ 2.3.2.2789-10 [14].
Результаты изучения антимикробной активности показали, что L. plantarum, L. casei обладал антагонистической активностью по отношению ко всем рассматриваемым тест-культурам, используемым в исследовании, а L. acidophilus подавлял жизнедеятельность только Escherichia coli B-6645, Candida albicans Y-3108 и Klebsiella pneumonia K1 5054.
2.3 Анализ устойчивости выделенных штаммов к условиям ЖКТ. Результаты исследования по определению устойчивости штаммов L. plantarum, L. casei и L. acidophilus, выделенных из сырого коровьего молока, к действию желчи представлены в таблице 5, к действию фенола - в таблице 6, к действию среды с различным значением рН - в таблице 7.
Таблица 5 - Устойчивость штаммов к действию желчи
Концентрации желчи, % от объема среды Выросшие колонии
Lactobacillus plantarum Lactobacillus casei Lactobacillus acidophilus
Степень выживаемости клеток, %
0,5 75,0±0,1 79,0±0,3 83,0±0,2
20,0 45,0±0,2 52,0±0,1 56,0±0,3
40,0 41,0±0,3 49,0±0,2 51,0±0,1
Таблица 6 - Устойчивость штаммов к действию фенолов
Выросшие колонии
Фенол, % Lactobacillus plantarum Lactobacillus casei Lactobacillus acidophilus
Степень выживаемости клеток, %
0,2 80,0±0,3 75,0±0,2 82,0±0,4
Выросшие колонии
Lactobacillus plantarum Lactobacillus casei Lactobacillus acidophilus
0,4
73,0±0,3 | 69,0±0,1 | 77,0±0,3_I
Таблица 7 - Устойчивость штаммов при различных значениях рН
Выросшие колонии
рН Lactobacillus plantarum Lactobacillus casei Lactobacillus acidophilus
Степень выживаемости клеток, %
9,2 93,0±0,1 96,0±0,1 98,0±0,2
3,0 50,0±0,5 51,0±0,1 59,0±0,1
2,0 24,0±0,2 23,0±0,4 28,0±0,2
Все выделенные штаммы обладали устойчивостью к воздействию желчи, фенолов и среде с различным значением рН. Полученные данные свидетельствовали о том, что штаммы L. plantarum, L. casei и L. acidophilus при попадании в организм человека способны выживать в условиях ЖКТ. Сравнивая значения устойчивости между штаммами к различным факторам ЖКТ видно, что наибольшей устойчивостью обладал штамм L. acidophilus.
Наличие устойчивости выделенных и идентифицированных штаммов к действию различных антибиотиков, к неблагоприятным условиям ЖКТ, а также наличие антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам свидетельствует о возможности использования данных лактобактерий в качестве пробиотических культур.
3. Подбор оптимального соотношения микроорганизмов в консорциуме и подбор питательной среды для максимального накопления биомассы.
Результаты определения биосовместимости выделенных и идентифицированных штаммов представлены в таблице 8.
Таблица 8 - Наличие биосовместимости выделенных штаммов молочнокислых бактерий
Штамм Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus
plantarum casei acidophilus
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus casei
Lactobacillus acidophilus
Анализ данных показал, что выделенные культуры молочнокислых бактерий имели различную биосовместимость, так L. acidophilus совместим со всеми исследуемыми штаммами, а L. plantarum и L. casei не совместимы друг с другом.
Результаты накопления клеточной биомассы для семи составленных консорциумов представлены в таблице 9.
Таблица 9 - Прирост клеточной биомассы при культивировании анализируемых консорциумов
Количество лактобактерий, g КОЕ/см3
№ Продолжительность культивирования, ч
0 3 6 9 12
1 5,38±0,31 6,40±0,35 8,83±0,26 8,98±0,25 6,93±0,36
2 5,94±0,31 6,81±0,28 9,78±0,19 9,94±0,29 7,99±0,29
3 5,76±0,25 6,64±0,26 9,56±0,37 9,76±0,27 7,36±0,29
4 5,71±0,27 6,52±0,25 9,38±0,33 9,71±0,32 7,20±0,23
5 5,89±0,29 6,75±0,25 9,71±0,31 9,89±0,35 7,65±0,35
6 5,95±0,30 6,97±0,32 9,80±0,24 9,95±0,34 8,09±0,20
7 6,02±0,32 6,99±0,29 9,84±0,32 10,04±0,33 8,14±0,30
Результаты по накоплению клеточной биомассы лактобактерий семи консорциумов показали, что максимальный прирост для всех образцов наблюдался в момент завершения стационарной фазы роста (а именно при 9 ч культивирования). Наилучшие результаты по количеству клеточной биомассы наблюдались у исследуемого образца под номером 7, состоящего из L. plantarum, L. casei, L. acidophilus в соотношении 3:1:1 соответственно.
Для выбранного консорциума (образца №7) подобрана питательная среда для максимального накопления биомассы в течение 9 часов культивирования. Результаты прироста биомассы консорциума на различных питательных средах представлены в таблице 10.
Таблица 10 - Прирост биомассы образца №7 при культивировании на различных питательных средах в течение 9 ч
Количество клеток Питательные среды
MRS Рогоза Лактобакагар Разработанная авторами
1дКОЕ/см3 11,74±0,32 11,97±0,23 12,34±0,35 13,52±0,30
Результаты исследования показали, что при использовании авторской питательной среды наблюдалось наибольшее накопление клеток консорциума, что свидетельствовало о целесообразности дальнейшего ее применения в будущих исследованиях и при сохранении консорциума.
4. Анализ биологических свойств составленного консорциума. 4.1 Определение антибиотикорезистентности и антагонистической активности консорциума.
Результаты определения антибиотикорезистентности и наличия антагонистической активности консорциума представлены в таблицах 11 и 12.
Таблица 11 - Результаты антибиотикорезистентности разработанного пробиотического консорциума
№ Название антибиотика Концентрация, мг Размер зоны задержки роста пробиотического консорциума, мм
1 Стрептомицин 10,0 7,0±0,02
2 Хлорамфе-никол 30,0 15,4±1,13
3 Тетрациклин 30,0 15,9±1,13
№ Название антибиотика Концентрация, мг Размер зоны задержки роста пробиотического консорциума, мм
4 Ванкоми-цин 30,0 7,0±0,01
5 Гентамицин 10,0 8,0±0,03
6 Эритромицин 15,0 19,9±1,22
7 Цефалотин 30,0 20,1±1,20
8 Доксици-клин 30,0 24,5±1,26
Результаты изучения антибиотических свойств разработанного консорциума показали, что в отношении трех антибиотиков (стрептомицина, ванкомицина и гентамицина) консорциум проявлял устойчивость, по отношению к хлорамфени-колу, тетрациклину, эритромицину и цефалотину проявлял промежуточную устойчивость, а по отношению к доксициклину - был чувствителен к его действию. По отношению к большей части антибиотиков консорциум проявлял большую резистентность, чем отдельные штаммы молочнокислых бактерий.
Таблица 12 - Результаты антагонистической активности разработанного пробиотического консорциума
Тест-культуры Диаметр зон подавления роста тест-культур, мм
Escherichia coli B-6645 32,7±1,70
Bacillus subtilis B-110 30,1±1,53
Candida albicans Y-3108 31,9±1,70
Klebsiella pneumonia K1 5054 28,4±1,46
Pseudomonas aeruginosa B-6643 27,9±1,49
Полученные результаты свидетельствовали о том, что консорциум обладал антимикробным действием по отношению к исследуемым тест-культурам патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.
4.2 Определение устойчивости к желчи, фенолу и значениям рН разработанного консорциума.
Результаты определения устойчивости консорциума к желчи, фенолу и значениям рН представлены в таблице 13.
Таблица 13 - Степень выживаемости клеток консорциума в стрессовых условиях, %
Концентрации желчи, % от объема среды
0,5 20,0 40,0
78,0±0,4 53,0±0,5 45,0±0,2
Фенол, %
0,2 0,4
79,0±0,2 72,0±0,3
рН
9,2 3,0 2,0
97,0±0,5 54,0±0,1 25,0±0,5
Результаты исследований показали, что созданный консорциум лактобактерий обладал устойчивостью к неблагоприятным условиям ЖКТ.
4.3 Оценка ингибирующей активности консорциума по отношению к представителям нормофлоры кишечника in vitro.
Результаты исследования ингибирующей активности консорциума на ряд представителей нормофлоры кишечника представлены в таблице 14.
Таблица 14 - Результаты изучения способности консорциума ингибировать жизнедеятельность представителей нормофлоры кишечника
Представители нормофлоры кишечника Диаметр зон подавления роста тест-культур, мм
Lactobacillus plantarum B-11007 -
Lactobacillus acidophilus B-9012 -
Lactobacillus acidophilus B-2585 -
Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus B-5788 -
Lactobacillus casei B-7951 -
Enterococcus faecalis B-4053 -
Enterococcus faecium B-4054 -
Результаты исследования показали, что консорциум не подавлял рост представителей нормальной микрофлоры кишечника.
5. Хранение разработанного консорциума.
Для сохранения консорциум выращивали на жидкой питательной среде, разработанной авторами, в течение 9 ч при температуре 37 °C в анаэробных условиях. После окончания культивирования отделяли биомассу от культуральной жидкости. К биомассе добавляли защитную сахарозо-желатозо-молочную среду [20]. Полученную суспензию разливали по стерильным пенициллиновым флаконам и замораживали, после чего подвергали сублимационному высушиванию.
В рамках работы проведен литературный поиск для выделения аналогичных исследований, то есть исследовались работы, где в качестве БАД и/или закваски применяли консорциумы, содержащие L. acidophilus, L. plantarum и L. casei в различных соотношениях. Так, имеется патент РФ № 2376366, в котором представлен консорциум, состоящий из L. acidophilus, L. acidophilus, L. plantarum, L. plantarum, L. casei и L. casei в соотношении 1:1:1:1:4:4 соответственно [21], патент РФ № 2491079 [22], в котором использовали консорциум, состоящий из L. plantarum, L. fermentum, L. acidophilus, L. casei, B. bifidum, B. longum, и патент РФ № 2326938 [23], в котором использовали консорциум, состоящий из L. acidophilus, L. plantarum, L. casei в соотношении 2:0,5:0,5 соответственно. Недостатком данных изобретений является невыраженное антагонистическое действие по отношению к ряду пато-
генных и условно-патогенных тест-культур (зона задержки роста составляла менее 20 мм). Найден патент CN № 107043715 [24], в котором описан консорциум, состоящий из L. plantarum, L. acidophilus, L. casei и B. lactis, существенным недостатком данного изобретения является отсутствие данных о наличии антагонизма консорциума к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, устойчивости к ряду антибиотиков и оценки прочих пробиотических свойств. Проведенный обзор позволил получить информацию о том, что используемые авторами штаммы лакто-бактерий перспективны в качестве пробиотиков, и что консорциум, состоящий из L. plantarum, L. casei, L. acidophilus в соотношении 3:1:1 соответственно, ранее не использовался в отечественных и зарубежных исследованиях.
Выводы
В настоящем исследовании разработан консорциум, состоящий из молочнокислых штаммов (L. plantarum, L. casei, L. acidophilus в соотношении 3:1:1), выделенных из сырого коровьего молока. Консорциум проявляет устойчивую антибио-тикорезистентность по отношению к стрептомицину, ванкомицину и гентамицину; антагонистические свойства по отношению к патогенным и условно-патогенным штаммам Escherichia coli B-6645, Bacillus subtilis B-110, Candida albicans Y-3108, Klebsiella pneumonia K1 5054, Pseudomonas aeruginosa B-6643; устойчивость к негативным факторам ЖКТ (желчи, фенолу и среды с различными значениями рН), следовательно, в перспективе его можно использовать в качестве пробиотической добавки для нормализации работы микробиоты ЖКТ. Также был выделен ряд недостатков данной исследовательской работы. А именно отсутствие изучения природы и активности метаболитов, вырабатываемых лактобактериями консорциума, их воздействия на микрофлору ЖКТ; отсутствие молекулярно-генетической идентификации выделенных штаммов, определения трансмиссивных генов антибиотико-резистентности; отсутствие исследования срока годности консорциума, и изучения его технологических свойств для применения при изготовлении функциональных продуктов питания. Представленные недостатки будут рассмотрены в последующих исследовательских работах авторов.
Литература:
1. Role of the gut microbiota in nutrition and health / A.M. Valdes, J.Walter, E. Segal [et al.] // BMJ (Clinical research ed.) - 2018. - № 361. - Р. k2179. DOI: https:// doi.org/10.1136/bmj.k2179.
2. Probiotics and gastrointestinal conditions: An overview of evidence from the Cochrane Collaboration / E.A. Parker, T. Roy, C.R. D'Adamo [et al.] // Nutrition (Burbank, Los Angeles County, Calif.). - 2018. - № 45. - Р. 125-134.e11. DOI: https://doi. org/10.1016/j.nut.2017.06.024.
3. Gomes, A. C. The human gut microbiota: Metabolism and perspective in obesity / A.C. Gomes, C. Hoffmann, J.F. Mota // Gut microbes. - 2018. - № 9 (4). - Р. 308325. DOI: https://doi.org/10.1080/19490976.2018.1465157.
4. Role of Probiotics in Human Gut Microbiome-Associated Diseases / S.K. Kim, R.B. Guevarra, Y.T. Kim [et al.] // Journal of microbiology and biotechnology. - 2019. -№ 29 (9). - Р. 1335-1340. DOI: https://doi.org/10.4014/jmb.1906.06064.
5. Islam, S.U. Clinical Uses of Probiotics / S.U. Islam // Medicine. - 2016. - № 95 (5). - Р. e2658. DOI: https://doi.org/10.1097/MD.0000000000002658.
6. Meta-analysis: the effect of probiotic administration on antibiotic-associated diarrhea / F. Cremonini, S. Di Caro, E.C. Nista [et al.] // Alimentary pharmacology & therapeutics. - 2002. - № 16 (8). - Р. 1461-1467. DOI: https://doi.org/10.1046/ j.1365-2036.2002.01318.x.
7. Markowiak, P. Effects of Probiotics, Prebiotics, and Synbiotics on Human Health / P. Markowiak, K. Slizewska / Nutrients. - 2017. - № 9 (9). - Р 1021. DOI: https://doi. org/10.3390/nu9091021.
8. Liu, Y. Probiotics in Disease Prevention and Treatment / Y. Liu, D.Q. Tran, J.M. Rhoads // Journal of clinical pharmacology. - 2018. - № 58. - Р.164-179. DOI: https:// doi.org/10.1002/jcph.1121.
9. De Man, J.C. A medium for the cultivation of lactobacilli / J.C. de Man, M. Rogosa, M.E. Sharpe // J Appl Bacteriol. - 1960. - № 23. - P. 130-135.
10. Identification of Vaginal Lactobacilli with Potential Probiotic Properties Isolated from Women in North Lebanon / I.A. Kassaa, M. Hamze, D. Hober [et al. ] // Microbial Ecology. - 2014. - V. 67. - P. 722-734.
11. МУ ВНИИМС 01.86.02.-89 Методические указания по селекции молочнокислых бактерий в состав заквасок и препаратов для мелких сычужных сыров. -Углич: ВНИИМС, 1989. - 87 с.
12. ГОСТ 10444.11-89 Продукты пищевые. Методы определения молочнокислых микроорганизмов. Продукты пищевые, консервы. Методы микробиологического анализа: c6. ГОСТов. - М.: Стандартинформ, 2010.
13. Bergey's manual of systematic bacteriology. Second edition. Volume three. The Firmicutes - Springer Science+Business Media, LLC, 233 Spring Street, New York, NY 10013, USA. - 2009. - 1422 р.
14. Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов: vетодические указания. - М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2011. - 104 с.
15. Antibiotic activity and resistance of lactic acid bacteria and other antagonistic bacteriocin-producing microorganisms / Yang Y., Babich O., Sukhikh S. [et al.] // Foods and Raw Materials. - 2020. - Vol. 8. - № 2. - P. 377-384.
16. Pazhoohan, M. Antimicrobial and antiadhesive effects of Lactobacillus isolates of healthy human gut origin on Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) and Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) / M. Pazhoohan, F. Sadeghi, M. Moghadami // Microbial Pathogenesis. - 2020. - V. 148. - P. 104271.
17. Китаевская С.В. Современные тенденции отбора и идентификации пробиотических штаммов молочнокислых бактерий / С.В. Китаевская // Вестник Казанского технологического университета. - 2012. - С. 184-188.
18. Волкова Г.С. Изучение биологических межштаммовых взаимодействий и ростовых свойств производственных штаммов молочнокислых бактерий / Г.С. Волкова, Е.В. Куксова, Е.М. Серба // Актуальные вопросы молочной промышленности, межотраслевые технологии и системы управления качеством. - 2020. - Т. 1. - № 1 (1). - С. 104-109. DOI: 10.37442/978-5-6043854-1-8-2020-1-104-109
19. Нетрусов А.И. Микробиология / А.И. Нетрусов, И.Б. Котова. - М.: Акаде-мия,2012. - 384 с.
20. Пат. 2200566 РФ. МПК A61K 35/74. Способ получения лактобактерина / В.А. Несчисляев, И.В. Фадеева; заявитель и патентообладатель Пермское научно-
производственное объединение «Биомед». - № 2001121098/14; заявл. 26.07.2001, опубл. 20.03.2003.
21. Пат. 2376366 РФ, МПК C12N 1/20, A61K 35/74, A23C 9/12, A23L 1/30. Консорциум штаммов лактобактерий и способ получения на его основе биологически активной добавки или закваски для производства кисломолочных продуктов / Н.А. Зыкова, А.В. Молокеев, Н.В. Молокеева и др.; заявитель и патентообладатель Закрытое акционерное общество «Вектор-БиАльгам» - № 2008104743/13; заявл. 12.02.2008; опубл. 20.12.2009.
22. Пат. 2491079 РФ, МПК 2491079. Комплексный пробиотический препарат и способ его получения / Д.Р. Яруллина, Л.Г. Дамшкалн, Р.О. Михеева и др.; заявитель и патентообладатель Федеральное бюджетное учреждение науки Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова Российской академии наук. - № 2012129621/15, заявл. 13.07.2012, опубл. 27.08.2013.
23. Пат. 2326938 РФ, МПК C12N 1/20, A61K 35/7, A23C 9/123. Консорциум штаммов лактобактерий и способ получения на его основе препарата, используемого в качестве биологически активной добавки или закваски для производства кисломолочных продуктов / Н.А. Зыкова, А.В. Молокеев, Н.В. Молокеева и др.; заявитель и патентообладатель Закрытое акционерное общество «Вектор-БиАльгам» - № 2006100739/13; заявл. 10.01.2006; опубл. 20.06.2008.
24. Pat. CN107043715, IPC C12N1/20, A23L2/38, C12R1/25, C12R1/23, C12R1/225, C12R1/01. Active probiotic freeze-dried powder and preparation method thereof / Y. Weidong; applicant SHANDONG AOBOSEN MEDICAL TECH CO., LTD. - № 201611220998.1; stated 26.12.2016; published 15.08.2017.
References:
1. Role of the gut microbiota in nutrition and health / A.M. Valdes, J.Walter, E. Segal [et al.] // BMJ (Clinical research ed.) - 2018. - № 361. - Р. k2179. DOI: https:// doi.org/10.1136/bmj.k2179.
2. Probiotics and gastrointestinal conditions: An overview of evidence from the Cochrane Collaboration / E.A. Parker, T. Roy, C.R. D'Adamo [et al.] // Nutrition (Burbank, Los Angeles County, Calif.). - 2018. - № 45. - Р. 125-134.e11. DOI: https://doi. org/10.1016/j.nut.2017.06.024.
3. Gomes, A.C. The human gut microbiota: Metabolism and perspective in obesity / A.C. Gomes, C. Hoffmann, J.F. Mota // Gut microbes. - 2018. - № 9 (4). - Р. 308325. DOI: https://doi.org/10.1080/19490976.2018.1465157.
4. Role of Probiotics in Human Gut Microbiome-Associated Diseases / S.K. Kim, R.B. Guevarra, Y.T. Kim [et al.] // Journal of microbiology and biotechnology. - 2019. -№ 29 (9). - Р. 1335-1340. DOI: https://doi.org/10.4014/jmb.1906.06064.
5. Islam, S.U. Clinical Uses of Probiotics / S.U. Islam // Medicine. - 2016. - № 95 (5). - Р. e2658. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000002658.
6. Meta-analysis: the effect of probiotic administration on antibiotic-associated diarrhea / F. Cremonini, S. Di Caro, E.C. Nista [et al.] // Alimentary pharmacology & therapeutics. - 2002. - № 16 (8). - Р. 1461-1467. DOI: https://doi.org/10.1046/ j.1365-2036.2002.01318.x.
7. Markowiak, P. Effects of Probiotics, Prebiotics, and Synbiotics on Human Health / P. Markowiak, K. Slizewska / Nutrients. - 2017. - № 9 (9). - Р 1021. DOI: https://doi. org/10.3390/nu9091021.
8. Liu, Y. Probiotics in Disease Prevention and Treatment / Y. Liu, D.Q. Tran, J.M. Rhoads // Journal of clinical pharmacology. - 2018. - № 58. - Р.164-179. DOI: https:// doi.org/10.1002/jcph.1121.
9. De Man, J.C. A medium for the cultivation of lactobacilli / J.C. de Man, M. Rogosa, M.E. Sharpe // J Appl Bacteriol. - 1960. - № 23. - P. 130-135.
10. Identification of Vaginal Lactobacilli with Potential Probiotic Properties Isolated from Women in North Lebanon / I.A. Kassaa, M. Hamze, D. Hober [et al. ] // Microbial Ecology. - 2014. - V. 67. - P. 722-734.
11. MU VNIIMS 01.86.02.-89 Guidelines for the selection of lactic acid bacteria in the composition of starter cultures and preparations for small rennet cheeses. Uglich: VNIIMS, 1989, 87 p.
12. GOST 10444.11-89 Food products. Methods for the determination of lactic acid microorganisms. Food products, canned food. Microbiological analysis methods: Sat. GOSTs. M .: Standartinform, 2010.
13. Bergey's manual of systematic bacteriology. Second edition. Volume three. The Firmicutes - Springer Science+Business Media, LLC, 233 Spring Street, New York, NY 10013, USA. - 2009. - 1422 р.
14. Guidelines for the sanitary and epidemiological assessment of the safety and functional potential of probiotic microorganisms used for food production: Guidelines. M.: Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare, 2011, 104 p.
15. Antibiotic activity and resistance of lactic acid bacteria and other antagonistic bacteriocin-producing microorganisms / Yang Y., Babich O., Sukhikh S. [et al.] // Foods and Raw Materials. - 2020. - Vol. 8. - № 2. - P. 377-384.
16. Pazhoohan, M. Antimicrobial and antiadhesive effects of Lactobacillus isolates of healthy human gut origin on Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) and Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) / M. Pazhoohan, F. Sadeghi, M. Moghadami // Microbial Pathogenesis. - 2020. - V. 148. - P. 104271.
17. Modern trends in the selection and identification of probiotic strains of lactic acid bacteria. Vestnik Kazanskogo tekhnologicheskogo universiteta. [Bulletin of Kazan Technological University], 2012, pp. 184-188.
18. Study of biological inter-strain interactions and growth properties of production strains of lactic acid bacteria / G.S. Volkovva, E.V. Kuksova, E.M. Serba. Aktual'nye voprosy molochnoj promyshlennosti, mezhotraslevye tekhnologii i sistemy upravleniya kachestvom. [Topical issues of the dairy industry, intersectoral technologies and quality management systems], 2020, T1, no. 1 (1), pp. 104-109. DOI: 10.37442 / 978-56043854-1-8-2020-1-104-109.
19. Netrusov A.I. Microbiology. M .: IC «Academy», 2012, 384 p.
20. Pat. 2200566 RF. IPC A61K 35/74. Method of obtaining lactobacterin / V.A. Neschislyaev, I.V. Fadeeva; applicant and patentee of the Perm Scientific and Production Association «Biomed». - № 2001121098/14; declared July 26, 2001, publ. 03/20/2003.
21. Pat. 2376366 RF, IPC C12N 1/20, A61K 35/74, A23C 9/12, A23L 1/30. A consortium of lactobacilli strains and a method of obtaining a biologically active additive or sourdough on its basis for the production of fermented milk products / N.A. Zykova, A.V. Molokeev, N.V. Molokeeva and others; applicant and patent holder Closed Joint Stock Company «Vector-BiAlgam» - № 2008104743/13; declared 02/12/2008; publ. 20.12.2009.
22. Pat. 2491079 RF, IPC 2491079. Complex probiotic preparation and method for
its production / D.R. Yarullina, L.G. Damshkaln, R.O. Mikheeva and others; applicant and patentee Federal Budgetary Institution of Science Institute of Organoelement Compounds. A.N. Nesmeyanov of the Russian Academy of Sciences. - № 2012129621/15, app. 13.07.2012, publ. 27.08.2013.
23. Pat. 2326938 RF, IPC C12N 1/20, A61K 35/7, A23C 9/123. Consortium of strains of lactobacilli and a method for producing a drug on its basis, used as a biologically active additive or starter culture for the production of fermented milk products / N.A. Zykova, A.V. Molokeev, N.V. Molokeeva and others; applicant and patent holder Closed Joint Stock Company Vector-BiAlgam - № 2006100739/13; declared 10.01.2006; publ. 20.06.2008.
24. Pat. CN107043715, IPC C12N1/20, A23L2/38, C12R1/25, C12R1/23, C12R1/225, C12R1/01. Active probiotic freeze-dried powder and preparation method thereof / Y. Weidong; applicant SHANDONG AOBOSEN MEDICAL TECH CO., LTD. - № 201611220998.1; stated 26.12.2016; published 15.08.2017.
Obtaining a probiotic consortium based on strains isolated from cow's milk
Vesnina Anna Dmitrievna, Graduate Student, Research Laboratory Assistant e-mail: koledockop1@mail.ru
Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Kemerovo State University»
Fotina Natalya Vyacheslavovna, Research Laboratory Assistant e-mail: fotina.natashenka@mail.ru
Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Kemerovo State University»
Prosekov Alexander Yurevich, Dr. Tech. Sc., Professor, Head of Department e-mail: aprosekov@rambler.ru
Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Kemerovo State University»
Kozlova Oksana Vasilevna, Dr. Tech. Sc., Assistant Professor e-mail: ms.okvk@mail.ru
Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Kemerovo State University»
Dyshlyuk Lyubov Sergeevna, Cand. Sc. Biol., Assistant Professor e-mail: soldatovals1984@mail.ru
Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Kemerovo State University»
Keywords: intestinal microflora, Lactobacillus, probiotic bacteria, biocompatibility, antagonistic activity, antibiotic resistance, identification.
Abstract: For the prevention and normalization of the microbiota, the imbalance of which leads to a violation of the healthy state of the body, the use of probiotics is promising, and therefore, their development. This work is aimed at creating a probiotic consortium. In the course of the study, the strains of L. acidophilus, L. plantarum and L. casei were isolated, on the basis of which various consortia were assembled. The results showed that a consortium consisting of L. plantarum, L. casei, L. acidophilus in a ratio of 3:1:1, had the maximum accumulation of cell biomass for a specified time, showed antibiotic activity against a number of pathogenic and opportunistic strains, resistance to the action of antibiotics and to the unfavorable conditions of the gastrointestinal tract. In order to use the consortium as a probiotic and use it in the food industry, it is planned to study the nature and activity of its cellular metabolites, and study its technological properties in the future.
