CC BY
61
ПОЛУЧЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА ПЛОДОВЫХ И ЯГОДНЫХ РАСТЕНИЙ in vitro
■I I *
?
Наталья Кухарчик,
заведующая отделом биотехнологии Института плодоводства НАН Беларуси, доктор сельскохозяйственных наук, профессор
Аннотация. Представлены результаты исследований отдела биотехнологии Института плодоводства НАН Беларуси в области размножения плодовых и ягодных культур in vitro. Описаны основные этапы получения посадочного материала сортов плодовых и ягодных культур, винограда, хмеля, адаптированных для выращивания в Беларуси. Ключевые слова: плодоводство, питательные среды, размножение in vitro, адаптация, посадочный материал.
Разработка и адаптация методик микроразмножения in vitro и последующего выращивания микрорастений ex vitro к современному сортименту плодовых и ягодных растений Беларуси позволяет своевременно размножать единичные селекционные экземпляры, включать технику in vitro в процесс оздоровления, депонирования, защиты от реинфицирования, осуществлять безопасный обмен растительным материалом и производство высококачественного посадочного материала.
В практических работах отдела биотехнологии Института плодоводства по ускоренному размножению плодовых и ягодных культур используется техника на основе индукции прямого органогенеза из тканей материнского растения. Наиболее удобны для инициации культуры in vitro вегетативные почки, поскольку именно в них содержатся основные зачатки органов растений, представленные наименее специализированной меристематиче-ской тканью. Вегетативные почки вводятся in vitro как целыми с почечными чешуями и без них
на одревесневших и неодревес-невших черенках, так и в виде изолированных меристем. Органогенез растений в культуре in vitro при этом происходит практически так же, как in vivo, за исключением того, что с введением экзогенных цитокининов в питательные среды для первой культуры инициируется развитие как верхушечной меристемы, так и конгломерата микропобегов. Снятие апикального доминирования путем формирования побегов с относительно укороченными междоузлиями, инициация развития пазушных почек и меристемати-ческих бугорков, которые дают начало новым побегам, рекультивируемым с теми же результатами, является универсальной моделью прямого органогенеза
in vitro и имеет хорошую воспроизводимость в пределах широкого набора видов и сортов плодовых и ягодных растений. Тем не менее каждая культура в процессе органогенеза имеет свои особенности и предъявляет определенные требования к составу питательных сред по минеральным компонентам, углеводам, фитогормо-нам и их концентрациям, физическим условиям культивирования на различных этапах.
С технической точки зрения, процесс размножения плодовых и ягодных культур in vitro разделяется на несколько этапов: изоляция и стерилизация эксплан-та, создание условий для его роста на питательной среде, то есть инициация культуры in vitro; максимальное увеличение количества
Культура, вид Количество сортов, форм
Арония черноплодная Arónia melanocárpa 2
Брусника обыкновенная Vaccinium vitis-idaea L. 3
Виноград Vitis L. 12
Вишня (сорта и клоновые подвои) Prúnus subg. (Cérasus) 20
Голубика высокорослая Vaccinium corymbosum L.
Голубика полувысокая Vaccinium angustifolium Ait. x Vaccinium corymbosum L. 15
Голубика узколистная Vaccinium angustifolium Ait.
Ежевика Rubus subgen (Rubus fruticosus L.J 6
Жимолость Lonicera caerulea L. 10
Земляника садовая Fragaria x ananassa 60
Ирга Amelanchier alnifolia 4
Клюква крупноплодная Vaccinium macrocarpon Ait. 3
Крыжовник Ríbes úva-críspa L. 6
Малина Rúbus idáeus 20
Облепиха Hippophae rhamnoides 2
Рябина садовая Sórbus aucupária 3
Слива (сорта и клоновые подвои) Prunus L, 6
Смородина красная Ríbes rúbrum L. 5
Смородина черная Ríbes nígrum L. 37
Хеномелес Chaenomeles japonica 2
Хмель Humulus lupulus L. 5
Черника обыкновенная Vaccinium myrtillus L. 1
Яблоня (клоновые подвои) Malus P. MILL., 5
Груша (сорта и клоновые подвои) Pyrus L . 6
Таблица 1. Плодовые и ягодные культуры, виноград, хмель, размножаемые in vitro в отделе биотехнологии Института плодоводства, 2000-2019 гг.
микрорастений - собственно микроразмножение; укоренение побегов; возврат растений из условий in vitro в условия ex vitro -адаптация регенерантов.
В отделе биотехнологии Института плодоводства в культуре in vitro выращивается посадочный материал плодовых и ягодных сортов, клоновых подвоев для плодовых культур, винограда, хмеля (табл. 1), проводится размножение элитных гибридов для селекционной оценки и передачи в Государственную инспекцию по испытанию и охране сортов растений.
Для перечисленных в таблице растений в рамках научных проектов и хозяйственных договоров разработаны методические элементы получения in vitro требуемого количества однолетних саженцев в течение одного -двух лет.
Наиболее трудоемкими этапами культивирования с применением техники in vitro, являются переходные стадии in vivo -in vitro - ex vitro. Основные проблемы перевода in vitro связаны с необходимостью освобождения от патогенных микроорганизмов без повреждения тканей эксплан-тов и с последствиями нарушения систем питания при выделении изолированных частей. При размножении ягодных предпочтение отдается ежегодному введению эксплантов in vitro - для сокращения количества пассажей, снижения риска мутабильности и других аномалий, возникающих в результате длительного культивирования на искусственных питательных средах. Для плодовых в связи с длительной стабилизацией культуры in vitro пассажирова-ние возможно в течение двух лет. Из основных факторов, влияющих
Культура Питательные среды на этапах КР* Ризогенез Адаптационные Адапта-
введения in vitro размножения укоренения in vitro*, % субстраты ция*, %
Арония черноплодная МС, 6-БА - 0,5 мг/л МС, ИМК 0,1 мг/л до 12 до 100 БИОНА, перлит до 90
Брусника обыкновенная WPM+2iP - 5 мг/л; Зеатин - 1-2 мг/л - 5 - мох сфагнум + торф до 94
Виноград МС, 6-БА - 1,1 мг/л / МС, ИМК - 0,2 мг/л до 6 99 торф+перлит до 95
Вишня (сорта) МС, 6-БА - 0,75 мг/л МС, ИМК 0,8 мг/л до 6 до 85 БИОНА до 87
Вишня (клоновые подвои) МС, 6-БА - 0,5 мг/л / МС, ИМК - 0,4 мг/л до 20 до 94 БИОНА, перлит до 95
Голубика WPM+2iP - 5 мг/л; Зеатин - 1-2 мг/л - 8 - мох сфагнум + торф до 100
Груша (клоновые подвои) МС (1/4NH4NO3)+ 6-БА - 1,5 мг/л МС, ИМК 0,5 мг/л до 6 63 БИОНА 93
Ежевика МС, 6-БА - 0,5 мг/л МС, ИМК 0,3 мг/л 8 96 перлит 95
Жимолость МС, 6-БА - 0,5 мг/л МС, 6-БА - 1,5 мг/л / МС, ИМК 1-3 мг/л до 8 93 торф, перлит 100
Земляника садовая Гамборга+6-БА -0,1 мг/л МС, 6-БА -0,2-0,7 мг/л '/4 МС до 12 99 перлит 99
Клюква крупноплодная WPM+Зеатин - 1-2 мг/л - 4 - мох сфагнум + торф 99
Крыжовник МС (1/3NH4NO3; 1/3 KNO3) + 6-БА - 0,3 мг/л МС (40% макро-; 50% микросолей), ИМК - 0,3 мг/л до 5 91 БИОНА 71
Малина летняя, ремонтантная МС, 6-БА - 0,75 мг/л МС, ИМК 0,1 мг/л до 13 99 БИОНА, перлит 99
Рябина садовая МС, 6-БА - 0,5 мг/л МС, ИМК 0,2 мг/л до 13 99 БИОНА, торф+перлит 99
Слива (сорта) Слива (клоновые подвои) Смородина красная Смородина черная Хеномелес Хмель Яблоня (клоновые подвои) МС, 6-БА - 1 мг/л МС, 6-БА - 0,5 мг/л / МС, ИМК 0,5 мг/л МС, ИМК 0,3 мг/л МС, ИМК 0,4-0,5 мг/л / МС, ИМК 0,5-0,8 мг/л МС, ИМК 0,9-1,0 мг/л МС, ИМК 0,5 мг/л МС, ИМК 0,5-1,0 мг/л 2 56 БИОНА БИОНА, перлит БИОНА, перлит БИОНА перлит БИОНА, перлит БИОНА 85 94 до 82 до 94 93 99 86
QL, МС + 6-Б МС, 6-БА - 0,2 мг/л МС, 6-БА - 0 МС, 6-БА - 0,1 мг/л МС, 6-БА -МС, 6-БА - 0,1 мг/л А - 0,5 м1/л МС, 6-БА -0,6-0,8 мг/л С 1 П „г/п до 12 до 7 99 до 90
5-1,0 мг/л МС, 6-БА - 0,75 мг/л до 7 до 5 до 100 94
0,5 мг/л МС, 6-БА - 2-5 мг/л 8 до 5 99 99
Таблица2. Выделенные компоненты питательных сред и субстратов для адаптации плодовых, ягодных культур, винограда, хмеля (по результатам исследований 2000 - 2019 гг.). Примечание: *КР - коэффициент размножения; результативность ризогенеза и адаптации приведены по средним многолетним данным для различных сортов. При значительной разнице показателей между сортами приведены лучшие результаты.
на эффективность ее инициации, можно выделить размер первоначального экспланта, его местоположение на исходном растении, возраст, период изоляции, состав питательных сред.
Процесс микроразмножения для плодовых и ягодных культур происходит в основном в результате закладки пазушных почек, которые дают начало микропобегам, а также благодаря непосредственному росту последних, которые могут быть разрезаны на черенки (кроме земляники). Для размножения in vitro оптимальными являются такие концентрации компонентов питательных сред, которые обеспечивают достаточно высокий коэффициент деления за один пассаж, минимальную дедифференциацию
тканей и отсутствие адвентивных почек. При использовании относительно низких концентраций цитокининов (в наших исследованиях 0,1-2,0 мг/л) образование каллуса и придаточных почек у плодовых и ягодных культур сводится к минимуму, на таких средах не наблюдается витрифи-кации регенерантов, что особенно важно для этапов укоренения и адаптации к нестерильным условиям. В табл. 2 приведены данные по выделенным в результате многолетних исследований концентрациям цитокининов для каждой культуры, минеральному составу питательных сред, а также коэффициенты размножения (КР) для сортов. Необходимо отметить, что для большинства плодовых и ягодных оптимальным
цитокинином является 6-бензил-аденин (6-БА), для брусничных -2iP и зеатин (рис. 1).
Рис. 1. Размножение в культуре in vitro
Развитие корневой системы в культуре in vitro определяется, в первую очередь, генотипом (способность к образованию корней в культуре in vitro коррелирует с укореняемостью черенков традиционными методами). Наши исследования по изучению особенностей ризогенеза большого набора сортов и гибридов плодовых и ягодных растений, адаптированных к выращиванию в условиях Беларуси, показывают, что основными факторами, влияющими на интенсивность и качество укоренения, являются концентрация и вид ауксина в питательной среде (без использования веществ ауксиновой природы корни на микрочеренках in vitro практически не образуются); концентрация минеральных компонентов питательных сред; степень развития укореняемого экспланта(для большинства культур высота микрочеренка не менее 1,5-2 см). Исключение составляет земляника садовая, относящаяся к травянистым растениям, она очень легко укореняется без экзогенных ауксинов, как в естественных условиях, так и in vitro. Для широкого спектра плодовых и ягодных культур оптимальный индуктор ризогенеза in vitro - индолилмасляная
кислота (ИМК) в концентрациях от 0,1 до 3,0 мг/л (табл. 2, рис. 2). Не входят в список брусничные культуры (голубика, брусника, клюква), для которых укоренение in vitro нецелесообразно, а ex vitro позволяет одновременно укоренять и адаптировать регене-ранты Vaccinium spp. Эффективность такого совмещения для голубики составляет 96,2-100,0%, брусники - 66,7-93,8%, клюквы -96,9-100,0%. Оптимальными субстратами для адаптации данных сортов являются верховой торф и мох Sphagnum L.
Ограничивающим фактором для промышленного микроразмножения плодовых и ягодных культур являются проблемы адаптации ex vitro, заключающиеся в наличии высокого уровня транспирации растений-регене-рантов, выращиваемых в культуре in vitrn на искусственных питательных средах, содержащих большое количество воды, и при высокой влажности, дефиците углекислого газа и слабом освещении в изолированном пространстве культуральной емкости. При таких условиях культивирования
у растений-регенерантов слабо развиваются проводящие сосуды ксилемы, не функционирует устьичный аппарат, практически отсутствует эпикутикулярный слой воска, питание носит фото-миксотрофный характер, корни, образованные in vitro, анатомически отличаются от корней ex vitro. Все приведенные факторы определяют медленный рост ре-генерантов в нестерильных условиях, а активное размножение патогенной микрофлоры на изначально стерильных растениях может свести результативность адаптации к минимуму.
Для предотвращения избыточной транспирации создаются условия высокой влажности, для уменьшения патогенной нагрузки применяются стерильные субстраты, как правило, являющиеся двух-или трехкомпонентными смесями, в которых используются такие исходные вещества, как торф, песок, перлит, ионообменные субстраты, водоудерживающие препараты. В ходе исследований выделены оптимальные компоненты субстратов для изученных культур, обеспечивающие высокую результативность адаптации, в том числе перлит, торф, ионообменный субстрат «БИОНА», сфагновый мох, (табл. 2, рис. 3).
Необходимо отметить, что исходным материалом для размножения в культуре in vitro плодовых и ягодных культур является созданная в Институте плодоводства коллекция растений, свободных от системных патогенов, регламентируемых нормативными документами ЕРРО и белорусскими СТБ на посадочный материал, и депонируемые в условиях, минимизирующих риск повторного заражения (рис. 4). Выделение базовых единиц проводится
методами иммуноферментного и ПЦР-анализа, при этом для всех культур, приведенных в табл. 2, суммарно тестируется 26 патогенных вирусов и фитоплазмы. Для выборочной диагностики генетической стабильности посадочного материала проводится ПЦР-анализ. Так, при изучении маточных растений сортов голубики и их клонов, полученных при микроразмножении, прайме-ры при амплификации с анализируемыми ДНК-матрицами генерировали идентичные RAPD-профи-ли, что указывает на отсутствие вариабельности в анализируемых локусах.
Разработанные методики, технологические регламенты размножения, а также созданные свободные от патогенных вирусов маточные насаждения позволили организовать производство оздоровленных саженцев более 200 сортов 20 плодовых и ягодных культур, винограда, хмеля для закладки маточников и промышленных насаждений в пи-томниководческих хозяйствах Беларуси, России, Грузии, реализации населению для приусадебного возделывания.
Большое количество материала, полученного в Институте плодоводства, используется для создания маточных насаждений в пи-томниководческих хозяйствах, что обусловлено как высокими фитосанитарными стандартами получаемого материала, так и тем, что для многих ягодных растений и клоновых подвоев плодовых культур отмечено значительное увеличение вегетативной продуктивности после прохождения растений через культуру in vitro, без других оздоровительных процедур. Например, для земляники садовой после этого характерны
более интенсивные плете- и усо-образование и большая площадь листовой поверхности. Среднее для различных сортов количество плетей и дочерних розеток на одно растение, выращенное традиционным способом, - 3,62 и 7,99 шт., после культуры in vitro -6,4 и 16,4 шт. соответственно.
В институте плодоводства активно развивается получение кор-несобственных саженцев для плодовых в культуре in vitro, традиционно размножаемых прививкой, в частности вишни, сливы. К преимуществам корнесобствен-ных насаждений можно отнести более высокую зимостойкость и возможность восстановления за счет поросли, лучший размер плодов, их качество и хранение; большую устойчивость к болезням; адаптивность к выращиванию с закрытой корневой системой. Нами разработаны рекомендации по размножению in vitro сортов вишни и сливы, которые определяют последовательность стерилизации эксплантов, период инициации культуры in vitro, питательные среды для всех этапов культивирования, физические параметры инициации культуры и ризогенеза (температура, освещенность). Исследования
позволили выделить сорта, пригодные для получения корнесоб-ственных растений (Ровесница, Ливенская, Гриот белорусский, Вя-нок, Ласуха, Новодворская); обеспечить результативность инициации на уровне 70-95%, коэффициент размножения за 1 пассаж 3,1-6,5 в зависимости от сорта, ризогенез на уровне 95% и выход адаптированных растений -не менее 92%; оптимизировать последовательность получения саженцев за счет исключения технологических приемов (выращивание подвоев, окулировка). Аналогичные результаты получены для сливы сортов Даликатная и Венгерка белорусская.
Основные направления исследований в области микроразмножения на ближайшие годы предполагают расширение перечня размножаемых культур за счет включения малораспространенных поливитаминных ягодных растений; перечня новейших сортов основных плодовых и ягодных культур; совершенствования технологий культивирования для снижения стоимости выращиваемых в культуре in vitro саженцев при сохранении высоких фитоса-нитарных и морфометрических характеристик.
