CC BY
5Литература
1. Подбор условий для выделения полевых изоля-тов возбудителей микоплазмозов птиц от больных птиц и из проб патологического материала / И.А, Рунина, М.И. Сорокина, М.Ю. Волков [и др.] // 2-й Междунар. вет. конгр. по птицеводству. М., 2006. С. 89-92.
2. Методические указания по приготовлению и поддержанию трахеальной органной культуры куриных эмбрионов и цыплят / О.А. Чупина [и др.] Владимир, 2004.
3. Bearson, S.M. Induction of a Mycoplasma gallisepti-cum pMGA gene in the chicken tracheal ring organ culture model / S.M. Bearson, S.D. Collier, B.L. Bear-
son // Avian Dis. 2003. Vol. 3. P. 745-749.
4. Cassell, G. H. Mycoplasmas respiratory infections / G.H. Cassell, WA. Clyde, J.K. Davis // The Mycoplasmas. Mycoplasma Pathogenicity. Inc. Orlando, Acad. Press, 1985. Vol. 4. P. 69-106.
5. Feberwee, A. An experimental model to quantify horizontal transmission of Mycoplasma gallisepti-cum / A. Feberwee, D.R. Mekkes, D. Klinkenberg // Avian Pathol. 2005. Vol. 3. P. 355-361.
6. Papazisi, L. Analysis of cytadherence-deficient, GapA negative Mycoplasma gallisepticum strain R / L. Papazisi, K.E. Troy, T.S. Gorton // Infect. Immun. 2000. Vol. 68, №12. P. 6643-6649.
УДК 619:579.843.93:616-078
С.С. Сыбатуллов, О.В. Прунтова, О.И. Ручнова, С.А. Хрульнова
(ФГУП ГосНИИгенетика, г. Москва)
ПОЛУЧЕНИЕ, ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ КОМПОНЕНТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ОКМТОВЛСТЕКШМ КИтОТКЛСИЕЛЬЕ В СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХ
Введение
На протяжении последних 20 лет большое внимание зарубежные исследователи уделяют изучению бактерий O. rhinotracheale. В настоящее время считается доказанным, что O. rhinotracheale являются причиной острой контагиозной болезни, поражающей респираторные органы домашних птиц (аэросаккулит, ри-нотрахеит, пневмония, плеврит и др.). Смертность у цыплят-бройлеров при этой болезни может достигать 20%. У индеек в возрасте 12 недель и старше данная инфекция может вызывать острую пневмонию со смертностью, доходящей до 50% [1]. Степень выбраковки при убое пораженного стада цыплят-бройлеров может достигать 90%.
Длительность болезни, клиническая признаки, смертность при вспышках ор-нитобактериоза варьируют в зависимости от факторов окружающей среды: высокая плотность посадки птицы, повышенная концентрация аммиака в воздухе, недостаточная вентиляция, сопутствующие болезни [2, 3].
Бактерии O. rhinotracheale широко распространенны в странах с промышленно развитым птицеводством [2].
Изоляты O. rhinotracheale трудно диф-
феринцировать по биохимическим признакам от бактерий семейства Pasteurellaceae.
Для идентификации изолятов O. rhino-tracheale широко применяют реакцию им-мунодиффузии в агаровом геле, при помощи её было выделено 7 серотипов O. rhinotracheale (A, B, C, D, E, F G), реакцию агглютинации, реакцию преципитации в агаровом геле и иммуноферментный анализ (ИФА) [4]. Для ИФА используют антигены O. rhinotracheale, инактивированные формальдегидом, экстрагированные кипячением и др. [3, 4].
В настоящее время в РФ отсутствует серологическая диагностика O. rhinotra-cheale.
Целью нашей работы было получение специфических компонентов O. rhino-tracheale для использования в РА и ИФА, и оценка их активности и специфичности.
Материалы и методы
Штаммы бактерий. В работе использовали бактерии O. rhinotracheale штамм К33 из музея ФГУ «ВНИИЗЖ», Salmonella enteritidis штамм №7, Mycoplasma gallisepti-cum штамм «S6», полученные из музея ФГУ «ВГНКИ»; Pasteurella multocida штамм №11039 серовариант А1,полученный из Американской коллекции типовых культур (АТСС).
Питательные среды. Биомассу бактерий получали путем культивирования на агаре, приготовленного на основе мясного перевара по Хоттингеру с добавлением 10% экстракта эритроцитов крови лошади и сердечно-мозговом бульоне (фирма Difco).
Получение антигенов для иммунизации кур. 24-часовую культуру бактерий, выросшую на агаре по Хоттингеру с кровяным экстрактом, смывали физиологическим раствором, содержащим 0,3% формалина, и отмывали 3 раза. Для иммунизации бройлерам использовали 15%-ную клеточную суспензию [5].
Получение О-антигена (О-АГ). Суспензию 24-часовой культуры бактерий осветляли центрифугированием при 3000 об\ мин в течение 30 минут трижды. Полученный осадок бактерийных клеток заливали соляной кислотой и ставили в термостат на 12 часов при 37°С. После инкубации суспензию отмывали от соляной кислоты центрифугированием при 3000 об\мин в течение 30 минут трижды. Полученный осадок ресус-пендировали фосфатно-буферным раствором (ФБР) с 0,3% раствором формалина.
Получение формалинизированного антигена (Ф-АГ). Суточную бактериальную суспензию культуры отмывали центрифугированием при 3000 обо\мин в течение 30 минут, полученный осадок растворяли в ФБР с 0,3% раствором формалина и инкубировали в термостате при 37° С в течение 24 часов. Проверяли полноту инактивации путём высева культуры, обработанной формалином, на агар на основе мясного перевара по Хоттингеру с экстрактом эритроцитов крови лошади. Инактивирован-ную культуру трижды центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут. [3].
Получение К-антигена (К-АГ). Смывали 24-часовую культуру бактерий с агара 5мл ФБР! Суспензию ставили на водяную баню на 30 минут при 56°С. Далее осаждали бактерийные клетки центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 минут, а надосадок использовали в качестве кап-сульного антигена [4].
Получение прогретого цельно-клеточного антигена (100°-АГ). Смывали 24-часовую культуру бактерий с чашки Петри 5 мл ФБР. Суспензию бактериальных клеток прогревали на водяной бане 60 минут при 100°С. Полученную суспензию использовали для постановки иммунологических реакций [5].
Липополисахаридный антиген (ЛПС-АГ) был получен по методике фенол-вод-
ной экстракций [6].
Гипериммунную сыворотку (положительный контроль) получали по методике, описанной Hinz K.H. и Neumann U. (1991 год) [6].
Оценку активности и специфичности антигенов проводили при помощи реакции агглютинации (РА) и иммунофермен-тного анализа (ИФА). Реакцию агглютинации и непрямой вариант твердофазного ИФА для определения антител в сыворотках крови кроликов и свиней проводили по традиционным методикам [1]. Учет результатов ИФА проводили с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом при длине волны 492 нм. Оценку и интерпретацию результатов в ИФА проводили по S/ P (отношению значений оптической плотности испытуемой сыворотки к значению оптической плотности положительного контроля):
S/P = gx - к- / к+ - к-, где gx - оптическая плотность испытуемой пробы сыворотки;
к- - оптическая плотность отрицательного контроля;
к+ - оптическая плотность положительного контроля.
Если отношение S/P<0,2, это означает, что проба отрицательная.
Если отношение S/P=0,21-0,29 - проба сомнительная.
Если отношение S/P>0,3 - проба положительная.
Статистическая обработка результатов. Для статистической обработки полученных данных использовали методы Бейли Н. [2].
Результаты исследований
Получение биомассы O. rhinotracheale. Бактерии O. rhinotracheale штамм К33 выращивали на стерильных чашках Петри с агаром на основе мясного перевара по Хоттингеру с добавлением экстракта эритроцитов крови лошади. Посев проводили сплошным газоном и дробно для контроля морфологии колоний. Культивировали в термостате при 37°С в течение 20-24 ч.
Колонии O. rhinotracheale имели правильную круглую форму, ровные края, серо-белый цвет, что является характерным для данного вида бактерий (рис. 1).
При электронном микроскопирова-нии клетки O. rhinotracheale имели характерную морфологию: короткие палочки и коккобактерии (рис. 2).
Получение и оценка специфичности гипериммунных сывороток кур. Для иммунизации кур использовали формалинизиро-
, Ч> - Л
Рис. 1. Колонии О. тЫпо1тасНеа1е на агаре по Хоттингеру (увеличение х16 раз)
Рис. 2. Электронная микрофотография О. тЫпо1тасНеа1е (увеличение х25000 раз)
ванный антиген O. rhinotracheale с концентрацией микробных клеток 10 млрд./мл.
Кур иммунизировали по следующей схеме: первый этап иммунизации: внутримышечно 1 мл (0,5 мл формалинизирован-ного антигена + 0,5 мл адъюванта), второй этап иммунизация: через 7 дней внутримышечно 0,5 мл антигена.
Через 10 дней проверяли сыворотку крови кур в РА. При титре 1:800, 1:1600 животных тотально обескровливали.
Таким образом, были получены семь вариантов проб сывороток крови кур, которые использовали в работе.
Определение активности и специфичности антигенов O. rhinotracheale в РА на стекле. На этом этапе работы сравнивали активность и специфичность О-АГ (наиболее часто использующегося в РА), ЛПС-АГ (который применяется в ИФА), а также формалинизированного (Ф-АГ) и прогретого (100°-АГ) антигенов в РА на стекле.
При анализе таблицы видно, что полученные антигены O. rhinotracheale в РА на стекле были активны и специфичны, так как положительный результат наблюдали только с гомологичной сывороткой.
Определение активности и специфичности антигенов O. rhinotracheale в количественной РА. Активность и специфичность формалинизированного и соматического антигенов проверяли также в реакции агглютинации на планшетах.
По результатам исследований, приведенных в таблице 2, видно, что сыворотка O. rhinotracheale реагировала только с гомологичными антигенами и не давала перекрестных реакций с гетерологичными, что обуславливает её специфичность.
Определение активности и специфичности антигенов O. rhinotracheale в ИФА. На этом этапе работы провели оценку активности и специфичности полученных антигенов O. rhinotracheale в ИФА.
Таблица 1
Оценка специфичности полученных антигенов в РА на стекле
АГ Сыворотки^^^^ 100°-АГ* Ф-АГ** О-АГ*** ЛПС-АГ****
O. rhinotracheale ++++ ++++ ++++ ++++
S. enteritidis + - - -
P. multocida - - - -
M. gallisepticum - - - -
* - прогретый антиген;
** - формалинизированный антиген;
*** - соматический антиген;
**** - липополисахаридный антиген
Таблица 2
Оценка специфичности гипериммунной сыворотки кур в количественной РА
^^^^^^Антиген О-АГ* О-АГ** О-АГ*** О-АГ**** Ф-АГ*****
Сыворотки^^^^ SE PM MG ORT ORT
O. rhinotracheale - - - 1600 >1600
S. enteritidis 1600 - - - -
P.multocida - 800 - - -
M.gallisepticum - - 1600 - -
* - соматический антиген бактерий S. enteritidis.
** - соматический антиген бактерий P multocida;
*** - соматический антиген бактерий M. gaШsepticum;
**** - соматический антиген бактерий О. rhinotracheale;
***** - формалинизированный антиген бактерий О. rhinotracheale
Таблица 3
Оценка специфичности и активности Ф-АГ, К-АГ, 100е-АГ и ЛПС-АГ
АГ проба ЛПС-АГ К-АГ Ф-АГ 100°-АГ
Значение S/P - отношения/ оценка результатов
S. enteritidis 0,095 N* 0,408± P** 0,475 P 0,290 S
P. multocida 0,026 N 0,368 P 0,155 N 0,114 N
M. gallisepticum 0,323 P 0,338 P 0,062 N 0,121 N
1 0,229 S*** 0,478 P 0,805 P 0,206 S
2 0,743 P 0,428 P 1,055 P 0,126 N
3 0,917 P 0,470 P 1,018 P 0,622 P
4 0,748 P 0,360 P 0,824 P 0,208 S
5 0,827 P 0,283 S 0,892 P 0,213 S
6 0,675 P 0,545 P 1,018 P 0,032 N
7 0,868 P 0,540 P 0,947 P 0,192 N
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 - пробы сывороток крови кур, иммунизированных бактериями О. гЫпоШ^еаЫ; * - N - отрицательная реакция; ** - Р - положительная реакция; *** _ з - сомнительная реакция
При анализе таблицы 3, видно, что ли-пополисахаридный антиген дает положительную реакцию с гомологичной сывороткой, кроме пробы №1 - 8/Р=0,229, а также с гетерологичной сывороткой к бактериям М. gaШsepticum - 8/Р=0,338.
Капсульный антиген показал положительный результат со всеми гомологичными и гетерологичными исследуемыми сыворотками. Сомнительный результат дала проба №5 сыворотки крови кур с гомологичным капсульным антигеном (8/Р=0,283)
Формалинизированный антиген показал специфичность и активность с гомологичными сыворотками, но с сывороткой 8. е^епёШБ (8/Р=0,475) показал положительный результат.
Прогретый антиген был не активным
и не специфичным, как с гетерологичным сывороткам, так и с гомологичным, за исключением пробы №3 (S/P=0,622).
Из результатов исследований данного этапа работы, следует, что наиболее специфичными в ИФА являются липополисаха-ридный и формалинизированный антигены (S/P от 0,360 до 1,055). Не специфичным для иммуноферментного анализа показал себя прогретый антиген.
Для подтверждения этих результатов иммуноферментный анализ был поставлен в трех повторностях (таб. 4)
Оценка специфичности и активности ИФА и РА. В этом разделе мы проводили сравнительное исследование сывороток в РА и ИФА для выявления антител в сыворотке крови кур. Сравнение результатов проводили на примере ЛПС и формали-
Таблица 4
Оценка специфичности и активности липополисахаридного и формалинизированного антигенов
" -—------Антигены Сыворотки -— ЛПС-АГ* Ф-АГ**
S. enteritidis 0.025±0.004 0.476±0.007
P. multocida 0.025±0.002 0.157±0.009
M. gallisepticum 0.321±0.002 0.068±0.006
1 0.286±0.05 0.810±0.05
2 0.745±0.004 1.058±0.008
3 0.918±0.03 1.024±0.06
4 0.747±0.006 0.826±0.009
5 0.827±0.007 0.895±0.006
6 0.679±0.004 1.021±0.004
7 0.879±0.014 0.954±0.006
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 - пробы сывороток крови кур, иммунизированных бактериями О. тШпоШФеик; * - липополисахаридный антиген; ** - формалинизированный антиген
Таблица 5
Сравнительная оценка результатов ИФА и РА для ЛПС и формалинизированного антигена О. тЫпо1тасНеа1е штамма К33
-—-—--■-—-.__Антигены Сыворотки~~~~—^^ ЛПС-АГ* Ф-АГ**
в РА в ИФА в РА в ИФА
S. enteritidis S N S P
P. multocida N N N N
M. gallisepticum N P N N
1 P S P P
2 P P P P
3 P P P P
4 P P P P
5 P P P P
6 P P P P
7 P P P P
1-7 - пробы сывороток крови кур, иммунизированных бактериями О. ^поШЛеии; * - липополисахаридный антиген; ** - формалинизированный антиген
низированного антигена О. rhinotracheale штамма К33.
Данные сравнительного исследования сывороток крови кур в реакциях ИФА и РА, представленные в таблице 5, дали схожие результаты. Таким образом, полученные специфические сыворотки можно использовать в обеих реакциях, так как получены сопоставимые результаты.
Выводы
1. Соматический и формалинизирован-
ный антигены О. rhinotracheale в качественной и количественной РА были активными и специфичными.
2. В реакций ИФА активными и специфичными показали себя: липополисахарид-ный и формалинизированный антигены.
3. ЛПС-АГ и Ф-АГ можно использовать для выявления антител в сыворотке крови кур в РА и ИФА.
4. Полученные специфические сыворотки можно использовать в обеих реакциях.
РЕЗЮМЕ
Получены компоненты (антигены и сыворотки) Ornitobacterium rhinotracheale штамм К33 для использования в реакции агглютинации и иммуноферментном анализе. SUMMARY
The paper presents results of induction and determination of activity and specificity of components of Ornitobacterium rhinotracheale strain K33 for ELISA.
Литература
1. Van Veen Linda; Do we know real impact of Ornitho-
bacterium rhinotracheale infections? / L. van Veen // Poultry Inter., may2003 Vol.42., № 5. P. 20.
2. Hafez, M.H./ Diagnosis of Ornithobacterium rhinotracheale//. Int. J. of Poultry Sci. 2002. №1(5). P. 114-118.
3 Odor, E. M. / Isolation and Identification of Ornithobacterium rhinotracheale from Commercial Broiler Flocks on the Delmarva Penisuela. / E. M Odor., M. Salem., C.R. Pope. //Avian Dis.,vol. 41. 1997. P 257-260. 4. Van Empel, P./ Identification and serotyping of Or-nithobacterium rhinotraheale/ P. van Empel, H. van
den Bosch, P. Loeffen// J. Clin. Microbiol., vol. 35, 1996. P. 418-421.
5 Van Empel, P. / Immunohistochemical and serological investigation of experimental Ornithobacterium rhinotraheale infection in chickens/ P. van Empel, M. Vrijenhoek, H. van den Bosch//Avian Pathol., 1999 vol. 28. P 187-193.
6. Ryll, M / Pilotstudie zur Prgvalenz der Ornithobacterium rhinotracheale- Infection bei Masththn nordwestdeutschland/, M. Ryll., K.H. Hinz, U. Neumann // Tierärztlich Wschr. 1997- Bd.110. S. 267-271
