Получение мутантных форм альфа-галактозидазы морской бактерии Pseudoalteromonas sрp. Kmm 701

Слепченко Любовь Васильевна; Голотин Василий Анатольевич; Лихацкая Галина Николаевна; Бакунина Ирина Юрьевна; Балабанова Лариса Анатольевна; Рассказов Валерий Александрович

• Биологически активные вещества из морских гидробионтов в биотехнологии и медицине

Новикова Ольга Данииловна, д.х.н., в.н.с. лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ФГБУН «Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова» ДВО РАН, г. Владивосток, тел.: 8 (423) 23100719, e-mail: novolga_05@mail.ru;

Соловьева Тамара Федоровна, д.х.н., гл.н.с. лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ФГБУН «Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова» ДВО РАН, г. Владивосток, тел.: 8(423)23100719, e-mail: soltaf@mail.ru.

Л.В. Слепченко, В.А. Голотин, Г.Н. Лихацкая, И.Ю. Бакунина, Л.А. Балабанова, В.А. Рассказов

получение мутантных форм альфа-галактозидазы морской бактерии

PSEUDOALTEROMONAS SPP. КММ 701

ФГБУН «Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова» Дальневосточного отделения Российской академии наук, г. Владивосток

Получены генетические конструкции мутантных форм альфа-галактозидазы морской бактерии Pseudoalteromonas spp. КММ 701 на основе данных мутагенеза in silico для изучения зависимости функциональности фермента от его структуры.

Ключевые слова: сайт-направленный мутагенез, рекомбинантный белок, экспрессия, ферментативная активность, термостабильность.

Цитировать: Слепченко Л.В., Голотин В.А., Лихацкая Г.Н., Бакунина И.Ю., Балабанова Л.А., Рассказов В.А. Получение мутантных форм альфа-галактозидазы морской бактерии Pseudoalteromonas spp. KMM 701 // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2014. №3(57). С. 48-49. URL: https://yadi.sk/d/FjJeH0F9USARM

Альфа-галактозидаза морской бактерии Pseudoalteromonas spp. КММ 701 (GenBank code: DQ530422) является важным ферментом для биотехнологического получения универсальной донорской крови группы O(I) [1]. Однако фермент не обладает достаточной термостабильностью для осуществления масштабного производства. Для выявления структурно-функциональных особенностей фермента был получен рекомбинантный аналог альфа-галактозида-зы a-PsGal и построена высокоточная полноатомная модель 3-D структуры с использованием прототипа из Lactobacillus acidophilus NCFM (PDB code: 2XN2).

На основе анализа трехмерной структуры альфа-галактозидазы морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701 были предсказаны точечные мутации аминокислотных остатков молекулы фермента для повышения его термостабильности. Методом ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза

были получены мутантные формы с аминокислотными заменами E406P, V326E, Q410P, S412P, G463P для стабилизации петли, расположенной вблизи активного центра. Рекомбинантные белки с мутациями L68R, T44R, L411D были сконструированы для укрепления связи между двумя субъединицами. Мутанты D450A, D515A, E337A, C493N и W170A были получены для выявления механизмов каталитического действия и образования димера альфа-галактозидазы.

работа была поддержана грантами рФФи №1304-00806, дВо ран №»12-Ш-А-05-064, программой «Молекулярная и клеточная биология» 12-Ьп6-10.

ЛИТЕРАТУРА

1. Balabanova L.A. et al. Molecular Characterization and Therapeutic Potential of a Marine Bacterium Pseudoalteromonas sрp. KMM 701 a-Galactosidase. Mar Biotechnol. 2010; 12(1): 111-120.

Slepchenko L.V., Golotin V.A., Likhatskaya G.N., Bakunina I.Y., Balabanova L.A, Rasskazov V.A. production of the marine bacterium PSEUDOALTEROMONAS SPP. KMM 701 alpha-galactosidase mutants

G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok.

The marine bacterium Pseudoalteromonas spp. KMM 701 alpha-galactosidase mutants were constructed on the base of in silico mutagenesis data to study the effect of the enzyme structure on its functionality.

Keywords: site-directed mutagenesis, recombinant protein, expression, enzymatic activity, thermostability.

Citation: Slepchenko L.V., Golotin V.A., Likhatskaya G.N., Bakunina I.Y., Balabanova L.A, Rasskazov V.A. Production of the marine bacterium pseudoalteromonas sp. kmm 701 alpha-galactosidase mutants. Health. Medical ecology. Science. 2014; 3(57): 48-49. URL: https://yadi.sk/d/FjJeH0F9USARM

Биологически активные вещества из морских гидробионтов в биотехнологии и медицине • сведения об авторах

Слепченко Любовь Васильевна, аспирант лаборатории морской биохимии ТИБОХ «Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Елякова» ДВО РАН, г. Владивосток, тел.: 8(423) 2310703; e-mail: lubov99d@mail.ru;

Голитин Василий Анатольевич, аспирант лаборатории морской биохимии ТИБОХ «Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Елякова» ДВО РАН, г. Владивосток, тел.: 8(423) 2310703; e-mail: golotin@bk.ru;

Балабанова Лариса Анатольевна, к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории морской биохимии ТИБОХ «Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Елякова» ДВО РАН, г. Владивосток, тел.: 8(423) 2310703; e-mail: balaban@piboc.dvo.ru;

Бакунина Ирина Юрьевна, д.х.н., ведущий научный сотрудник лаборатории химии ферментов ТИБОХ «Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Елякова» ДВО РАН, г. Владивосток, тел.: 8(423) 2310705; e-mail: bakun@list.ru;

Рассказов Валерий Александрович, к.б.н., заведующий лабораторией морской биохимии ТИБОХ «Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Елякова» ДВО РАН, г. Владивосток, тел.: 8(423) 2310703; e-mail: raskaz@pibok.dvo.ru.

Т. П. Смолина, Н.Н. Беседнова

ВЛИЯНИЕ гЛИКОПОЛИмЕРОВ морских БАКТЕРИЙ PSEUDOALTEROMONAS NIGRIFACIENS НА ЭКСПРЕССИЮ мОЛЕКУЛ АДгЕЗИИ ЛЕЙКОЦИТАмИ ЧЕЛОВЕКА

1ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова» Сибирского отделения Российской Академии медицинских наук, г. Владивосток

С помощью метода проточной цитометрии показано, что липополисахарид и экзополисахарид морских протеобактерий Pseudoalteromonas nigrifaciens изменяют экспрессию молекул адгезии на нейтрофилах и моноцитах человека, снижая уровень экспрессии молекул CD62L и увеличивая экспрессию - CD11b, CD11c и CD54.

Ключевые слова: морские бактерии, липополисахарид, экзополисахарид, молекулы адгезии. Цитировать: Смолина Т. П., Беседнова Н.Н. Влияние гликополимеров морских бактерий Pseudoalteromonas nigrifaciens на экспрессию молекул адгезии лейкоцитами человека // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2014. №3(57). С. 49-50. URL: https://yadi.sk/d/Tdle1K1tUSALc

Движение нейтрофилов и моноцитов - одних из главных эффекторных клеток врожденного иммунитета - в очаг воспаления начинается с серии адгезионных событий, каждое из которых связано с изменением экспрессии определенного типа поверхностных молекул.

цель настоящей работы - оценить влияние ли-пополисахарида и экзополисахарида морских про-теобактерий Pseudoalteromonas nigrifaciens на изменение уровня экспрессии молекул адгезии ней-трофилами и моноцитами человека.

Материалы и методы. Липополисахарид и экзополисахарид P. nigrifaciens выделены и любезно предоставлены для исследований старшим научным сотрудником ФГБУН «ТИБОХ им. Г.Б. Елякова» ДВО РАН Р.П. Горшковой. Материалом для исследования служила периферическая кровь с гепарином (25 БД/мл), полученная от здоровых доноров Уровень экспрессии молекул определяли методом цитометрического анализа на проточном цитометре «FACSCalibur» («Becton Dickinson») c использованием моноклональных антител к молекулам CD45-FITC/ CD14-PE, CD62L-FITC, CD11b-PE, CD11c-PE, CD54-PE («Beckman Coulter»).

Гейтирование субпопуляций нейтрофилов осуществляли по прямому (FSC) и боковому (SSC) светорассеянию. Экспрессию молекул адгезии на поверхности моноцитов и нейтрофилов определяли через 1 и 24 часа инкубации крови с гликополимерами (конечная концентрация - 10 мкг/мл).

результаты и обсуждение. Липополисахарид и экзополисахарид значимо снижали экспрессию L-селектинов (CD62L), но увеличивали экспрессию - Р-интегринов (CD11b, CD11c) и иммуноглобулинов (СD54) на нейтрофилах и моноцитах. Действие экзо-полисахарида Р. шgrifaciens на изменение уровеня экспрессии молекул адгезии нейтрофилов и моноцитов проявлялось уже через 1 час инкубации. ЛПС значимо изменял экспрессию молекул адгезии на моноцитах через 1 час, на нейтрофилах - через 24 часа инкубации.

Выводы: липополисахарид и экзополисахарид Р. nigrifaciens штамма КММ15 оказывают активирующее действие на эффекторные функции клеток врожденного иммунитета, т. к. молекулы адгезии, относящиеся к селектинам и интегринам, играют специализированную роль в процессе передвижения лейкоцитов в участок воспаления и передаче различ-

Получение мутантных форм альфа-галактозидазы морской бактерии Pseudoalteromonas sрp. Kmm 701 Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Production of the marine bacterium Pseudoalteromonas sp р . KMM 701 alpha-galactosidase mutants

Текст научной работы на тему «Получение мутантных форм альфа-галактозидазы морской бактерии Pseudoalteromonas sрp. Kmm 701»