CC BY
35
УДК 619:615.45:636.4
ПОЛУЧЕНИЕ МИКРОКАПСУЛИРОВАННОГО ЭНЗИМСПОРИНА И ЕГО НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННАЯ АПРОБАЦИЯ
СЕИН ОБ.,
доктор биологических наук, профессор, профессор кафедры хирургии и терапии, ФГБОУ ВО Курская ГСХА, тел. 53-15-55.
ЛОКТИОНОВА Е.А.,
аспирант кафедры хирургии и терапии, ФГБОУ ВО Курская ГСХА, тел. 53-15-55. НАЗАРЕНКО А.И.,
директор по животноводству, ООО «Сапфир-Агро», Хомутовский р-н, Курская обл.
Реферат. В статье приводится оригинальный способ получения микрокапсулированного про-биотика энзимспорина (Патент РФ №2689164. - 2018г.) и его модификация. Показано, что исключение из технологического процесса 50%-ного раствора ацетона, который используется в качестве осадителя, а также дополнительная обработка готовых микрокапсул раствором хитозана повышает устойчивость пробиотических бактерий к кислой среде желудка, что было подтверждено экспериментально. В ходе проведенных исследований установлено, что микрокапсулы, полученные по модифицированному способу, сохраняли свою структуру как в физиологическом растворе, так и 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты. При этом микрокапсулы энзимспорина, полученные с использованием оригинального способа, в хлористоводородной кислоте приобретали мягкую консистенцию и частично подвергались разрушению. Результаты бактериологических исследований показали, что количество бактерий в изготовленном препарате составляло 5,2-104 - 5,5 104 в 1 г, а в оригинальном препарате - 4,0 • 104 - 4,8104 в 1 г. Микрокапсулированный энзимспорин, полученный по модифицированной технологии, не оказывал отрицательного влияния на организм подопытных бычков. Клинические и общие гематологические показатели у подопытных животных, после включения препарата в рацион, находились в пределах физиологических границ. Абсолютная масса тела, среднесуточные приросты массы тела у бычков, получавших препарат, были выше по сравнению с контрольными животными. Микрокапсулированный энзимспорин рекомендуется к использованию при выращивании молодняка крупного рогатого скота.
Ключевые слова: абсолютная масса тела, альгинат натрия, бычки на откорме, гематологические показатели, кровь, микрокапсулы, пробиотики, хитозан, энзимспорин.
OBTAINING MICROCAPSULATED ENZIMSPORINE AND ITS SCIENTIFIC AND PRODUCTION APPROBATION
SEIN O.B.,
Doctor of Biological Sciences, Professor, Professor of the Department of Surgery and Therapy, FSBEI HE Kursk State Agricultural Academy, tel. 53-15-55.
LOKTIONOVA E.A.,
Postgraduate student of the Department of Surgery and Therapy, Kursk State Agricultural Academy, tel. 53-15-55.
NAZARENKO A.I.,
livestock director, Sapfir-Agro LLC, Khomutovsky district, Kursk region.
Essay. The article provides an original method for obtaining a microencapsulated probiotic enzymesporin (RF Patent No. 2689164. - 2018) and its modification. It is shown that the exclusion of a 50% acetone solution from the technological process, which is used as a precipitant, as well as additional processing of finished microcapsules with a chitosan solution, increases the resistance of probiotic bacteria
to the acidic environment of the stomach, which was confirmed experimentally. In the course of the studies carried out, it was found that the microcapsules obtained by the modified method retained their structure both in physiological solution and in 0.1M hydrochloric acid solution. At the same time, the microcapsules of enzymesporin obtained using the original method acquired a soft consistency in hydrochloric acid and were partially destroyed. The results of bacteriological studies showed that the number of bacteria in the prepared preparation was 5.2 * 104 - 5.5 * 104 in 1 g, and in the original preparation - 4.0 * 104 - 4.8 * 104 in 1 g. Microencapsulated enzymesporin, obtained by the modified technology, did not have a negative effect on the organism of experimental bulls. Clinical and general hematological parameters in experimental animals, after inclusion of the drug in the diet, were within physiological boundaries. The absolute body weight, average daily body weight gain in bulls treated with the drug were higher compared to control animals. Microencapsulated enzymesporin is recommended for use in raising young cattle.
Keywords: absolute body weight, sodium alginate, fattening bulls, hematological parameters, blood, microcapsules, probiotics, chitosan, enzymesporin.
Введение. О пользе применения пробиоти-ков в животноводстве и ветеринарной медицине свидетельствуют не только многочисленные научные публикации, но и постоянное пополнение фармакологического рынка новыми про-биотическими препаратами. При этом препараты данной биологической направленности ежегодно совершенствуются. Если в недалеком прошлом основой для пробиотических препаратов являлись бактерии семейства Lacto- и Bifidobacterium, то в настоящее время более активно используются спорообразующие бактерии, в особенности из рода Bacillus.
Способность спорообразующих бактерий оказывать пробиотическое действие привела к разработкам на их основе препаратов, которые относятся к поколению самоэлиминирующихся антагонистов. В настоящее время в нашей стране насчитывается более 20 таких препаратов, которые полностью или частично получены на основе спорообразующих бактерий [1,2].
Обладая широким спектром действия и устойчивостью ко многим антибиотикам, пробио-тические препараты применяются не только для нормализации пищеварения, но и при дисбакте-риозе, острых кишечных инфекциях, а также с целью профилактики гнойносептических осложнений в послеоперационном периоде [3,7].
Важной особенностью пробиотиков является их способность адгизироваться к кишечному эпителию. Прикрепляясь к эпителиальным клеткам посредством гликоконъюгированных рецепторов, пробиотики обеспечивают тем самым колонизационную резистентность и препятствуют адгезии и инвазии патогенных микроорганизмов [4, 7]. Адгезируясь к эпителию, пробиотические бактерии способствуют укреплению цитоскелета клеток кишечной стенки, снижают проницаемость, активируют рецепторы эпителиального фактора роста, повышают
синтез полиаминов, относящихся к гармонопо-добным веществам, усиливающим процессы регенерации кишечного эпителия [4]. В то же время пробиотические штаммы, несмотря на положительные эффекты, не могут заменить собственную индигенную микрофлору и не способны активно размножаться в кишечнике. Одной из причин этого является бионесовместимость с резидентными микроорганизмами животного. В этой связи для получения устойчивого лечебного эффекта необходим длительный прием пробиотиков. Вторым не менее важным фактором является низкая резистентность пробиотиков к кислой среде желудка, после попадания в которую большая часть пробиотиче-ских бактерий погибает [8, 9]. Поэтому для достижения устойчивого биологического и терапевтического эффекта пробиотиков необходима их защита от кислотного воздействия. Такой защитой является микрокапсуляция - «упаковка» пробиотических бактерий в кислотоустойчивые капсулы. Именно микрокапсулы позволяют пробиотикам с наименьшими потерями пройти желудок и после поступления в кишечник под воздествием щелочной среды разрушиться, тем самым обеспечить выход пробио-тических бактерий в полость кишечника и проявить свои биологические свойства [8, 9].
Цель исследования. Исходя из вышеизложенного целью нашей работы являлось усовершенствование ранее разработанного способа микрокапсулирования пробиотика энзимспори-на и его апробация в производственных условиях на крупном рогатом скоте.
Материал и методика исследований. Экспериментальная часть работы состояла из двух этапов. Первый этап был посвящен усовершенствованию способа микрокапсулирования про-биотика энзимспорина. Исследования в данном направлении проводили в условиях научно-
исследовательской лаборатории кафедры хирургии и терапии ФГБОУ ВО Курская ГСХА.
Во время второго этапа была проведена научно-производственная апробация изготовленного микрокапсулированного энзимспорина на бычках черно-пестрой породы принадлежавших ООО «Сапфир-Агро» (Хомутовский район, Курская обл.).
Исследуемый нами в экспериментах про-биотик энзимспорин (производитель ООО «Спектр-БИО» г. Москва) включает в свой состав спорообразующие бактерии рода Bacillus: B.subtillis ВКМ В-2998Д (ВКПМ В-314); B.licheniformis ВКМ В-2999Д (ВКПМ В-8054); B.subtillis ВКМ В-3057Д (ВКПМ В-12079).
Энзимспорин широко применяют в практике животноводства с целью профилактики желудочно-кишечных заболеваний, профилактики и лечения диареи, предотвращения кормовых и технологических стрессов. Энзимспорин оказывает положительное влияние на микрофлору кишечника после длительного применения антибиотиков, вытесняет энтеропатогенную микрофлору из кишечной микробной популяции. Он эффективен при нарушениях процессов пищеварения, связанных с ферментативной недостаточностью или дисфункцией печени.
Применяют энзимспорин как индивидуально в виде выпойки молодняку, так и групповым методом путем включения в рацион после предварительного смешивания с комбикормом или кормовыми смесями.
В наших исследованиях энзимспорин был выбран в качестве ядра микрокапсул, а в качестве оболочки использовали альгинат натрия -органическое соединение, которое в природе
находится в форме альгиновой кислоты. В пищевой промышленности данное вещество зарегистрировано как пищевая добавка Е401.
Альгинат натрия широко используется при микрокапсулировании пробиотиков, так как хорошо формирует оболочку вокруг бактериальной клетки. При этом он нетоксичный, свободно переходит в гелеобразное состояние и относительно быстро освобождает пробиотические бактерии в кишечнике.
В то же время, несмотря на все положительные стороны, альгинат натрия имеет существенные недостатки. В частности, он низкоустойчив к кислой среде и чувствителен к хелати-рующим соединениям (фосфат-, цитрат-, лак-тат-ионам), которые при взаимодействии с ионами кальция нарушают целостность альгино-вой кислоты [10].
К важным недостаткам микрокапсул, полученных из альгината натрия, можно отнести образование микротрещин в их оболочке, что значительно снижает прочность и устойчивость микрокапсул при контакте с кислой средой желудка [11].
Учитывая вышеизложенное, мы модифицировали ранее разработанный нами способ мик-рокапсуляции энзимспорина (Патент РФ №2689164. - 2018 г.).
Научно-производственные испытания изготовленного микрокапсулированного энзимспо-рина проводили на бычках черно-пестрой породы. В 15-месячном возрасте бычков было сформировано три группы по 15 голов в каждой с соблюдением принципа «пар-аналогов» (рисунок 1).
Рисунок 1 - Общая схема проведения научно-производственной апробации микрокапсули-рованного энзимспорина
Условия содержания и выращивания бычков были одинаковыми и соответствовали нормативным требованиям. Кормление подопытных животных осуществлялось по сбалансированным рационам, которые составлялись на основе химического состава кормов и их фактической питательности в соответствии с детализированной системой нормативного кормления крупного рогатого скота. Потребление кормов определяли в течение двух смежных суток по разности массы заданных кормов и их остатков. Физиологическое состояние подопытных животных оценивали по клиническим и общим гематологическим параметрам. Кровь у бычков получали с использованием вакуумных систем из яремной вены. В крови определяли скорость оседания эритроцитов (СОЭ), гематокритную величину, содержание эритроцитов, лейкоцитов и гемоглобина. Исследование общих гематологических показателей крови у подопытных животных осуществляли с использованием общепринятых методик и автоматического анализатора.
Полученные в ходе эксперимента данные подвергались биометрической обработке (П.Ф. Рокицкий, 1973) с использованием ПК и прикладных программ. Разницу различий считали достоверной при р<0,05 (95%), р<0,01 (99%), р<0,001 (99,9%).
Результаты исследований. В ходе усовершенствования ранее разработанного способа микрокапсулирования энзимспорина, в частности при диспергировании пробиотика в суспензию альгината натрия, мы использовали специальное устройство разработанной нами
_2
конструкции (Решение № 2020132902 о выдаче патента от 11.01.2021 г.) (рисунки 2-3).
Рисунок 2 - Устройство для микрокапсу-лирования жидких веществ
Данное устройство включает корпус в виде шприца-дозатора 1 и капельниц 2, которые вмонтированы в капельницедержатель 3, выполненный в виде полихлорвиниловой трубки, имеющей форму кольца и который с использованием тройника 4 и трубки 5 соединяется со шприцем-дозатором, обеспечивающим подачу микрокапсулированного вещества в капельницедержатель. При этом капельнице-держатель фиксируется внутри стакана гомогенизатора с использованием шайб и крепежных гаек (6-9).
Рисунок 3 - Схема устройства для микрокапсулирования жидких веществ (обозначение по тексту)
Перед использованием устройства капель-ницедержатель помещают в стакан гомогенизатора и через боковое отверстие выполненное в верхней части стакана вводят свободный конец тройника, на который надевают внутреннюю и внешнюю шайбы и навинчивают крепежную гайку, которая фиксирует тройник и капельницедержатель внутри стакана гомогенизатора.
Разработанное устройство позволяет проводить микрокапсулирование жидких веществ с использованием перемешивания ингредиентов с высокой скоростью, что сокращает процесс получения микрокапсул.
Вторым этапом модификации ранее разработанного способа являлось укрепление аль-гинатной оболочки микрокапсул. С этой целью перед их высушиванием мы включали дополнительную обработку в растворе хито-зана, который является производным линейного полисахарида. Дополнительная обработка микрокапсул в растворе хитозана позволила повысить их устойчивость к соляной кислоте желудка.
Полученные микрокапсулы представляли собой сферические частицы светло-желтого цвета размером от 0,35-0,55 мм. Выход готовых микрокапсул при использовании модифицированной технологии составил 94%. При массовом соотношении в микрокапсулах яд-ро:оболочка 1:1.
Оценка физико-химических свойств микрокапсул энзимспорина, полученных модифицированным способом, показала, что они были устойчивыми к внешней среде. В частности, после нахождения в очищенной воде в течение 60 минут микрокапсулы полностью сохраняли свою структуру. Проверка влияния на полученные микрокапсулы энзимспорина желудочной и кишечной среды проводилась в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи РФ (М.: Науч. Центр экспертизы средств мед. применения, 2008. - Вып. 1. - 704 с.), согласно которым кишечнораство-римые лекарственные формы не должны распадаться в течение 60 минут в растворе кислоты хлористоводородной (0,1 М) и после промывания водой должны распадаться в растворе натрия гидрокарбоната (рН 7,5-8,0) в течение 60 минут.
В ходе проверки было установлено, что микрокапсулы полученные по модифицированному способу сохраняли свою структуру как в физиологическом растворе, так и в 0,1М растворе хлористоводородной кислоты. В то
же время микрокапсулы полученные по ранее разработанному способу после контакта с хлористоводородной кислотой приобретали мягкую консистенцию, некоторые микрокапсулы подвергались частичному разрушению.
С целью определения бактериологических свойств модифицированного препарата использовали оптический метод (по стандартам мутности) и камеры Горяева. Для анализа количества жизнеспособных клеток исследуемых микроорганизмов предварительно разрушали оболочку микрокапсул фосфатным буфером с рН 7,8-8,0. Затем культуру титровали и высевали пробиотические бактерии на питательную среду. В качестве контроля использовали стандартную культуру в соответствующих разведениях.
Результаты проведенных бактериологических исследований показали, что количество жизнеспособных бактерий в изготовленном препарате составляло 5,2 104 в 1 г, а в ранее изготовленном препарате - 4,0104 - 4,8 104 клеток.
Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что модифицированный способ позволяет получить микрокапсулированный пробиотический препарат энзимспорин с высокими биологическими свойствами.
Научно-производственные испытания изготовленного препарата показали, что он не оказывал отрицательного влияния на организм подопытных животных.
Так, общие клинические параметры (температура тела, частота пульса и дыхательных движений) у подопытных животных находились в пределах физиологических границ. СОЭ колебалась в пределах 0,74-0,77 мм/час, гематокрит - 38,7-40,0%. Содержание эритроцитов и гемоглобина у животных всех групп при постановке на эксперимент находилось на относительно низком уровне (6,3±0,10 -6,5±0,07 • 1012/л; 108,0± 3,1 - 109,5 ± 2,9 г/л). Затем у животных получавших препараты содержание данных компонентов крови повысилось, при этом наиболее высокое содержание регистрировалось у бычков 3 опытной группы (7,7±0,11 - 8,4±0,10* 1012/л; 120,0±2,3 - 127,5 ± 3,0 г/л). Данные изменения имели статистически достоверный характер ф < 0,05). Со стороны общего содержания лейкоцитов характерных изменений во время проведения эксперимента выявлено не было, у бычков всех групп их количество находилось в преде-
лах физиологических границ (7,54 ± 0,83 -8,05 ± 0,75 • 1012/л).
Исследование мясной продуктивности у подопытных животных показало, что абсолютная масса тела у быков, получавших мик-рокапсуливанный пробиотик в конце эксперимента (18 мес) была выше в среднем на 34,5 кг по сравнению с контрольными животными и на 11,5 кг - по сравнению со второй опытной группой.
Выводы. Результат проведённых исследований свидетельствует о том, что разработан-
ный нами способ позволяет получить микро-капсулированный энзимспорин в более устойчивой форме по сравнению со способом-прототипом. Полученный препарат не оказывает отрицательного влияния на физиологический статус подопытных животных. После его применения у бычков на откорме увеличивается в крови содержание эритроцитов и гемоглобина, повышаются приросты массы тела. Разработанный способ микрокапсулирования энзимспорина можно рекомендовать к широкому практическому применению.
Список используемых источников
1. Миронова И.В., Семерикова А.И. Влияние препарата «Ветоспорин суспензия» на гематологические показатели бычков симментальской породы // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. - 2013. - №5 (43). - С.128-131.
2. Семерикова А.И., Миронова И.В. Рост и развитие бычков симментальской породы при введении в рацион пробиотической добавки «Ветоспорин суспензия» // Известия Самарской государственной сельскохозяйственной академии. - 2013. - №1. - С.85-89.
3. Учасов Д.С., Буяров В.С., Ярован Н.И., Червонова И.В., Сеин О.Б. Пробиотики и пре-биотики в промышленном свиноводстве и птицеводстве.
4. Тараканов Б.В. Механизм действия пробиотиков на микрофлору пищеварительного тракта и организм животных // Ветеринария. - 2000. - №1. - С.47-54.
5. Тараканов Б.В. Эффективность целлобактерина при выращивании телят // Молочное и мясное скотоводство. - 2000.- №4. - С.14-16.
6. Панин А.Н., Малик Н.И., Илаев О.С. Пробиотики в животноводстве - состояние и перспективы // Ветеринария. - 2012. - №3. - С.3-8.
7. Малик Н.И., Панин А.Н. Ветеринарные пробиотические препараты // Ветеринария. -2001. - №1. - С.46-51.
8. Коррекция физиологического статуса у животных с использованием нанокапсулирован-ных препаратов / О.Б. Сеин, А.А. Кролевец, В.А. Челноков, К.А. Толкачев // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. - 2013. - №3. - С.64-66.
9. Рост и развитие молодняка крупного рогатого скота при скармливании нанокапсулиро-ванного пробиотика / О.Б. Сеин, А.А. Кролевец, В.А. Челноков, К.А. Толкачев // В кн.: Актуальные проблемы агропромышленного производства: материалы Международной научно-практической конференции, Курск. - 2013. - С.176-178.
10. Lee K.I., Heo T.R. Survival of Bifidobacterium longum immobilized in calcium alginate beads in simulated gastric juices and bile salt solution // Appl. Envizon. Microbiol. - 2000. - V.66. - P.869-973.
11. Ананьева Н.В. Изучение процесса хранения кисломолочного продукта, выработанного с применением капсулированных форм Lactobacterium acidophilus // Проблемы совершенствования холодильной техники и технологии. Энергосбережение: сб. науч. тр. - М., 2006. - С.79-82.
Spisok ispoFzuemy'x istochnikov
1. Mironova I.V., Semerikova A.I. Vliyanie preparata «Vetosporin suspenziya» na gematologicheskie pokazateli by'chkov simmental'skoj porody' // Izvestiya Orenburgskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. - 2013. - №5 (43). - S.128-131.
2. Semerikova A.I., Mironova I.V. Rost i razvitie by'chkov simmental'skoj porody' pri vvedenii v racion probioticheskoj dobavki «Vetosporin suspenziya» // Izvestiya Samarskoj gosudarstvennoj sel'skoxozyajstvennoj akademii. - 2013. - №1. - S.85-89.
3. Uchasov D.S., Buyarov V.S., Yarovan N.I., Chervonova I.V., Sein O.B. Probiotiki i prebiotiki v promy'shlennom svinovodstve i pticevodstve.
4. Tarakanov B.V. Mexanizm dejstviya probiotikov na mikrofloru pishhevaritel'nogo trakta i organizm zhivotny'x // Veterinariya. - 2000. - №1. - S.47-54.
5. Tarakanov B.V. E'ffektivnost' cellobakterina pri vy'rashhivanii telyat // Molochnoe i myasnoe skotovodstvo. - 2000.- №4. - S.14-16.
6. Panin A.N., Malik N.I., Ilaev O.S. Probiotiki v zhivotnovodstve - sostoyanie i per-spektivy' // Veterinariya. - 2012. - №3. - S.3-8.
7. Malik N.I., Panin A.N. Veterinarny'e probioticheskie preparaty' // Veterinariya. - 2001. - №1. - S.46-51.
8. Korrekciya fiziologicheskogo statusa u zhivotny'x s ispol'zovaniem nanokapsulirovanny'x preparatov / O.B. Sein, A.A. Krolevecz, V.A. Chelnokov, K.A. Tolkachev // Vestnik Kurskoj gosudarstvennoj sel'skoxozyajstvennoj akademii. - 2013. - №3. - S.64-66.
9. Rost i razvitie molodnyaka krupnogo rogatogo skota pri skarmlivanii nanokapsulirovannogo probiotika / O.B. Sein, A.A. Krolevecz, V.A. Chelnokov, K.A. Tolkachev // V kn.: Aktual'ny'e problemy' agropromy'shlennogo proizvodstva: materialy' Mezhdunarodnoj nauchno-prakticheskoj konferencii, Kursk. - 2013. - S.176-178.
10. Lee K.I., Heo T.R. Survival of Bifidobacterium longum immobilized in calcium alginate beads in simulated gastric juices and bile salt solution // Appl. Envizon. Microbiol. - 2000. - V.66. - P.869-973.
11. Anan'eva N.V. Izuchenie processa xraneniya kislomolochnogo produkta, vy'rabotannogo s primeneniem kapsulirovanny'x form Lactobacterium acidophilus // Problemy' sovershenstvovaniya xolodil'noj texniki i texnologii. E'nergosberezhenie: sb. nauch. tr. - M., 2006. - S.79-82.
