CC BY
28
_ВЕСТНИК ПНИПУ_
2023 Химическая технология и биотехнология № 2
DOI: 10.15593/2224-9400/2023.2.04 Научная статья
УДК 663.15
И.И. Анашкина, Е.В. Кравцова, А.В. Портнова
Пермский национальный исследовательский политехнический университет, Пермь, Россия
ПОЛУЧЕНИЕ МИКРОБНЫХ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ПЕРЕРАБОТКИ ОТХОДОВ ЗЕРНОВОГО ПРОИЗВОДСТВА
Одной из проблем сельского хозяйства в области выращивания животных и птиц является применение антибиотиков. Альтернативой использования антибиотиков служат микробные биопрепараты, которые вводят в состав кормов для сельскохозяйственных животных и птиц. Перспективными в этой области считаются бактерии рода Bacillus. Они образуют споры, способные выживать в кислой среде желудка, чем и вызывают интерес для производства пробиотиков.
Протеолитические ферментные препараты широко применяются в промышленности, например, для производства кормов, в медицинских целях и пищевой промышленности. Из-за высокой себестоимости ферменты, вырабатываемые из тканей животных, стараются заменить. В связи с этим актуальным является получение ферментов путем микробиологического синтеза.
В представленной работе субстратом для производства кормовой добавки выбраны по результатам экспериментов пшеничные отруби (отход зернового производства), являющиеся достаточно дешевым сырьем, содержащим большое количество питательных веществ. Протеолитические ферменты, выделяемые B. Subtilis в процессе метаболизма, разлагают отруби на легкоусвояемые сельскохозяйственными животными аминокислоты.
Из природного источника была выделена культура микроорганизмов-продуцентов протеаз, произведена их предварительная идентификация. Проведена оптимизация питательной среды для большей выработки ферментов с высокой протеолити-ческой активностью. Для определения суммарной активности протеаз использовался классический метод Ансона. Предложено использовать питательную среду, содержащую пшеничные отруби, мочевину, глюкозу и набор минеральных солей. Установлены следующие оптимальные условия культивирования: температура 37 °С, интенсивное перемешивание, длительность культивирования 5 суток.
В процессе выполнения работы также были проведены: технологический и прочностной расчеты, которые включают в себя расчет объема аппарата для биосинтеза, расчет перемешивавшего устройства, тепловой баланс, а также расчет обечайки, выпуклых днищ, опор и штуцеров. Подобран мотор-редуктор. По результатам расчетов спроектирован биореактор для получения легкоусвояемых кормов сельскохозяйственным животным, содержащих Bacillus subtilis, а также ряда продуцируемых бактериями ферментов, путем биоконверсии отходов зернового растительного сырья.
Ключевые слова: Bacillus subtilis, протеолитические ферменты, пшеничные отруби, ферментативная активность, кормовая добавка.
64
I.I. Anashkina, E.V. Kravtsova, A.V. Portnova
Perm National Research Polytechnic University, Perm, Russian Federation
OBTAINING MICROBIAL PROTEOLITIC PREPARATIONS FOR RECYCLING GRAIN PRODUCTIONWASTE
One of the problems of agriculture in the field of raising animals and birds is the use of antibiotics. An alternative to the use of antibiotics are microbial biological products that are introduced into the composition offeed for farm animals and birds. Bacteria of the genus Bacillus are considered promising in this area. They are able to form spores that can survive in the acidic environment of the stomach, which is why they are of interestfor the production ofprobiotics.
Proteolytic enzyme preparations are widely used in industry, for example, for the production offeed, for medical purposes andfor the food industry. Due to the high cost, enzymes produced from animal tissues are being replaced. In this regard, it is important to obtain enzymes by microbiological synthesis.
In the presented work, wheat bran (waste of grain production), which is a fairly cheap raw material containing a large amount of nutrients, was chosen as a substrate for the production of a feed additive based on the results of experiments. Proteolytic enzymes secreted by B. subtilis during metabolism decompose bran into amino acids easily digestible by farm animals.
A culture of protease-producing microorganisms was isolated, and their preliminary identification was made. The nutrient medium was optimized for greater production of enzymes with high proteolytic activity. The classical Anson method was used to determine the total activity of proteases. It is proposed to use a nutrient medium containing wheat bran, urea, glucose and a set of mineral salts. The following cultivations conditions were established: temperature 3 7°C, intensive stirring, cultivation duration 5 days.
In the course of the work, the following were also carried out: technological and strength calculations, which include the calculation of the volume of the apparatus, the calculation of the mixing device, the heat balance, as well as the calculation of the shell, convex bottoms, supports and fittings. Refurbished gear motor. Based on the results of the calculations, a bioreactor was designed to produce easily digestible feed for farm animals containing Bacillus subtilis, as well as a number of enzymes produced by bacteria, by bioconversion of waste grain plant materials.
Keywords: Bacillus subtilis, proteolytic enzymes, wheat bran, enzymatic activity, feed additive.
С каждым годом набирает обороты промышленное птицеводство и животноводство. Из-за ограничения контакта с естественными донорами нормальной микрофлоры (почвой, водой, растениями), большого количества поголовья на единице площади и антисанитарии ферм у животных и птиц может нарушаться микрофлора желудочно-кишечного
65
тракта. Из-за того, что иммунная система ослабевает, необходимо проводить профилактику или лечение, применяя различные антимикробные препараты от кишечных заболеваний и заболеваний, связанных со снижением резистентности.
В качестве таких препаратов долгое время применяли антибиотики кормового назначения. Несистемный ввод антибиотиков в комбикорма нарушает микрофлору за счет снижения полезных микроорганизмов, а патогенные и условно-патогенные бактерии привыкают к ним. В мясных продуктах может происходить накопление антибиотиков, проникая и накапливаясь тем самым в организме людей. Также существует опасность того, что устойчивость к антибиотикам микроорганизмов животных передастся патогенным бактериям, воздействующим на организм человека. У таких условно-патогенных микроорганизмов, как стафилококки, энтеробактерии и кишечная палочка, увеличилась устойчивость к лекарственным препаратам. Из-за существования опасности проникновения антибиотиков в пищевые продукты в 2006 г. в Евросоюзе принято решение об отказе их применения.
Специалисты и ученые из различных областей разработали замену кормовым антибиотикам - препараты, которые называют пробиоти-ками, пребиотиками и симбиотиками. Они экологически безопасны и не вызывают побочных эффектов, а также положительно влияют на микрофлору желудочно-кишечного тракта, что позволяет поддерживать здоровье сельскохозяйственных животных и птиц. При их применении мясо становится более качественным и безопасным, а также не приносит вред здоровью людей [1, 2].
В состав пробиотиков входят различные микроорганизмы и их штаммы, которые определяют их свойства [3].
В кормах сельскохозяйственных животных и птиц используют отруби. Отруби - это отход зернового производства, который представляет собой измельченную твердую оболочку зерна, применяются в качестве кормовой добавки.
Для того чтобы улучшить усвояемость белковых компонентов в кормовой промышленности, используют ферментные препараты, содержащие протеазы. Способность протеаз расщеплять высокомолекулярные белки приводит к тому, что в корме повышается количество аминокислот и пептидов. Протеолитические ферменты, вводимые в рацион сельскохозяйственных животных, проявляют свое действие, дополняя пищеварительные протеазы организма, не угнетая и не заменяя
66
собственные протеазы. Бактерии вида Bacillus subtilis, продуцирующие протеолитические ферменты, можно выращивать на отходах зернового производства [4].
Установлено, что B. subtilis синтезирует протеиназу, в активном центре которой последовательность аминокислот совпадает с последовательностью, характерной для активного центра таких протеаз, как трипсин и химотрипсин.
Протеолитические ферменты (Н.Ф.3.4) - ферменты класса гидро-лаз, катализирующие расщепление как пептидной связи между аминокислотами в белках и пептидах, так и некоторые другие связи, например, эфирные, амидные (рис. 1).
пептидная связь, расщепляемая протеазами
Рис. 1. Расщепление пептидной связи в белоксодержащих субстратах протеолитическими ферментами
Гидролиз белков протеолитическими ферментами протекает в два этапа. Сначала молекула белка атакуется протеиназами по глубинным пептидным связям, в результате чего образуются пептиды, а затем последние расщепляются пептидазами до аминокислот [5].
В данной работе были поставлены следующие задачи: оптимизировать состав питательной среды для получения большего количества микробных протеолитических ферментов; изучить, в какой мере получаемые ферменты расщепляют вводимый белок; определить выживаемость Bacillus subtilis в условиях имитации кислотности желудка; сконструировать биореактор (провести прочностные расчеты).
Экспериментальная часть. В качестве объекта исследования была выбрана культура Bacillus subtilis, выделенная из настоя сена согласно методике [6]. Далее была проведена идентификация микроорганизмов методами прямой микроскопии и окрашивания по Граму, описана морфология колоний микроорганизмов, изучены особенности их роста [7, 8].
В ходе выполнения работы нами была оптимизирована питательная среда для роста микроорганизмов и продукции протеолитических ферментов. В начальных экспериментах добавляли белок в виде
67
альбумина и казеина. Далее в целях оптимизации нами были выбраны отходы: подсолнечный шрот и пшеничные отруби, т.е. животный белок был заменен на растительный. А в качестве источника азота вместо пептона и дрожжевого экстракта стали использовать мочевину, в целях снижения стоимости питательной среды.
В результате проведенных экспериментов было выявлено, что наибольший выход протеолитических ферментов наблюдался в среде, где присутствовали пшеничные отруби.
В работе для исследований использовались отруби пшеничные, изготовленные ООО «Первый диетический» г. Москва. Химический состав пшеничных отрубей в среднем (%): воды 14,8; белков 15,5; жиров 3,2; клетчатки 8,4; безазотистых экстрактивных веществ 53,2; золы 4,9.
На первом этапе произведено культивирование микроорганизмов периодическим глубинным способом. Культура была пересеяна с заготовленных чашек Петри с МПА с культурой бактериальной петлей с соблюдением правил асептики в пробирку со скошенным мясопептонным агаром. Культивирование производили 24 ч при температуре 37 °С.
Далее готовили питательные среды, разливали в 5 конических ка-чалочных колб по 200 мл и стерилизовали в автоклаве при 0,5 атм 20 мин. После чего производили засев питательных сред 5 колб смывом 1 косяка на колбу, добавляя различное количество глюкозы, а также добавляли выбранное количество зерновых отходов (пшеничные отруби, предварительно простерилизованные при 1,2 атм) и проводили инкубирование в термостатической качалке при 130 об/мин. С целью поддержания жизнедеятельности бактерий в состав питательных сред включали минеральные соли.
В препаратах, содержащих пептиды, аминокислоты и белки, методом формольного титрования производят определение азота свободных аминогрупп. Определение аминного азота проводили по методу фор-мольного титрования (методу Серенсена). Азот аминогрупп определяют по тому, сколько щелочи пошло на титрование. Предполагается, что число карбоксильных групп пропорционально числу аминогрупп, вступивших в реакцию с формальдегидом [9].
Суммарную активность протеаз определяли по методу Ансона. Определение протеолитической активности производили путем действия препаратом, содержащим протеазы, на казеин. После чего производили осаждение белка и проводили определение белка, который не разложился, по колориметрической реакции Фолина на спектрофо-
68
тометре при длине волны 540 нм (желтый светофильтр) и толщине кюветы 0,1 см. Принимается, что количество разложившегося белка пропорционально содержанию в растворе тирозина. Рассчитывали протео-литическую активность ферментного препарата на 1 мл культуральной жидкости за 1 ч. Биомассу отделяли от культуральной жидкости центрифугированием при 6000 об/мин в течение 15 мин [10].
Рассчитали кинетические параметры Кт(каж) и Ум для разных концентраций глюкозы в среде [11, 12].
Определили влагоемкость отрубей, насыщаемых культуральной жидкостью. Полную влагоемкость определяли в делительной воронке диаметром 2,5 см и высотой 12 см. В нижнюю часть воронки помещали стекловолокно. Масса отрубей 10 г, высота заполнения 6,5 см, объем 31,89 м3. В течение 10 мин из бюретки добавляли воду по каплям, до равномерного и полного увлажнения, до стекания жидкости в краник делительной воронки. Затем определяли влажность при высушивании продукта до постоянной массы при установленной температуре и времени [13].
При исследовании влияния кислотности среды на выживаемость бактерий, идентичной кислотности желудка (рН 1,2), установлено, что даже после разведения в 104 раз и инкубации при 37 °С количество жизнеспособных клеток достаточно велико.
Также было определено содержание азота и белка в пшеничных отрубях. По содержанию азота (протеина) в кормах оценивается их питательность. Самым распространенным методом определения азота в органических соединениях является метод Кьельдаля. Он отличается наибольшей точностью, несмотря на недостаток - длительность выполнения анализа. Метод основан на определении количества общего азота, содержащегося в навеске продукта при озолении органических веществ концентрированной ШБ04 в присутствии катализаторов (сернокислой меди, перекиси водорода, металлического селена, окиси селена, молибдата натрия).
Результаты и обсуждение. Культивирование микроорганизмов проводили на питательных средах следующего состава: глюкоза - 0; 0,5; 5; 10; 15; 20 г; КН2РО4 - 0,1 г; MgSO4 - 0,1 г; СаСОз - 0,1 г; ШС1 - 0,1 г; мочевина - 0,5 г; отруби пшеничные - 10 г.
Инкубирование проводили в течение 7 сут. После засева сразу определили количество полученных из пшеничных отрубей аминокислот по результатам формольного титрования, далее определение производили каждые сутки.
69
Расчет азота аминогрупп производили по количеству затраченной щелочи, исходя из ее нормальности. 1 мл №ОН (0,1 Н) соответствует 1,4 мг аминного азота.
Результаты формольного титрования внесены в табл. 1.
Таблица 1
Содержание аминного азота в зависимости от концентрации глюкозы в питательной среде и времени культивирования микроорганизмов
Время, сут Глюкоза, %
0 0,5 2,5 5 7,5 10
№ОИ, мл
0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
1 1,5 2,5 2,6 2,6 2,7 2,8
2 1,7 3,9 4,1 4,6 4,9 3,5
3 1,9 4,5 4,7 5,2 5,8 4,4
4 2,3 5,2 6,4 7,8 8,0 4,9
5 2,4 6,7 7,7 8,6 8,9 5,3
6 2,4 7,8 8,7 9,9 10,2 5,5
7 2,4 7,9 8,8 9,9 10,1 5,7
Аминогруппы, мг/мл
0 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7
1 2,1 3,5 3,64 3,64 3,78 3,92
2 2,38 5,46 5,74 6,44 6,86 4,9
3 2,66 6,3 6,58 7,28 8,12 6,16
4 3,22 7,28 8,96 10,92 11,2 6,86
5 3,36 9,38 10,78 12,04 12,46 7,42
6 3,36 10,92 12,18 13,86 14,28 7,7
7 3,36 11,06 12,32 13,86 14,14 7,98
По результатам в табл. 1 можно сделать вывод, что протеолитиче-ские ферменты хорошо действуют на добавленные в среды отходы. Разрушая белки до аминокислот, ферменты преобразуют белки в более доступную, легче усвояемую форму для потребления сельскохозяйственными животными. При добавлении глюкозы это происходит активнее.
Далее определяли протеолитическую активность в культуральных жидкостях на 3 сутки после начала культивирования.
Определение суммарной активности препарата производили в 1 мг белка.
Протеолитическую активность в культуральной жидкости определяли по формуле
70
(д - д )• м Ер , (1)
где Ер - протеолитическая активность (ПЕ); Б - оптическая плотность опытного раствора; Д - оптическая плотность контрольного раствора; М - объем культуральной жидкости, мл; У - объем вытяжки ферментного препарата, взятый для опыта, мл.
За единицу протеолитической активности (ПЕ) принимают количество фермента, которое за 1 мин при 37 °С катализирует переход в неосаждаемое 5 % ТХУ состояние такого количества казеина, которое содержит 1 мкМоль тирозина.
Результаты внесены в табл. 2.
Таблица 2
Протеолитическая активность в культуральной жидкости на 3 сут
Глюкоза, % Протеолитическая активность (ед. ПЕ) Глюкоза, % Протеолитическая активность, ед. ПЕ
0 13,75 5 25,5
0,5 24,8 7,5 25,7
2,5 25,1 10 26,1
Поскольку для дальнейших вычислений необходимо перевести параметры в моли, перевели количество аминокислот в количество тирозина для удобства расчетов. Молярная масса тирозина равна 181,19 г/моль. Данные представлены в табл. 3.
Таблица 3
Количество аминокислот, переведенных на тирозин во времени (выражено в М)
Время, сутки Глюкоза, %
0 0,5 2,5 5 7,5 10
0 0,00386 0,00386 0,00386 0,00386 0,00386 0,00386
1 0,01159 0,01931 0,02008 0,02008 0,02086 0,02163
2 0,01313 0,03013 0,03167 0,03554 0,03786 0,02704
3 0,01468 0,03477 0,03631 0,04017 0,04481 0,03399
4 0,01777 0,04017 0,04945 0,06027 0,06181 0,03786
5 0,01854 0,05176 0,05949 0,06644 0,06876 0,04095
6 0,01854 0,06026 0,06722 0,07649 0,07881 0,04249
7 0,01854 0,6104 0,06799 0,07649 0,07803 0,04404
По полученным данным построили кинетическую кривую накопления продукта реакции.
71
0,09 ° -"~0'5
0
0 12 3 4 5 6 7
Время, сут
Рис. 2. Полная кинетическая кривая накопления продукта реакции
Приведем также график накопления продукта реакции (аминокислот) за вычетом значений, которые были получены для варианта среды без добавления глюкозы. Данные представлены в табл. 4 и на рис. 3.
Таблица 4
Количество аминокислот, переведенных на тирозин во времени с учетом образовавшихся аминокислот при глюкозе 0 % (выражено в М)
Время, сут Глюкоза, %
0,5 2,5 5 7,5 10
0 0 0 0 0 0
1 0,00772 0,00849 0,00849 0,00927 0,01004
2 0,01701 0,01854 0,02241 0,02473 0,01391
3 0,02009 0,02163 0,02549 0,03013 0,01931
4 0,03839 0,03168 0,04251 0,04404 0,02009
5 0,03322 0,04095 0,04792 0,05022 0,02241
6 0,04172 0,04868 0,05795 0,06027 0,02395
7 0,04253 0,04945 0,05797 0,05949 0,02551
Построили график для определения кинетических параметров и определили значения Кт(каж) и Ум для разных концентраций глюкозы в среде (рис. 4). Результаты представлены в табл. 5.
72
Рис. 3. Полная кинетическая кривая накопления продукта реакции (с учетом тирозина, образовавшегося при варианте среды без добавления глюкозы)
Рис. 4. График для определения кинетических параметров
Таблица 5
Кт(каж) и Ум для разных содержаний глюкозы в среде
Глюкоза, % Ум, моль/л Кт(каж), М
0 1,34 0,0049
0,5 5,87 0,0026
2,5 6,13 0,0026
5 6,16 0,0023
7,5 6,25 0,0022
10 4,98 0,0028
Таким образом, по результатам кинетических расчетов можно отметить, что Ум для разного количества глюкозы в среде имеет схожее
73
значение. Это говорит о том, что белок, добавленный в среду (пшеничные отруби), расщепляется до аминокислот примерно с одинаковой скоростью. Также это подтверждается значениями Кт, который свидетельствует о сродстве субстрата к клеткам и уменьшается с увеличением в составе глюкозы (чем меньше Кт, тем большее сродство возникает у фермента к субстрату). Однако при добавлении в среду достаточно большого количества глюкозы (10 %) наблюдается самая меньшая скорость реакции, из чего можно прийти к выводу, что произошло ингиби-рование и такое количество глюкозы критично сказалось на расщеплении. Следует отметить, при отсутствии глюкозы в среде аминокислоты образуются в малом количестве, что свидетельствует о том, что микроорганизмам необходим углеродный субстрат в среде для осуществления реакций расщепления белка (пшеничных отрубей) на аминокислоты.
Результаты расчетов использованы в дальнейших исследованиях, они говорят о том, что глюкоза может использоваться для ускорения и увеличения глубины процесса. Однако стоит рассмотреть, насколько это целесообразно с экономической точки зрения. По результатам экспериментов можно сказать, что добавлять в среду больше чем 0,5 % глюкозы не выгодно, поскольку выход нужного продукта изменяется в незначительных пределах.
Далее провели определение влагоемкости отрубей, насыщаемых культуральной жидкостью. Полную влагоемкость отрубей Ж в процентах вычисляли по формуле
где т - масса навески отрубей до высушивания, г; т1 - масса навески отрубей после высушивания, г.
Для анализа взяли 10 г отрубей.
Масса увлажненной навески отрубей т = 19,5156 г.
Масса навески после высушивания т1 = 8,4411 г.
Влажность отрубей, насыщенных жидкостью, Ж = 56,74 %.
По результатам эксперимента определили, что для полного смачивания 10 г отрубей необходимо 9,5 мл жидкости.
Содержание общего азота (Х) в пересчете на абсолютно сухое вещество в процентах вычисляли по формуле
(2)
т
(V - V) К X = -^--0 0014 -100%,
(3)
74
где У1 - объем 0,1 Н раствора NaOH, израсходованный на титрование 50 мл 0,1 Н раствора H2SO4 в контрольном (холостом) опыте, мл; У2 -объем 0,1Н раствора NaOH, израсходованный на титрование остатка H2SO4, не связанной с выделившимся аммиаком при его отгонке, мл; К - поправочный коэффициент к титру 0,1 Н раствора гидроокиси натрия; 0,0014 - количество азота, эквивалентное 1 мл точно 0,05 моль/л 0,1 Н раствора H2SO4 ; т - масса навески отрубей, г; Ж - влажность отрубей, %.
Содержание общего азота (Х) по результатам вычислений составило 13,3 %.
Для определения норм внесения кормовой добавки предварительно простерилизованные отруби пропитывали 5-суточной культу-ральной жидкостью, протеолитическая активность которой составила 44,9 ед. в 100 мл. Протеолитическая активность отрубей, высушенных при температуре 100 оС и пропитанных 5-суточной культуральной жидкостью, составила 0,026 ед./г отрубей 12 % влажности.
Выяснено, что в стерильных отрубях изначально не содержится протеолитических ферментов, а после того как их пропитывали культу-ральной жидкостью, они насыщались протеолитическими ферментами, продуцируемыми В^пЫИз.
Существует российский ферментный микробный препарат «Про-тосубтилин» Г3х, который является аналогом получаемой в данной работе кормовой добавки. «Протосубтилин» - это высушенная культу-ральная жидкость, порошок, насыщенный протеолитическими ферментами с заявленной протеолитической активностью 70 ед. на г. Норма внесения этого препарата в корма для сельскохозяйственных птиц составляет 70 г на 1 т отрубей. Такое малое количество затрудняет равномерное распределение по корму препарата. Можно рассчитать протеолитическую активность корма после добавления в него «Протосубтилина»:
70 г препарата - 70 ед., что соответствует в пересчете тонны на граммы 70 г/1000000 г, или 0,00007 г/г препарата.
Активность корма после добавления «Протосубтилина»: 0,00007г/г х 70 ед./г = 0,0049 ед/г.
В данной работе средняя протеолитическая активность полученной в результате экспериментов кормовой добавки составляет 0,025 ед. на 1 г отрубей. Также методом Серенсена в препарате определен амин-ный азот, который составляет 6,7 мг/мл. Если ориентироваться на аналог, то рекомендуемая норма внесения полученной микробной ферментной добавки 1 к 4, т.е. 1 часть добавки и 4 части ненасыщенных отрубей или другого корма [14].
75
На основе расчетных параметров и рекомендуемых литературными источниками материалов был спроектирован биореактор с мешалкой (рис. 5) для культуральной жидкости, используемой для обогащения пшеничных отрубей.
На основании полученных и экспериментальных данных была разработана технологическая схема получения кормовой добавки на основе бактерий Bacillus subtilis и отрубей для цели сбережения ресурсов в сельском хозяйстве (рис. 6) [15-19].
Рис. 6. Технологическая схема производства кормовой добавки: БР1 -биореактор; Е1 - емкость для отрубей; И1 - инокулятор; М1 - маточник; К1 -ленточный конвейер с зоной сушки; Н1, Н2 - насос; Ор1 - оросительное устройство; С1, С2 - стерилизатор; СМ1 - смеситель; Т1 - теплообменный аппарат; Х1 - холодильник; ЗК1, ЗК2, ЗКЗ, ЗК4 - задвижка
а
Рис. 5. Биореактор для ферментации
76
Таким образом, разработанный микробный протеолитический препарат может быть использован для переработки отходов зернового производства. А полученный в результате продукт может применяться в составе корма для сельскохозяйственных птиц. Протеолитическая активность полученной кормовой добавки 0,025 ед. на 1 г отрубей, что сопоставимо с подобным аналогом кормовой добавки «Протосубтилином». Определены нормы внесения препарата в корма для птиц. В сравнении с аналогами полученную добавку достаточно удобно вносить в корм.
Список литературы
1. Соколенко Г.Г., Лазарев Б.П., Миньченко С.В. Пробиотики в рациональном кормлении животных // Технологии пищевой и перерабатывающей промышленности АПК - продукты здорового питания. - 2015. - № 1. - С. 72-78.
2. Получение продукции птицеводства без антибиотиков с использованием перспективных программ кормления на основе пробиотических препаратов / В.И. Фисинин, И.А. Егоров, Г.Ю. Лаптев [и др.] // Вопросы питания. -2017. - Т. 86, № 6. - С. 114-124.
3. Малик Н.И., Панин А.Н. Ветеринарные пробиотические препараты // Ветеринария. - 2001. - № 1. - С. 46-51.
4. Бевзюк В.Н. Повышение использования белковых кормов растительного происхождения в мясном птицеводстве // Птица и продукты переработки. -
2003. - № 6. - С. 18-19.
5. Коновалов С.А. Биосинтез ферментов микроорганизмами. - М.: Пищевая промышленность, 1972. - 273 с.
6. Гамаюрова В.С., Зиновьева М.Е. Ферменты: лаб. практ. / Казан. гос. технол. ун-т. - Казань, 2010. - 272 с.
7. Концевая И.И. Микробиология: физиологические группы бактерий: практ. рук. для студ. спец. вузов / Гомел. гос. ун-т им. Ф. Скорины. - Чернигов: Десна Полиграф, 2017. - 40 с.
8. Желдакова Р.А. Выделение и идентификация микроорганизмов: учеб.-метод. пособие. - Минск: Изд-во БГУ, 2003. - 36 с.
9. 0ФС.1.2.3.0022.15 Определение аминного азота методами формоль-ного и йодометрического титрования. - М., 2015.
10. ГОСТ 20264.2-88. Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности. - М., 1988.
11. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. - М.: КолосС,
2004. - 296 с.
12. Березин И.В., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. - М.: Изд-во МГУ, 1976. - 292 с.
13. Виноградова А.В., Портнова А.В., Анашкина Е.Н. Основы биотехнологии: лаб. практ. - Пермь: Изд-во Перм. нац. исслед. политехн. ун-та, 2017. - 44 с.
14. Область применения протеолитического препарата «Протосубти-лин» [Электронный ресурс]. - URL: http://www.sibbio.ru/catalog/ptitsevodstvo/-protosubtilin/ (дата обращения: 01.04.2022).
77
15. ГОСТ 20680 - 2002. Аппараты с механическими перемешивающими устройствами. Общие технические условия. - М., 2002.
16. Иоффе И.Л. Проектирование процессов и аппаратов химической технологии: учеб. для техникумов. - Л.: Химия, 1991. - 352 с.
17. Васильцов Э.А., Ушаков В.Г. Аппараты для перемешивания жидких сред: справ. пособие. - Л.: Машиностроение. 1988. - 278 с.
18. ГОСТ 34233.2-2017. Сосуды и аппараты. Нормы и методы расчета на прочность. Расчет цилиндрических и конических обечаек, выпуклых и плоских днищ и крышек. - М., 2017.
19. Тимонин А.С. Основы конструирования и расчета химико-технологического и природоохранного оборудования: справ. - 2-е изд. - Калуга, 2002. -Т. 2. - 1030 с.
20. Мошев Е.Р. Математическое моделирование процессов и аппаратов химической технологии: метод. указания к выполнению лаб. работ / Перм. гос. техн. ун-т. - Пермь, 2006. - 52 с.
References
1. Sokolenko G.G., Lazarev B.P., Min'chenko S.V. Probiotiki v racional'nom kormlenii zhivotnyh [Probiotics in rational animal nutrition] Tehnologii pishhevoj I pererabatyvajushhej promyshlennosti APK - produkty zdorovogo pitanija. 2015. no. 1. pp. 72-78.
2. Fisinin V.I., Egorov I.A., Laptev G.Ju. i dr. Poluchenie produkcii pticevodstva bez antibiotikov s ispol'zovaniem perspektivnyh program kormlenija na osnove pro-bioticheskih preparatov [Obtaining antibiotic-free poultry products using advanced pro-biotic-based feeding programs] Vopr. pitanija. 2017. Vol. 86, no. 6. pp. 114-124.
3. Malik N.I., Panin A.N. Veterinarnye probioticheskie preparaty [Veterinary probiotic preparations] Veterinarija. 2001, no. 1. pp. 46-51.
4. Bevzjuk V.N. Povyshenie ispol'zovanija belkovyh kormov rastitel'nogo proishozhdenija v mjasnom pticevodstve [Increasing the use of vegetable protein feeds in poultry meat] Ptica i produkty pererabotki. 2003, no. 6. pp.18-19.
5. Konovalov S.A. Biosintez fermentov mikroorganizmami [Biosynthesis of enzymes by microorganisms]. M., «Pishhevaja promyshlennost'», 1972. 273 p.
6. Gamajurova V.S., Zinov'eva M.E. Fermenty: laboratornyj praktikum [Enzymes: laboratory workshop] / Feder. Agenstvo po obrazovaniju, Kazan. gos. tehnolog. un-t.- Kazan': KGTU, 2010. 272 p.
7. Koncevaja I.I. Mikrobiologija: fiziologicheskie gruppy baktreij. Praktich-eskoe rukovodstvo dlja stud. spec. vuzov [Microbiology: physiological groups of bacteria. A practical guide for students. special universities] / M-vo obrazovanija RB, Gomel'skij gos.un-t im. F. Skoriny. - Chernigov: Desna Poligraf, 2017. 40 p.
8. Zheldakova R.A. Vydelenie I identifikacija mikroorganizmov [Isolation and identification of microorganisms]: Ucheb.-metod. posobie - Mn.: BGU, 2003, 36 p.
9. 0FS.1.2.3.0022.15 Opredelenie aminnogo azota metodami formol'nogo I jodometricheskogo titrovanija [Determination of amine nitrogen by formol and io-dometric titration methods]. Moscow, 2015.
78
10. GOST 20264.2-88. Preparaty fermentnye. Metody opredelenija proteolit-icheskoj aktivnosti [Enzyme preparations. Methods for determining proteolytic activity]. Moscow, 1988.
11. Birjukov V.V. Osnovy promyshlennoj biotehnologii [Fundamentals of industrial biotechnology] / V.V. Birjukov. Moscow. KolosS. 2004. 296 p.
12. Berezin I.V, Prakticheskij kurs himicheskoj I fermentativnoj kinetiki [Practical course of chemical and enzymatic kinetics]. I.V. Berezin, A.A. Klesov. Moscow. MGU. 1976. 292 p.
13. Vinogradova A.V., Portnova A.V., Anashkina E.N. Osnovy biotehnologii: laboratornyj praktikum [Fundamentals of biotechnology: laboratory workshop]. Perm': Izd-vo Perm. nac. issled. politeh. un-ta, 2017. 44 p.
14. Oblast' primenenija proteoliticheskogo preparata «Protosubtilin» [Scope of the proteolytic drug "Protosubtilin"] [Jelektronnyj resurs]. - Rezhim dostupa http://www.sibbio.ru/catalog/ptitsevodstvo/protosubtilin/, svobodnyj (01.04.2022).
15. GOST 20680. -2002. Apparaty s mehanicheskimi peremeshivajushhimi ustrojstvami. Obshhie tehnicheskie uslovija [Apparatus with mechanical agitators. General specifications]. Moscow, 2002.
16. Ioffe I.L. Proektirovanie processov I apparatov himicheskoj tehnologii: ucheb. Dlja tehnikumov [Design of processes and apparatuses of chemical technology: textbook for technical schools]. L.: Himija. 1991. 352 p.
17. Vasil'cov Je. A., Ushakov V.G. Apparaty dlja peremeshivanija zhidkih sred: spravochnoe posobie [Apparatus for mixing liquid media: a reference guide]. L.: Mashinostroenie. 1988. 278 p.
18. GOST 34233.2-2017. Sosudy I apparaty. Normy I metody rascheta na prochnost'. Raschet cilindricheskih I konicheskih obechaek, vypuklyh I ploskih dnishh I kryshek [Vessels and devices. Norms and methods for calculating strength. Calculation of cylindrical and conical shells, convex and flat bottoms and covers]. Moscow, 2002.
19. Timonin A. S. Osnovy konstruirovanija I rascheta himiko -tehnolog-icheskogo I prirodoohrannogo oborudovanija, 2 izd [Fundamentals of design and calculation of chemical-technological and environmental equipment] - Kaluga. 2002, vol. 2. 1030 p.
20. Moshev E.R. Matematicheskoe modelirovanie processov I apparatov himicheskoj tekhnologii: Metod. ukazaniya k vypolneniyu laboratornyh rabot [Mathematical modeling of processes and apparatuses of chemical technology: Guidelines for laboratory work]. Perm. goc. tekhn. un-t. Perm', 2006. 52 p.
Об авторах
Анашкина Инесса Игоревна (Пермь, Россия) - магистрант кафедры «Химия и биотехнология» Пермского национального исследовательского политехнического университета (614990, г. Пермь, Комсомольский пр., 29; e-mail: korolevainessa0@gmail.com).
79
Портнова Анна Владимировна (Пермь, Россия) - кандидат химических наук, доцент кафедры «Химия и биотехнология» Пермского национального исследовательского политехнического университета (614990, г. Пермь, Комсомольский пр., 29, e-mail: annysky2002@mail.ru).
Кравцова Елена Вадимовна (Пермь, Россия) - студентка бакалавриата кафедры «Химия и биотехнология» Пермского национального исследовательского политехнического университета (614990, г. Пермь, Комсомольский пр., 29; e-mail: kravhelen457@gmail.com)
About the authors
Inessa I. Anashkina (Perm, Russian Federation) - Undergraduate student of the Department of Chemistry and Biotechnology, Perm National Research Polytechnic University (29, Komsomolsky av., Perm, 614990, e-mail: korolevain-essa0@gmail.com).
Anna V. Portnova (Perm, Russian Federation) - Candidate of Chemical Sciences, Associate Professor of the Department of Chemistry and Biotechnology, Perm National Research Polytechnic University (29, Komsomolsky av., Perm, 614990, e-mail: annysky2002@mail.ru).
Elena V. Kravtsova (Perm, Russian Federation) - undergraduate student of the Department of Chemistry and Biotechnology, Perm National Research Polytechnic University (29, Komsomolsky av., Perm, 614990, e-mail: kravhelen457@gmail.com).
Поступила: 02.02.2023
Одобрена: 15.05.2023
Принята к публикации: 30.05.2023
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов равноценен.
Просьба ссылаться на эту статью в русскоязычных источниках следующим образом:
Анашкина, И.И. Получение микробных протеолитических препаратов для переработки отходов зернового производства / И.И. Анашкина, Е.В. Кравцова, А.В. Портнова // Вестник ПНИПУ. Химическая технология и биотехнология. - 2023. - № 2. - С. 64-80.
Please cite this article in English as:
Anashkina I.I., Kravtsova E.V., Portnova A.V. Obtaining microbial proteolitic preparations for recycling grain productionwaste. Bulletin of PNRPU. Chemical Technology and Biotechnology, 2023, no. 2, pp. 64-80 (In Russ).
