CC BY
48
УДК 635.656:581.19
© С. В. Бобков, Т. Н. Селихова
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт зернобобовых и крупяных культур»
Проведены скрещивания сортов культурного вида гороха с широким набором образцов дикого вида p. fulvum. В комбинации Р. sativum х p. fulvum все полученные семена были развитыми и гибридными. Скрещивания p. fulvum х Р. sativum приводили к формированию семян с невыполненными зародышами. Получение гибридов p. fulvum х Р. sativum подтверждено с использованием биохимических и морфологических маркеров. В культуре in vitro незрелых 8-дневных зародышей p. fulvum (И592589) х Р. sativum (сорт Аист) получены растения-ре-генеранты. У отдельных образцов дикого вида p. fulvum обнаружен уникальный белковый компонент 7, который отсутствовал в электрофо-ретических спектрах культурного гороха. В результате гибридологического анализа определено наследование компонента 7 как моногенное и доминантное.
C Ключевые слова: горох; Pisum fulvum; межвидовая гибридизация; белки семян; интрогрессия.
Поступила в редакцию 13.03.2015 Принята к публикации 12.08.2015
получение межвидовых гибридов для интрогрессивной селекции гороха
ВВЕДЕНИЕ
Горох (Pisum sativum L.) является важной зернобобовой сельскохозяйственной культурой умеренного климата. Селекция гороха на высокую и стабильную урожайность, устойчивость к биотическим и абиотическим стрессорам, высокое содержание и качество запасных белков является основным условием повышения конкурентоспособности культуры (Ali et al., 1994; Бобков, Уварова, 2010).
Молекулярно-генетические исследования выявили парадоксально узкий генетический базис современных сортов гороха (Baranger et al., 2004). Вовлечение в селекционный процесс новых аллелей хозяйственно-ценных признаков дикорастущего гороха позволит повысить генетическое разнообразие исходного материала для селекции новых сортов (Ellis, 2011; Smykal et al., 2011). Существуют два пути переноса полезных генов (аллелей) в элитные селекционные линии гороха — генетическая инженерия и интрогрессия из геномов диких родичей (Ellis, 2011). Генетическая инженерия является дорогим и недостаточно разработанным на горохе методом. Межвидовая гибридизация приводит к интрогрессии как полезных, так и нежелательных для коммерческих сортов генов. Поэтому при интрогрессии генов интереса следует принять меры по блокировке переноса нежелательного генетического материала. Использование беккроссов с сортами и элитными селекционными линиями способствует селективной интрогрессии ценных генов. Указанные стратегии переноса генетического материала не являются исключительными и имеют перспективу для комбинированного использования.
Вид P. fulvum среди дикорастущих родичей гороха является важным источником новых аллелей хозяйственно-ценных признаков. Размер генома у вида P. fulvum составляет 108,9 % от Р. sativum (Baranyi et al., 1996). Этот вид интересен для использования в селекции гороха на устойчивость к болезням, вредителям и абиотическим стрессорам (засуха, экстремальные температуры) (Ochatt et al., 2004; Byrne et al., 2008; Clement et al., 2009). Корни растений P. fulvum проникают в почву с высокой скоростью на большую глубину (Ali et al., 1994).
Из литературных источников известно, что межвидовая гибридизация гороха сталкивается с проблемой репродуктивной несовместимости (Ben-Ze'ev, Zohary, 1973; Bogdanova, Kosterin, 2007) и отличается низкой эффективностью скрещиваний (Ochatt et al., 2004).
Значительная филогенетическая дивергенция между видами P. sativum и P. fulvum проявляется в достаточно сильной репродуктивной изоляции (Ben-Ze'ev N., Zohary D., 1973; Ellis, 2011; Smykal et al., 2011; Zaytseva et al., 2012). Если в скрещиваниях Р. sativum х P. fulvum возможно получение гибридов (Ochatt et al., 2004; Byrne et al., 2008; Fondevilla et al., 2010; Бобков, Лазарева, 2012), то в обратном направлении гибридизация сталкивается с выраженной несовместимостью. В научной литературе сообщается как о получении нежизнеспособных семян (Ben-Ze'ev N., Zohary D., 1973) так и об одном гибридном растении, полученном в результате проведения 100 скрещиваний (Bogdanova, Kosterin, 2007).
Несмотря на определенные успехи в интрогрессии генов устойчивости P. fulvum в геном культурного вида (Fondevilla et al., 2010), репродуктивная изоляция ограничивает использование межвидовых гибридов в селекции
гороха. Преодоление барьеров межвидовой несовместимости является первостепенной и важной задачей (Ochatt et al., 2004).
Исходя из того, что разные гены интереса могут находиться в различных образцах P. fulvum (Byrne et al., 2008; Fondevilla et al., 2010) исследование межвидовой несовместимости необходимо проводить с учетом генетического разнообразия дикорастущего вида. Эту работу можно совместить с поиском и идентификацией образцов, которые являются источниками хозяйственно-ценных признаков.
Цель работы состояла в исследовании особенностей межвидовой гибридизации гороха с использованием широкого набора образцов дикорастущего вида для создания инт-рогрессивных линий Р. sativum с включениями части генома P. fulvum в качестве источника новых генов и аллелей хозяйственно-ценных признаков. Проведена идентификация гибридов и уникального генетического материала P. fulvum с использованием электрофоретических спектров белков семян.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В экспериментах использовали сорта Р. sativum ssp. sativum: Стабил (af, безлисточковый морфотип),
Межвидовая гибридизация гороха (2012, 2013 гг.)
Аист (листочковый морфотип) и линию ВИ 9402 (tl, акациевидный морфотип), а также образцы P. fulvum К2523, К6070, И592573, И582583, И592575, И592577, И592579, И592589, И582593, И592595, И592597, И592598, И592602, И592603, И592608, И592609, И592612, И592615, И592619, И592626, И592881, И609881, И609884 из мировой коллекции ВИР (табл. 1). Межвидовую гибридизацию гороха проводили в июне-июле 2012 и 2013 гг. в условиях тепличного бокса по реципрокной схеме. В направлениях Р. sativum х P. fulvum и P. fulvum х Р. sativum проведено 61 и 25 скрещиваний соответственно. Коэффициент корреляции между числом образцов P. fulvum, используемых в разных направлениях скрещиваний, равнялся 0,45 (p < 0,05).
Для культивирования изолированных семяпочек и зародышей in vitro в направлении P. fulvum х Р. sativum проводили дополнительные скрещивания. По одному скрещиванию проведено в комбинациях И592595 х Стабил, И592583 х Стабил, И592602 х Стабил, И592612 х Стабил, И592589 х Аист, К2523 х Стабил. По три скрещивания проведены в комбинациях К6070 х Стабил и К2523 х Стабил, а в комбинации К2523 х Аист — 6 скрещиваний. В обратных комбинациях Стабил х К6070 и Стабил х К2523 проведено по одному скрещиванию.
Таблица 1
№п/п Образцы P. fulvum P. sativum х P. fulvum P. fulvum х P. sativum
Стабил Аист Сумма Стабил Аист Сумма
1 К2523 2* -** 2 9 - 9
2 К6070 5 - 5 5 - 5
3 И582583 - - - 2 - 2
4 И592573 1 - 1 3 - 3
5 И592575 - - - 1 - 1
6 И592577 - - - 1 - 1
7 И592579 - 3 3 - 2 2
8 И592589 2 3 5 - 4 4
9 И582593 - 2 2 - 2 2
10 И592595 1 - 1 - 2 2
11 И592597 - - - 1 - 1
12 И582598 - 1 1 2 4 6
13 И592602 - - - 1 3 4
14 И592603 1 1 2 2 4 6
15 И592608 1 - 1 - - -
16 И592609 - - - - 1 1
17 И592612 - - - 1 - 1
18 И592615 - 1 1 - 1 1
19 И592619 - - - 2 - 2
20 И592626 - - - 1 - 1
21 И592881 1 - 1 - - -
22 И609881 - - - 6 - 6
23 И609884 - - - - 1 1
ВСЕГО 14 11 25 37 24 61
* — количество опыленных цветков; ** — скрещивания не проводили
Таблица 2
Результативность межвидовой гибридизации гороха
Направление скрещивания Число цветков Бобы Семена
Число Число на одно скрещивание Число Число на одно скрещивание Число семян в 1 бобе
P. sativum х P. fulvum 25 9 0,36 ± 0,1 20 0,8 ± 0,08 2,22
P. fulvum х P. sativum 61 4 0,07 ± 0,03** 13 0,21 ± 0,05*** 3,25
** — различия существенны с вероятностью ошибки р = 0,005; *** — различия существенны с вероятностью ошибки р = 0,001
Изолированные семяпочки и зародыши, полученные в результате межвидовых скрещиваний, высаживали на агаризованные питательные среды для инициации морфогенного каллусогенеза, длительного субкультивирования регенерирующих каллусных тканей и получения растений-регенерантов (Bobkov, 2014). Семяпочки выделяли и высаживали на питательные среды в возрасте 4 — 6 суток. В комбинациях скрещивания К2523 х Аист и И592589 х Аист изолировали незрелые зародыши в возрасте 8 суток.
При сравнении результативности скрещиваний в направлениях P. fulvum х p. sativum и Р. sativum х P. ful-vum учитывали число бобов и семян (в абсолютных значениях и пересчете на одно скрещивание), а также среднее число семян в 1 бобе (Kosterin, Bogdanova, 2014).
Межвидовые гибриды идентифицировали по элек-трофоретическим спектрам индивидуальных семян и морфологическим маркерам вегетирующих растений.
Для выделения и электрофоретического разделения белков семян в полиакриламидном геле применяли стандартный арбитражный метод ISTA (Конарев, 2000). Белки экстрагировали из муки в течение 20 часов при температуре 3—4 °С с помощью электродного буфера (ТРИС, глицин, додецил сульфат натрия), рН = 8,3. После центрифугирования 10 мкл экстракта переносили в ячейку планшетки, где смешивали с равным объемом буфера нанесения (додецил сульфат натрия, ТРИС-НС1, глицерин, p-меркаптоэтанол, бромфеноло-вый синий). Электрофорез проводили в полиакриламид-ном геле с использованием камеры для вертикального электрофореза VE-4 (Хеликон, Россия). Концентрация разделяющего геля — 12,5 %, концентрирующего — 5 %.
Для идентификации уникальных компонентов P. fulvum использовали маркеры молекулярной массы 6,5-200 кДа (SIGMA-ALDRICH, США) (Shand et al., 2007). Анализ наследования белкового компонента 7 в электрофоретических спектрах проводили с использованием 19 семян гибридов F2.
Оценку существенности различий проводили с использованием критерия Стьюдента (Доспехов, 1985).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Результативность скрещиваний
В наших опытах результативность гибридизации при использовании P. fulvum в качестве материнского компонента скрещивания была ниже, чем в обратной комбинации. В направлении Р. sativum х p. fulvum из 25 опыленных цветков были сформированы 9 бобов, которые в сумме содержали 20 семян (табл. 2). Число сформированных бобов и семян в пересчете на одно скрещивание равнялись 0,36 и 0,80 соответственно. В направлении скрещивания P. fulvum х Р. sativum в результате 61 скрещивания получили 4 боба и 13 семян. Число бобов и семян в пересчете на одно скрещивание равнялись 0,07 и 0,21 соответственно. Различия по числу сформированных бобов и семян между этими направлениями скрещиваний были статистически значимыми (p = 0,005 — 0,001). В направлениях скрещиваний P. fulvum х Р. sativum и Р. sativum х P. fulvum среднее число семян в бобе составило 3,25 и 2,22 соответственно.
Выявлены результативные комбинации скрещивания. В направлении скрещиваний Р. sativum х P. fulvum семена были получены в комбинациях: Стабил х К2523, Стабил х К6070, Стабил х И592589, Стабил х И592595, Стабил х И592603, Аист х И592579, Аист х И582598. В направлении P. fulvum х Р. sativum семена получены в комбинациях: И592577 х Стабил, И692603 х Ста-бил, И582593 х Аист, И592602 х Аист (табл. 3). Результативные скрещивания в этом направлении приводили к формированию бобов с неразвитыми семенами. В комбинации И592577 х Стабил получили одно выполненное семя, которое оказалось жизнеспособным. Вегетирую-щее растение F1 И592577 х Стабил отличалось хорошим развитием (рис. 1).
В культуре in vitro изолированных 8-дневных зародышей комбинации скрещивания И592589 х Аист получены морфогенные каллусы, регенерирующие каллусные ткани и растения-регенеранты.
Идентификация межвидовых гибридов Ft гороха по компонентному составу белков электрофорети-ческих спектров
Индивидуальные семена гороха, полученные в результате межвидовых скрещиваний в комбинациях Ста-
Таблица 3
результативные комбинации скрещиваний и идентификация гибридов
№п/п Комбинация Число опыленных цветков Число бобов Число семян в бобе Идентификация гибридов
P. sativum х P. fulvum
1 Стабил х К2523 2 1 3 Анализ не проводили
2 Стабил х К6070 5 3 2 + 1 + 1 = 4 Анализ не проводили
3 Стабил х И592589 2 1 1 Анализ не проводили
4 Стабил х И592595 1 1 3 SDS-PAGE: все гибриды
5 Стабил х И592603 1 1 7 SDS-PAGE: все гибриды
6 Аист х И592579 3 1 1 Анализ не проводили
7 Аист х И582598 1 1 1 Анализ не проводили
P. fulvum х P. sativum
Получено вегетирующее
1 И592577 х Стабил 1 1 1 растение, идентифицировано как гибрид по красным цветкам и зубчатому краю прилистников
2 И692603 х Стабил 1 1 4 SDS-PAGE: отсутствие спектров
3 И582593 х Аист 2 1 2 SDS-PAGE: слабо выраженные компоненты спектров
4 И592602 х Аист 3 1 6 SDS-PAGE анализ белков 1 семени:
гибрид
рис. 1. Вегетирующее растение межвидового гибрида F1 И592577 х Стабил с зубчатым краем прилистников
Г
12345678 9
рис. 2. Электрофоретический анализ белков индивидуальных семян родителей и гибридов F1 в комбинации скрещивания Стабил х И592603. Электрофоретические спектры: 1 — образец Р. ^Ьыт И592603; 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 — гибриды F1, 9 сорт Стабил. В спектрах гибридов F1 правыми стрелками обозначены белковые компоненты образца И592603, а левыми — сорта Стабил
бил х И592603, Стабил х И592595, И592603 х Стабил, И582593 х Аист, И592602 х Аист подвергали электро-форетическому анализу (табл. 3). Полученные белковые спектры сравнивали со спектрами семян родителей.
В комбинации скрещивания Стабил х И592603 анализировали спектры белков 7 индивидуальных семян предполагаемых гибридов (рис. 2). Во всех спектрах присутствовали белковые компоненты сорта Стабил и отцовского компонента скрещивания — образца дико-
Рис. 3. Электрофоретический анализ белков индивидуальных семян родителей и потомства, полученного в результате скрещивания в комбинации И582593 х Аист. Электрофоретические спектры: 1 — образец P. fulvum И582593; 2, 3 — семена, полученные в результате гибридизации И582593 х Аист; 4 — сорт Аист. Невыполненные семена содержали зародыши с недостаточным для электрофоретического анализа количеством белков (спектры 2 и 3)
растущего вида P. fulvum И592603. Наличие в спектрах белковых компонентов обеих родителей служило индикатором гибридной природы полученных семян. В комбинации Стабил х И592595 анализировали спектры 3 индивидуальных семян предполагаемых гибридов. Во всех спектрах анализ выявил уникальные компоненты сорта Стабил и образца P. fulvum И592595 (рис. 4). Следовательно, все полученные семена были гибридными.
В направления скрещиваний P. fulvum х P. sativum наблюдали формирование невыполненных семян. В комбинации И692603 х Стабил сформированы 4 семени, которые практически не содержали зародышей. Электрофоретический анализ показал отсутствие спектров. Два семени, полученные в комбинации скрещивания И582593 х Аист, также были невыполненными. Однако электрофоретический анализ выявил наличие спектров из наиболее многочисленных белков (рис. 3). Недостаточное количество белков не позволило провести сравнительный анализ полиморфных компонентов, необходимый для идентификации гибридов.
В комбинации И592602 х Аист получили 6 семян (табл. 3). Одно семя было практически выполненным, а остальные 5 не содержали полноценных зародышей.
Рис. 4. Электрофоретический анализ белков индивидуальных семян родителей и гибридов F1 в комбинациях скрещивания Стабил х И592595 и И592602 х Аист. Электрофоретические спектры: 1, 2 — сорт Стабил; 3, 4, 5 — гибриды F1 Стабил х И592595; 6, 7, 8 — образец P. fulvum И592595; 9, 10 — образец P. fulvum И592602; 11 — гибрид F1 И592602 х Аист; 12 — сорт Аист. В спектре 3 правыми стрелками обозначены белковые компоненты образца И592595, а левыми — сорта Стабил. В спектре 11 правыми стрелками обозначены компоненты сорта Аист, а левыми образца P. fulvum И592602
Электрофоретический анализ белков сформированного семени выявил наличие в спектре 5 уникальных белковых компонентов сорта Аист (рис. 4). В спектре также присутствовали компоненты образца P. fulvum И592602, что позволило идентифицировать полученное семя как гибрид F1.
Вегетирующее растение, полученное в комбинации скрещивания И592577 х Стабил, характеризовалось красными цветками и зубчатым краем прилистников, что свидетельствовало о его гибридной природе (рис. 1). Примечательно, что венчики цветков в бутонах первоначально имели светло-желтую окраску, а к моменту раскрытия приобретали красную пигментацию.
Идентификация и интрогрессия генов уникальных белков P. fulvum
При проведении сравнительного анализа электро-форетических спектров белков семян большое значение имеет поиск и идентификация уникальных компонентов у образцов дикорастущего вида P. fulvum, которые отсутствуют в спектрах сортов и линий культивируемого гороха Р. sativum. Уникальные белковые компоненты P. fulvum могут представлять белки, играющие важную роль в устойчивости растений к вредителям и болезням, а также служить маркерами генов хозяйственно-ценных признаков.
Ранее в наших исследованиях был обнаружен белковый компонент 7 (нумерация проведена по репер-ным компонентам спектра сои), который отсутствовал у сортов и линий гороха и являлся уникальным для образца P. fulvum И509881. Было показано, что этот
Рис. 5. Электрофореграмма запасных белков родителей и межвидовых гибридов F2 ВИ 9402 (Р. sativum) х И609881 (P. fulvum). Электрофоретические спектры: 1 — сорт сои Ланцетная; 2, 3, 4 — образец И609881; 5, 6, 7 — линия ВИ 9402; 8 — маркеры молекулярной массы (SIGMA-ALDRICH, USA); 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 — спектры гибридов F2. Стрелками в спектрах ВИ 9402 и гибридов F2 обозначен компонент 7 (—110 кДа)
компонент наследовался в F1 в гибридных комбинациях 109 б х И609881, Стабил х И609881 (Бобков, Лазарева, 2012). Позднее компонент 7 был обнаружен в электрофо-ретических спектрах образцов P. fulvum К2523 и К6070, а также образца P. sativum sp. transcaucasicum К296.
Для определения наследования компонента 7 проводили гибридизацию растений образца акациевидной формы гороха ВИ 9402 с образцом И509881. В результате скрещиваний были получены гибриды F1 и F2. Элек-трофоретическому анализу подвергали запасные белки индивидуальных семян гибридов F1 и F2. Компонент 7 присутствовал в спектрах всех гибридных семян F1. В спектрах 19 семян гибридов F2 наблюдали генетическое расщепление по этому компоненту (рис. 5). Фенотипы с наличием и отсутствием компонента 7 распределялись в соотношении 13 : 6. В соответствии с гипотезой моногенного доминантного наследования теоретическое расщепление соответствует отношению 3 : 1. Фактически расщепление составило 2,2 : 1. Сравнение результатов по критерию х2 выявило совпадение фактического и теоретического расщеплений (х2 факт = 0,44; х205 = 3,84). Следовательно, наследование компонента 7 является моногенным и доминантным.
ОБСУЖДЕНИЕ
Существуют различные методы переноса нового генетического материала в селекционные линии — генетическая инженерия и межвидовая гибридизация. Генетическая инженерия является дорогостоящим и недостаточно разработанным на горохе методом (Ellis, 2011). Межвидовая гибридизация приводит к созданию материала, мало пригодного для использования в селекции вследствие параллельного переноса хозяйственно-ценных и нежелательных генов (аллелей). Методы маркерной селекции с использованием линий культурного гороха в качестве рекуррентных родителей при возвратных скрещиваниях способны создать интрогрессивные линии гороха с отсутствием нежелательных для селекции аллелей.
При проведении межвидовой гибридизации необходимо подтвердить факт получения межвидовых гибридов. Межвидовые гибриды идентифицировали по маркерным генам морфологических признаков, окраске цветков вегетирующих растений F1 (Byrne et al., 2008; Бобков, Лазарева, 2012), электрофоретическим спектрам изо-энзимов и генетическим маркерам (Ochatt et al., 2004). В наших опытах был использован метод, основанный на сравнении электрофоретических спектров индивидуальных семян родителей и гибридов. Он позволяет проводить идентификацию гибридов при отсутствии необходимости получения вегетирующих растений, а также при использовании нежизнеспособных семян. Дополнительно для идентификации гибридов использовали морфологические маркеры.
Известно, что для рода Pisum характерна репродуктивная изоляции таксонов. Например, описаны нарушения мейоза вследствие ядерно-цитоплазма-тической несовместимости у гибридов, полученных в результате скрещивания между образцами дикорастущего подвида elatius и культурного подвида sativum вида Р. sativum L. (Богданова, Галиева, 2009). Гибридизация гороха посевного (Р. sativum) с дикорастущим видом (P. fulvum) сталкивается с более выраженной репродуктивной несовместимостью (Ben-Ze'ev, Zohary, 1973). Из литературных источников известно, что межвидовые гибриды получали только в комбинациях скрещивания, в которых P. fulvum использовали в качестве отцовского компонента (Ochatt et al., 2004; Byrne et al., 2008; Бобков, Лазарева, 2012). При этом гибридизация не отличалась высокой результативностью (Ochatt et al., 2004). Использование P. fulvum в скрещиваниях в качестве отцовского компонента приводило к появлению нежизнеспособных проростков (Ben-Ze'ev, Zohary, 1973). Получение одного гибридного семени и вегетирующего растения стало возможным в результате проведения 100 скрещиваний в направлении P. fulvum х Р. sativum (Bogdanova, Kosterin, 2007). Использование ДНК маркеров пока-
зало, что все четыре полученные гибридные растения F2 содержали пластиды отцовского компонента скрещивания (Р. sativum).
В настоящих опытах средняя эффективность формирования бобов в направлении P. fulvum х P. sativum составила 7 %, что существенно (p = 0,005) меньше, чем при использовании P. fulvum в качестве отцовского компонента скрещивания (36 %). Существенные (p = 0,001) различия наблюдались и по числу полученных семян в пересчете на одно скрещивание в направлениях P. fulvum х P. sativum (0,21) и P. sativum х P. fulvum (0,8). Число семян в одном бобе в направлении P. fulvum х P. sativum равнялось 3,25, что было больше чем в обратной комбинации (2,22).
Если в направлении скрещиваний P. sativum х P. ful-vum все полученные семена были хорошо развитыми и гибридными, то в реципрокной комбинации наблюдали формирование невыполненных семян. В комбинации И592603 х Стабил полученные 4 семени практически не содержали зародышей (арест развития на ранних стадиях). Два семени, полученные в комбинации скрещивания И582593 х Аист, были невыполненными. Электрофоретический анализ выявил наличие спектров, но недостаточное количество белков (отсутствовали полиморфные компоненты) не позволило провести идентификацию продуктов гибридизации. Однако факт присутствия и разделения запасных белков в полиакри-ламидном геле (рис. 3) указывал на формирование и рост зародышей.
В комбинации скрещивания И592602 х Аист только одно из 6 сформированных семян характеризовалось наличием выполненного зародыша (табл. 3). Электрофоретический анализ белков этого семени подтвердил получение гибрида в направлении скрещивания P. fulvum х Р. sativum, где P. fulvum использовали в качестве материнского компонента (рис. 4).
Из литературных источников известно, что у гороха межвидовая гибридизация возможна при использовании P. fulvum в качестве отцовского компонента скрещиваний. Основной причиной репродуктивной несовместимости в комбинации P. fulvum х Р. sativum является отсутствие прорастания пыльцевых зерен Р. sativum на рыльцах пестиков P. fulvum (Ochatt et al., 2004). Получение гибридного семени можно объяснить тем, что в отдельных случаях пыльца прорастает и происходит оплодотворение.
Межвидовая гибридизация у зернобобовых культур сталкивается с пост-зиготической несовместимостью, что приводит к отмиранию зародышей на ранних стадиях развития. Для их спасения используют метод эмбриокультуры in vitro. Культивирование изолированных зародышей межвидовых гибридов на питательных средах рассматривается в качестве важного метода для осуществления интрогрессии генетического материала диких видов нута (Clarke et al., 2006). Метод эмбрио-
культуры in vitro успешно применяется в межвидовой гибридизации чечевицы (Suvorova, 2014).
Преодоление пост-зиготической несовместимости гороха с использованием метода эмбриокультуры особенно актуально в низко результативном направлении межвидовых скрещиваний P. fulvum х Р. sativum. В наших опытах к положительным результатам приводило культивирование in vitro изолированных 8-дневных зародышей гороха в комбинации скрещивания И592589 х Аист. В результате были получены морфогенные каллусные ткани и растения-регенеранты.
У межвидовых гибридов гороха P. fulvum х Р. sativum должны присутствовать митохондрии P. fulvum, которые, как известно, наследуются по материнской линии (Богданова, Галиева, 2009). Создание интрогрессивных линий гороха с митохондриальным геномом P. fulvum открывает новые возможности для генетических и физиологических исследований.
Отдельные образцы дикого вида P. fulvum характеризуются повышенной устойчивостью к вредителям и болезням (Byrne et al., 2008; Fondevilla et al., 2010). Поэтому весьма актуален вопрос, могут ли уникальные компоненты белков семян P. fulvum служить маркерами повышенной устойчивости к неблагоприятным факторам среды. Известно, что повышенная устойчивость к вредителям и болезням может поддерживаться уникальными изоформами липоксигеназ (Porta, Rocha-Sosa, 2002). Липоксигеназы обнаружены в зрелых и незрелых семенах, а также в вегетирующих органах гороха (Domoney et al., 1990).
Среди представителей вида P. fulvum обнаружены образцы, характеризующиеся наличием уникального компонента 7 с молекулярной массой белка —110 кДа. Этот белок на электрофоретических спектрах находится в непосредственной близости к двум основным изофор-мам липоксигеназы гороха с молекулярными массами ~90 и ~97 кДа (Casey et al., 1985). С использованием аффинной хроматографии у гороха выявлена изоформа липоксигеназы с молекулярной массой ~ 100 кДа (Domoney et al., 1990). Марганцевые липоксигеназы патогенного гриба Gaumannomyces graminis локализуются на электрофоретических спектрах в интервале 100—140 кДа (Su, Oliw, 1998).
Присутствие компонента 7 в смежной области с компонентами липоксигеназ гороха не является достаточным основанием считать белок ранее неизвестной изофор-мой. Определение принадлежности белка компонента 7 к липоксигеназам или другим белкам, а также изучение его функциональных свойств, требуют проведения дополнительных исследований.
Интрогрессия уникальных генов P. fulvum в геном культурного гороха с использованием белковых маркеров не имеет существенных технических ограничений для использования в селекции гороха. Для проведения элек-трофоретического анализа требуется небольшое коли-
чество белка, экстрагированного из одной семядоли или
её части. В результате проращивания второй семядоли
с почкой вырастает нормальное растение.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бобков С. В., Лазарева Т. Н. (2012) Компонентный состав электрофоретических спектров запасных белков межвидовых гибридов гороха. Генетика. Т. 48 (1): С. 56-61.
2. Бобков С. В., Уварова О. В. (2010) Растительный белок зернобобовых культур и перспектива получения белковых изолятов. Вестник РАСХН. № 6: С. 83-88.
3. Богданова В. С., Галиева Э. Р. (2009) Нарушения мейоза как проявление ядерно-цитоплазматической несовместимости при скрещивании подвидов посевного гороха. Генетика. Т. 45 (5): С. 711-716.
4. Доспехов Б. А. (1985) Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). М.: Агропромиздат.
5. Конарев В. Г. (2000) Идентификация сортов и регистрация генофонда культурных растений по белкам семян. СПб.: ВИР.
6. Ali S.M., Sharma B., Ambrose M. J. (1994) Current status and future strategy in breeding pea to improve resistance to biotic and abiotic stresses. Euphytica. V 73: P. 115-126.
7. Baranger A. G., Aubert G., Arnau G. et al. (2004) Genetic diversity within Pisum sativum using protein - and PCR based markers. Theorethical and Applied Genetics. V. 108: P. 1309-1321.
8. Baranyi M., Greilhuber J., Swiecicki W. K. (1996) Genome size in wild Pisum species. Theoretical and Applied Genetics. V 93: P. 717-721.
9. Ben-Ze'ev N., Zohary D. (1973) Species relationship in the genus Pisum L. Israel Journal of Botany. V. 22: P. 73-91.
10. Bobkov S. (2014) Obtaining calli and regenerated plants in anther cultures of pea. Czech Journal of Genetics and Plant Breeding. V. 50 (2): P. 123-129.
11. Bogdanova V. S., Kosterin O. E. (2007) Hybridization barrier between Pisum fulvum Sibth. et Smith and P. sativum L. is partly due to nuclear-chloroplast incompatibility. Pisum Genetics. V. 39: P. 8-9.
12. Byrne O. M., Hardie D. C., Khan T. N. et al. (2008) Genetic analysis of pod and seed resistance to pea weevil in a Pisum sativum х P. fulvum interspecific cross. Australian Journal of Agricultural Research. V. 59: P. 854-862.
13. Casey R., Domoney C., Nielsen N. C. (1985) Isolation of a cDNA clone for pea (Pisum sativum) seed lipoxy-genase. Biochem. J. V. 232: P. 79-85.
14. Clarke H. J., Wilson J. G., Kuo I., Lulsdorf M. M., Mal-likarjuna N., Kuo J., Siddique K. H. M. (2006) Embryo
rescue and plant regeneration in vitro of selfed chickpea (Cicer arietinum L.) and its wild annual relatives. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 85: 197—204.
15. Clement S. L., McPhee K. E., Elberson L. R., Evans M. A. (2009) Pea weevil, Bruchus pisorum L. (Coleoptera: Bruchidae), resistance in Pisum sativum x Pisum fulvum interspecific crosses. Plant Breeding. V. 128: 478-485.
16. Domoney C., Firmin J. L., Sidebottom C. et al. (1990) Lipoxygenase heterogeneity in Pisum sativum. Planta. V. 181: P. 35-43.
17. Ellis T. H. N. (2011) Pisum. In: C. Kole (ed.). Wild crop relatives: genomic and breeding resources, legume crops and forages. Berlin Heidelberg: Springer-Verlag; p. 237-248.
18. Fondevilla S., Cubero J. I., Rubiales D. (2010) Confirmation that the Er3 gene, conferring resistance to Erysiphe pisi in pea, is a different gene from er1 and er2 genes. Plant Breeding. V. 130 (2): P. 281-282.
19. Kosterin O.E, Bogdanova V S. (2014) Efficient of hand pollination in different pea (Pisum) species and subspecies. Indian J. Genet. V. 74 (1): P. 50-55.
20. Ochatt S. J., Benabdelmouna A., Marget P. et al. (2004) Overcoming hybridization barriers between pea and some of its wild relatives. Euphytica. V. 137: P 353-359.
21. Porta H., Rocha-Sosa M. (2002) Plant lipoxygenases. Physiological and molecular features. Plant Physiology. V. 130: P. 15-21.
22. Shand P. J., Ya H., Pietrasik Z., Wanasun-dara P. K. J.P. D. (2007) Physicochemical and textural properties of heat-induced pea protein isolate gels. Food Chemistry. V 102: P. 1119-1130.
23. Smykal P., Kenicer G., Flavell A. J. et al. (2011) Phy-logeny, phylogeography and genetic diversity of the Pisum genus. Plant Genetic Resources: Characterization and Utilization. V. 9 (1): P. 4-18.
24. Su C., Oliw E. H. (1998) Manganese lipoxygenase: characterization and purification. J. Biol. Chem. V. 273: P. 13072-13079.
25. Suvorova G. (2014) Hybridization of cultivated lentil Lens culinaris Medik. and wild species Lens tomento-sus Ladizinsky. Czech Journal of Genetics and Plant Breeding. V. 50: 130-134.
26. Zaytseva O. O., Bogdanova V. S., Kosterin O. E. (2012) Phylogenetic reconstruction at the species and in-traspecies levels in the genus Pisum (L.) (peas) using a histone H1 gene. Gene. V 504: P. 192-202.
OBTAINING OF INTERSPECIFIC HYBRIDS FOR PEA
INTROGRESSIVE BREEDING
Bobkov S. V., Selikhova T.N.
C SUMMARY: Background. Overcoming of reproductive isolation,
identification and transfer of agronomic value genes from wild rela-
tives into cultivated pea genomes is an important task for pea intro-gressive breeding. Materials and methods. Reciprocal hybridization of cultivated pea with wide set of P. fulvum accessions was conducted. Identification of hybrids was carried out with use of biochemical and morphological markers. Identification of unique protein was conducted with use of electrophoretic spectra of mature seeds. Results. Pea interspecific hybrids were obtained in two reciprocal directions of crosses. Cross efficiency in P. sativum x P. fulvum and P. fulvum x P. sativum combinations was 36 % and 7 %, respectively. All tested seeds in crosses P. sativum x P. fulvum were hybrids. Crosses in direction P. fulvum x P. sativum led to formation of puny seeds restricted in embryo growth. Protein markers of one seed derived in cross P. fulvum x P. sativum proved its hybrid nature. Morphological markers demonstrated that plant derived from another cross was also a hybrid. Culture of immature embryos was developed for recovering plants in interspecific crosses. Morphogenic calli and regenerated plants were obtained in culture of immature embryos P. fulvum (H592589) x P. sativum (Aest). Identification of unique protein 7 of P. fulvum was conducted. Inheritance of that protein was proved as monogenic dominant. Conclusion. Efficiency of hybridization in combination P. ful-vum x P. sativum was significantly less in compare to reciprocal one. All products of that cross combination were tested as hybrids. Unique protein 7 of P. fulvum was revealed as a result of mature seed electrophoretic spectra analysis. Inheritance of that protein was determined as monogenic dominant.
C KEY WORDS: pea; wild species; Pisum fulvum; interspecific hybridization; SDS-PAGE electrophoresis; embryo; storage protein; intro-gression; lipoxygenase.
C REFERENCES (TRANSLITERATED)
1. Ali S. M., Sharma B., Ambrose M. J. (1994) Current status and future strategy in breeding pea to improve resistance to biotic and abiotic stresses. Euphytica. V. 73: P. 115-126.
2. Baranger A. G., Aubert G., Arnau G. et al. (2004) Genetic diversity within Pisum sativum using protein - and PCR based markers. Theorethical and Applied Genetics. V. 108: P. 1309-1321.
3. Baranyi M., Greilhuber J., Swiecicki W K. (1996) Genome size in wild Pisum species. Theoretical and Applied Genetics. V. 93: P.717-721.
4. Ben-Ze'ev N., Zohary D. (1973) Species relationship in the genus Pisum L. Israel Journal of Botany. V. 22: P. 73-91.
5. Bobkov S. (2014) Obtaining calli and regenerated plants in anther cultures of pea. Czech Journal of Genetics and Plant Breeding. V. 50 (2): P. 123-129.
6. Bobkov S. V, Lazareva T. N. (2012) Band composition of electrophoretic spectra of storage proteins in interspecific pea hybrids. Russian Journal of Genetics. V. 48 (1): P. 47-52.
7. Bobkov S. V, Uvarova O. V. (2010) Rastitel'nyy belok zernobobovykh kul'tur i perspektiva polucheniya belk-ovykh izolyatov [Vegetable protein of grain legumes an perspective of protein isolates producing]. Vestnik RASKhN. N 6: S. 83-88.
8. Bogdanova V. S., Galieva E. R. (2009) Meiotic abnormalities as expression of nuclear-cytoplasmic incompatibility in crosses of Pisum sativum subspecies. Russian Journal of Genetics. V. 45 (5): P. 623-627.
9. Bogdanova V. S., Kosterin O. E. (2007) Hybridization barrier between Pisum fulvum Sibth. et Smith and P. sativum L. is partly due to nuclear-chloroplast incompatibility. Pisum Genetics. V. 39: P. 8-9.
10. Byrne O. M., Hardie D. C., Khan T. N. et al. (2008) Genetic analysis of pod and seed resistance to pea weevil in a Pisum sativum * P. fulvum interspecific cross. Australian Journal of Agricultural Research. V 59: P. 854-862.
11. Casey R., Domoney C., Nielsen N. C. (1985) Isolation of a cDNA clone for pea (Pisum sativum) seed lipoxy-genase. Biochem. J. V. 232: P. 79-85.
12. Clarke H. J., Wilson J. G., Kuo I., Lulsdorf M. M., Mal-likarjuna N., Kuo J., Siddique K. H. M. (2006) Embryo rescue and plant regeneration in vitro of selfed chickpea (Cicer arietinum L.) and its wild annual relatives Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 85: 197-204.
13. Clement S. L., McPhee K. E., Elberson L. R., Evans M. A. (2009) Pea weevil, Bruchus pisorum L. (Coleoptera: Bruchidae), resistance in Pisum sativum * Pisum fulvum interspecific crosses. Plant Breeding. V. 128: 478-485.
14. Domoney C., Firmin J. L., Sidebottom C. et al. (1990) Lipoxygenase heterogeneity in Pisum sativum. Planta. V. 181: P. 35-43.
15. Dospekhov B. A. (1985) Metodika polevogo opyta (s os-novami statisticheskoy obrabotki rezul'tatov issledo-vaniy) [Method of field experiment]. M.: Agropromizdat.
16. Ellis T. H. N. (2011) Pisum. In: C. Kole (ed.). Wild crop relatives: genomic and breeding resources, legume crops and forages. Berlin Heidelberg: Springer-Verlag; p. 237-248.
17. Fondevilla S., Cubero J. I., Rubiales D. (2010) Confirmation that the Er3 gene, conferring resistance to Erysiphe pisi in pea, is a different gene from er1 and er2 genes. Plant Breeding. V. 130 (2): P. 281-282.
18. Konarev V G. (2000) Identifikatsiya sortov i registratsi-ya genofonda kul'turnykh rasteniy po belkam semyan [Identification of varieties and registration of the geno-fond of cultivated plants by seed proteins]. SPb.: VIR.
19. Kosterin O.E, Bogdanova V. S. (2014) Efficient of hand pollination in different pea (Pisum) species and subspecies. Indian J. Genet. V. 74 (1): P. 50-55.
20. Ochatt S. J., Benabdelmouna A., Marget P. et al. (2004) Overcoming hybridization barriers between pea and some of its wild relatives. Euphytica. V. 137: P. 353-359.
21. Porta H., Rocha-Sosa M. (2002) Plant lipoxygenases. Physiological and molecular features. Plant Physiology. V. 130: P. 15-21.
22. Shand P. J., Ya H., Pietrasik Z., Wanasunda-ra P. K. J.P. D. (2007) Physicochemical and textural
properties of heat-induced pea protein isolate gels. Food Chemistry. V. 102: P. 1119-1130.
23. Smykal P., Kenicer G., Flavell A. J. et al. (2011) Phy-logeny, phylogeography and genetic diversity of the Pisum genus. Plant Genetic Resources: Characterization and Utilization. V. 9 (1): P. 4-18.
24. Su C., Oliw E. H. (1998) Manganese lipoxygenase: characterization and purification. J. Biol. Chem. V. 273: P. 13072-13079.
25. Suvorova G. (2014) Hybridization of cultivated lentil Lens culinaris Medik. and wild species Lens tomento-sus Ladizinsky. Czech Journal of Genetics and Plant Breeding. V. 50: 130-134.
26. Zaytseva O. O., Bogdanova V. S., Kosterin O. E. (2012) Phylogenetic reconstruction at the species and intraspecies levels in the genus Pisum (L.) (peas) using a histone H1 gene. Gene. V. 504: P. 192-202.
C Информация об авторах
Бобков Сергей Васильевич — к. сельскохоз. н., старший научный сотрудник, заведующий лабораторией физиологии и биохимии растений. ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт зернобобовых и крупяных культур» ФАНО России. 302502, Орловская обл., Орловский район, пос. Стрелецкий, ул. Молодежная, д. 10, корп. 1. E-mail: [email protected].
Селихова Татьяна Николаевна — к. б. н., старший научный сотрудник, лаборатория физиологии и биохимии растений. ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт зернобобовых и крупяных культур» ФАНО России,. 302502, Орловская обл., Орловский район, пос. Стрелецкий, ул. Молодежная, д. 10, корп. 1. E-mail: [email protected].
Bobkov Sergey Vasilevich — head of plant physiology and biochemistry laboratory, All-Russia Research Institute of Legumes and Groat Crops, Doctor of agriculture, senior scientist. 302502, Orlovskaya oblast, Orlovsky rayon, pos. Streletsky, Molodezhnaya St., 10, building 1, Russia. E-mail: [email protected].
Selikhova Tatyana Nikolaevna — Doctor of biology, senior scientist of plant physiology and biochemistry laboratory, All-Russia Research Institute of Legumes and Groat Crops, Doctor of agriculture. 302502, Orlovskaya oblast, Orlovsky rayon, pos. Streletsky, Molodezhnaya St., 10, building 1, Russia. E-mail: [email protected].
