CC BY
25
УДК 544.032+544.778.4
ПОЛУЧЕНИЕ КРИОХИМИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННОГО УЛЬТРАДИСПЕРСНОГО ПОРОШКА ДИОКСИДИНА И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЕГО АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ О.И. Верная*, В.П. Шабатин, А.М. Семенов, Т.И. Шабатина (кафедра химической кинетики; *e-mail: olga_vernaya@mail.ru)
Одним из способов повышения биодоступности и эффективности лекарственных веществ является уменьшение их частиц до наноразмеров и изменение их кристаллической структуры. Методом криохимического синтеза получена стабильная наноформа новой полиморфной модификации антибактериального препарата 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-К,№-диоксида (диоксидина), которая была охарактеризована методами газовой хроматографии, ЯМР, РФА, термоаналитическими методами (ТГ, ДТГ, ДСК) и ПЭМ. Новая полиморфная модификация диоксидина оказалась более активной к процессам подавления роста грамположительных M. cyaneum 98 и грамотрицательных E. coli 52 бактериальных штаммов, чем исходная фармакопейная модификация.
Ключевые слова: наночастицы, диоксидин, криохимическая модификация.
В настоящее время многие из лекарственных препаратов обладают низкими показателями биодоступности [1]. Одним из решений данной проблемы с точки зрения современной фармакологии является перевод этих соединений в наноформу. В данном случае рост поверхностной площади лекарственных средств способствует увеличению скорости их растворения. Биодоступность малорастворимых лекарственных веществ можно улучшить получением эмульсий и суспензий на основе наночастиц этих соединений.
Другим способом повышения биодоступности является получение новых полиморфных модификаций известных лекарственных препаратов. Полиморфизм - способность вещества в твердом состоянии существовать в разных полиморфных модификациях, каждая из которых имеет один и тот же химический состав, но различную кристаллическую структуру. Разные полиморфные модификации лекарственных веществ проявляют различные физико-химические и биофармакологические свойства. От того, в какой кристаллической модификации субстанция содержится в лекарственном препарате, зависят его стабильность, скорость растворения и эффективность. Полиморфизм кристаллических лекарственных препаратов обладает большим инновационным потенциалом, поэтому представляет большой интерес для фармацевтической индустрии [2, 3].
Среди методов получения кристаллических модификаций наиболее распространен метод пере-
кристаллизация из растворов [4, 5] и расплавов [6], в том числе с использованием растворителей в сверхкритических состояниях [7, 8]. Новые полиморфные модификации веществ получают также методом криохимической модификации, включающей испарение вещества в потоке нагретого газа-носителя с последующей конденсацией паров на поверхность, охлаждаемую до температуры кипения жидкого азота [9].
Цель настоящей работы - криохимический синтез ультрадисперсного порошка диоксиди-на (2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-К,№-диоксида) и определение антибактериальной активности полученного модифицированного лекарственного препарата. Диоксидин - синтетический антибактериальный препарат с выраженным бактерицидным типом действия, в основе которого лежит повреждение биосинтеза ДНК микробной клетки с глубоким повреждением структуры нуклеотида уже при внесении субингибирующих концентраций. Препарат эффективен в отношении широкого спектра штаммов бактерий [10, 11].
Экспериментальная химическая часть
Реагенты и методы исследования. Субстанцию диоксидина, соответствующую фармакопейной статье (ФС) 42-2308-97, использовали без дополнительной очистки. Диоксидин представляет собой желто-зеленое кристаллическое вещество, малорастворимое в воде (до 1 мас.% при 18-20 °С).
Синтез криомодифицированного диоксиди-
на. Водный раствор диоксидина (1-8 мас.%), нагретый до температуры 20-100 °С, замораживали жидким азотом и подвергали лиофильной сушке в течение 22-27 ч.
Для подтверждения идентичности состава, различий в кристаллической структуре и антибактериальной активности исходного фармакопейного и криомодифицированного диоксидина проведен комплекс физико-химических и биологических методов анализа.
Хроматографический анализ спиртовых растворов исходного фармакопейного и криомоди-фицированного диоксидина проводили на газовом хроматографе «КристаллЛюкс-4000» (Россия).
Спектры ядерного магнитного резонанса (ЯМР) исходного и полученного вещества снимали в насыщенном растворе в дейтерированной воде (D2O) на ЯМР-спектрометре высокого разрешения «VXR-400» фирмы «VARIAN» (США).
Рентгенофазовый анализ (РФА) образцов проводили на дифрактометре «Rigaku D/MAX-2500» (Япония) на CuKa-излучении (X = 1,54056 А).
Термоаналитические исследования проводили на термоанализаторе «STA 449 C Jupiter NETZSCH» (Германия) в токе аргона при повышении температуры 10 град/мин. В качестве держателей образцов использовали алюминиевые кюветы. Навески проб составляли 4,7-7,8 мг.
Микрофотографии криомодифицированного диоксидина получали методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) на электронном микроскопе «JSM 6380 LA» при увеличениях Х1000...20000.
Определение антибактериальной активности разных модификаций диоксидина осуществляли диско-диффузионным методом [12] с применением прессованных таблеток исходного и криомодифицированного диоксидина. В качестве тест культур использовали бактерии (бесспоровые грамотрицательные и грамположительные), полученные из коллекции культур кафедры микробиологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова: E. coli 52 и M. cyaneum 98. Эксперименты проводили в чашках Петри, 20 мл агаризованной питательной среды, подсушенной в течение суток (толщина слоя среды 4 мм). Измерение зон подавления роста (ЗПР) тест-культур роста проводили через 16 и 48 ч инкубации.
Результаты и их обсуждение
Первоначально методами ЯМР 1H и газовой хроматографии была установлена идентичность
химических формул исходного фармакопейного и криомодифицированного диоксидина.
Сходство спектров исходного диокси-
дина (Э20) 5: 4,93-5,21 (т, 4Н, 2СН2), 7,85-8,05 (т, 2Н, Н Аг), 8,38-8,52 (т, 2Н, Н Аг) и криомодифицированного препарата (Э20) 5: 4,95-5,25 (т, 4Н, 2СН2), 7,86-8,05 (т, 2Н, Н Аг), 8,35-8,50 (т, 2Н, Н Аг) подтверждает, что полученное вещество является диоксидином.
Значения хроматографического времени удерживания (?уд) исходной субстанции и полученного из нее вещества одинаковы и составляют 3,96 мин, что подтверждает идентичность их химических составов. В хроматограммах обеих модификаций диоксидина присутствуют только пики растворителя и диоксидина, что свидетельствует об отсутствии примесей в составе лекарственных веществ.
Для подтверждения того, что полученное вещество является новой кристаллической модификацией диоксидина, проведены РФА и термоаналитические исследования.
Сравнение рентгеновских дифрактограмм исходного диоксидина и полученного из него вещества (рис. 1) свидетельствует о том, что оно является новой кристаллической модификацией диоксидина, так как положение дифракционных максимумов и их интенсивности (/отн,%) для этого вещества (8,740 (100,0%), 8,026 (94,2%); 3,358 (99,3%); 3,304 (67,6%)) отличается от положения дифракционных максимумов и их интенсивности исходного диоксидина (8,638 (100,0%); 7,508 (68,4%); 3,299 (24,8%); 2,242 (16,8%)).
Данные термоаналитических исследований приведены на рис. 2. Кривые ДСК исходной субстанции диоксидина (рис. 3, а) и полученной из него новой кристаллической модификации диоксидина (рис. 3, б) различаются положением и величиной эндотермических эффектов плавления, а также экзотермических эффектов термического разложения. Для исходной субстанции диоксидина плавление происходит при температуре (175,5±0,5)°С с тепловым эффектом -(99,8±0,4) Дж/г, а термолиз протекает при температуре (199,2±0,5)°С с тепловым эффектом (1135±4) Дж/г. Для новой кристаллической модификации диоксидина плавление происходит при температуре (171,7±0,5)°С с тепловым эффектом -(38,8±0,4) Дж/г, а термолиз протекает при температуре (186,0±0,5)°С с тепловым эффектом (1243±4) Дж/г. Таким образом, проведенные термоаналитические эксперименты показали, что полученная новая кристаллическая модификация диоксидина более активна к про-
Рис.1. Рентгеновская дифрактограмма исходного (а) и криомодифицированного (б)
диоксидина
Рис. 2. Распределение частиц криомодифицированного диоксидина по размерам, построенное на основании данных ПЭМ (а) и микрофотография отдельных агрегатов криомодифицированного образца (б)
Рис. 3. Термоаналитические исследования исходного (а) и криомодифицированного (б) диоксидина
цессам плавления и термического разложения. Кроме того, термоаналитические исследования позволяют различать субстанцию исходной модификации диоксидина и полученную из нее новую кристаллическую модификацию.
Для криомодифицированного диоксидина методом ПЭМ получены микрофотографии, ко -торые показали, что размер его частиц меняется в диапазоне 50-400 нм. На основании полученных микрофоторграфий был оценен средний размер частиц криомодифицированного диок-сидина, который составил 170 нм (рис. 2, а).
Микрофотография отдельных агрегатов крио-модифицированного образца представлена на рис. 2, б.
Данные по активности разных модификаций диоксидина по отношению к E. coli 52 и M. cyaneum 98, полученные диско-диффузионным методом с использованием прессованных таблеток, приведены на рис. 4.
Для штаммов бактерии E. coli 52 иM. cyaneum 98 диаметр ЗПР (рис. 4) вокруг таблеток криомодифицированного диоксидина оказался больше, чем диаметр ЗПР вокруг таблеток исходной
Рис. 4. Зона подавления роста M. cyaneum 98 и E. coli 52 вокруг таблеток исходного и криомодифицированного диоксидина через 16 (а) и 24 (б) часа
инкубации
модификации диоксидина как через 16, так и через 48 ч инкубации.
Таким образом, методом криохимического синтеза получена наноформа новой полиморфной модификации диоксидина. Диско-диффузионным
методом показано, что криомодифицированный препарат оказался более активным к процессам подавления роста бактерий E. coli 52 и M. cyaneum 98 по сравнению с исходной фармакопейной модификацией.
Работа выполнена при поддержке Российского фонда научных иследований
(проект № 16-13-10365)
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Костюченко А.Л. Эфферентная терапия. СПб., 2000.432 с.
2. Raw A.S., Furness M.S., Gill D.S, Adams R.C., Hol-combe F.O., Lawrence Jr., Yu L.X. // Adv. Drug Deliver. Rev. 2004. Vol. 56. N 3. P. 397.
3. Blagden N., de Matas M., Gavan P.T., York P. // Adv. Drug Deliver. Rev. 2007. Vol. 59. N 7. P. 617.
4. Henwood S.Q., Liebenberg W., Tiedt L.R..// Drug Develop. Ind. Pharm. 2001. Vol. 27. N 10. P. 1017.
5. Braun D.E., Gelbrich T., Kahlenberg V., Tessadri R., Wieser J., Griesser U.J. II J. Pharm. Sciences. 2009. Vol. 98. N 6. P. 2010.
6. Schmidt A.C., Senfter N., Griesser U.J. II J. Therm. Anal. Cal. 2003. Vol. 73. P. 397.
7. Velaga S.P., Berger R., Carlfors J.II Pharm. Res. 2002. Vol. 19. N 10. P. 1564.
8. Pasquali I., Bettini R., Giordano F.II Adv. Drug Deliv. Rev. 2008. Vol. 60. N 3. P. 399.
9. Сергеев Б.М., Михалев С.П., Морозов Ю.Н.// Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2010. T. 51. № 6. P. 440.
10. Падейская Е.Н.// Инфекции и антимикробная терапия. 2001. № 5. Р. 150.
11. Глушков Р.Г., Дронова Л.Н., Елина А.С. // Хим.-фарм. журн. 1990. Т. 24. № 1. Р. 33.
12. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания. Под. ред. Г.Г. Онищенко. М., 2004.
Поступила в редакцию 15.07.16
CRYOCHEMICAL MODIFICATION OF DIOXIDINE ULTRAFINE POWDER AND ITS ANTIBACTERIAL ACTIVITY DETERMINATION
O.I. Vernaya*, V.P. Shabatin, A.M. Semenov, T.I. Shabatina
(Division of Chemical Kinetics; *e-mail: olga_vernaya@mail.ru)
The bioavailability and effectiveness of medicines highly depend on their crystal structure and size. Previously unknown nanosized modification of 2,3-bis(hydroxymethyl) chynoxaline-N,N'-dioxide (dioxidine) was obtained by means of cryochemical modification and carefully studied by different methods of chemical analysis: gas chromatography, NMR, x-ray diffraction, thermoanalytical methods (TG, DTG, DSC), TAM and the method of low-temperature adsorption of argon. This new modification showed higher activity against gram-positive S. aureus 144, 9 B. cereus, M. cyaneum 98 and gram-negative E. coli 52 bacterial strains.
Key words: nanoparticles, dioxidine, cryochemical modification.
Сведения об авторах: Верная Ольга Ивановна - науч. сотр. кафедры химической кинетики химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, канд. хим. наук (olga_vernaya@mail.ru); Шабатин Владимир Петрович - ст. науч. сотр. кафедры химической кинетики химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, канд. хим. наук (vovapsh@rambler.ru); Семенов Александр Михайлович - вед. науч. сотр. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, докт. биол. наук (amsemenov@list.ru); Шабатина Татьяна Игоревна - зав. лабораторией химии низких температур, вед. науч. сотр. кафедры химической кинетики химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, доцент, докт. хим. наук (tatya-nashabatina@yandex.ru).
